Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung einer Positioniervorrichtung für die intranasale Abgabe von Biomolekülen an das Maus-ZNS. Die Verwendung dieses Geräts reduziert den Umgang mit Mäusen und die Behandlungszeit erheblich, was zu einer verbesserten Effizienz und Reproduzierbarkeit der Technik führt. Um dieses Verfahren zu beginnen, bewerten Sie den Anästhesiespiegel der Mäuse durch Pedalreflex, um die chirurgische Ebene zu erhalten.
Als nächstes stellen Sie die Positioniervorrichtung in einem angemessenen Abstand und einer angemessenen Höhe, um einen bequemen Zugriff auf alle erforderlichen Reagenzien zu ermöglichen. Dann tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf. Ziehen Sie eine Maus mit Stuhlgurten, stellen Sie sicher, dass die Vorderbeine der Maus natürliche Unterstützung bieten, während sie sich in einer entspannten Position ohne Beschwerden befindet.
Wiederholen Sie die Prozeduren für die verbleibenden Mäuse. Legen Sie vorsichtig jede Maus auf den dafür vorgesehenen Stuhl, indem Sie ihren Rücken parallel zur Rückenstütze des Stuhls und bei 90 Grad auf den Stuhlsitz legen. Lassen Sie das Tier natürlich in der Kopf- und Vorwärtsposition liegen, ohne zu drücken oder zu drücken.
Sobald alle Mäuse angeschnallt sind, beginnen Sie sofort mit der intranasalen Impfung. Um die intranasale Lieferung durchzuführen, laden Sie die Mikropipette mit zwei Mikrolitern der RVG9R siRNA-Komplexlösung. Halten Sie die Pipette in der dominanten Hand und unterstützen Sie sie mit der anderen Hand, um unkontrollierte Bewegungen zu vermeiden, während Sie siRNA verabreichen.
Legen Sie etwa ein zwei Mikroliter Tröpfchen ganz in der Nähe eines Nasenlochs, so dass die Maus es direkt einatmen kann. Wenn ein winziger Tropfen nicht leicht gebildet werden kann, ersetzen Sie die Pipettenspitze durch eine neue und wiederholen Sie den Vorgang. Drücken Sie den Mauskopf vorsichtig mit dem Zeigefinger für fünf Sekunden nach unten, während er einatmet und die Position aufrechterhält.
Um eine Drainage des Medikaments in die Lunge zu verhindern, ist es wichtig, den Mauskopf mit dem Zeigefinger fünf Sekunden lang ruhig nach unten zu drücken, während die Maus einatmet. Starten Sie eine Stoppuhr, um drei bis vier Minuten nach dieser Zeit Impfung in den zweiten Nare der ersten Maus zu takten. Dieses Zeitintervall ist notwendig, damit die Maus die erste Dosis einatmet und die normale Atmung wiederherstellt.
Im Drei- bis Vier-Minuten-Intervall zwischen der Impfung von alternativen Nares auf der ersten Maus, vollständige intranasale Impfung von einem Nare in jeder der verbleibenden drei Mäuse auf dem Gerät platziert. Wenn die Stoppuhr ertönt, impfen Sie das zweite Nasenloch auf der ersten Maus und wiederholen Sie den Vorgang für die anderen Mäuse wie oben. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die 20 bis 30 Mikroliter für alle vier Mäuse geliefert werden.
Es dauert etwa 30 bis 45 Minuten, um den gesamten Impfvorgang abzuschließen. Bringen Sie die Tiere in ihre vorgesehenen Käfige zurück. Lassen Sie die Mäuse nicht unbeaufsichtigt, bis sie genügend Bewusstsein wiedererlangt haben, um die Brustbesinnung aufrechtzuerhalten.
Um die Gen-Silencing zu bewerten, extrahieren Sie RNA aus verschiedenen Hirnregionen mit einem RNA-Reinigungskit, kehren die Transkription in cDNA mit einem cDNA-Synthesekit um und führen qPCR mit Primer-Paaren durch. Die meisten Gehirn-Lieferung des RVG9R Peptid mit Alexa Fluor 488 markiert wurde zuerst mit dem Maus-Positionierungsgerät hier beschrieben getestet. Nach 48 Stunden nach der Impfung wurden verschiedene Organe zur Messung der A488-Fluoreszenz ausgeschnitten.
In keinem der Organe wurde in den negativen Kontrollen festgestellt. Andererseits wurde ein starkes fluoreszierendes A488-Signal ausschließlich in den Gehirnen der rVG9R-geimpften Gruppe nachgewiesen. Darüber hinaus wurde die Position der Mausplatzierung mit der Supine-Position-Methode und der Wachmethode für die Wirksamkeit verglichen.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Positionierung der Mäuse Kopf nach unten und nach vorne verbesserte die Penetranz und Ablagerung von RVG9R A488 im gesamten Gehirngewebe. Um die SiRNA-Bereitstellung an das Gehirn weiter zu bestätigen, wurde nach einer einzigen intranasalen Verabreichung von RVG9R, die auf Cy5 mit siRNA bezeichnet wurde, eine vollständige Hirnscannierung durchgeführt. Im Gegensatz zu PBS oder RVM9R führte die Komplexierung mit RVG9R zu einer starken Ansammlung von siRNA in wichtigen Hirnregionen wie der Riechbirne, dem Kortex, dem Hippocampus, dem Thalamus, dem Hypothalamus, dem Mittleren Hirn und dem Kleinhirn.
Das Positioniergerät kann für die Abgabe von Medikamenten oder Molekülen an das Maus-ZNS verwendet werden. Die Anwendungen erstrecken sich auf die Prüfung von Therapeutika sowie die Untersuchung zellulärer Mechanismen im ZNS. Dieses Positionierungsgerät wurde von den Forschern verwendet, um die Wirksamkeit von siRNAs bei der Behandlung der West-Nil-Virus-Krankheit zu demonstrieren und Therapien für andere ZNS-Erkrankungen zu erforschen.
