이 프로토콜은 마우스 CNS에 생체 분자의 비강 내 전달을 위한 위치 지정 장치의 사용을 자세히 설명합니다. 이 장치의 사용은 마우스의 취급과 치료 시간을 크게 감소시켜 기술의 효율성과 재현성을 향상시킵니다. 이 절차를 시작하려면 수술 평면을 유지하기 위해 페달 반사에 의해 마우스의 마취 수준을 평가합니다.
다음으로 위치 지정 장치를 적절한 거리와 높이에 배치하여 필요한 모든 시약에 편리하게 액세스할 수 있도록 합니다. 그런 다음 동물의 눈에 연고를 바하십시오. 의자 벨트로 마우스 한 개를 묶어 마우스의 앞다리가 불편함 없이 편안한 자세를 취하면서 자연스러운 지지를 제공하도록 합니다.
나머지 마우스에 대한 절차를 반복합니다. 각 마우스를 의자의 등 받침지지에 평행하게 놓고 90도의 의자에 앉습니다. 동물이 밀거나 누르지 않고 머리 아래로 앞으로 위치에 자연스럽게 누워 보자.
모든 마우스가 묶여 나면 즉시 비강 내 예방 접종을 시작합니다. 비강 내 전달을 수행하려면 RVG9R siRNA 복합 용액의 두 마이크로 리터로 마이크로 파이프를 로드합니다. 지배적 인 손에 파이펫을 잡고 siRNA를 투여하는 동안 제어되지 않는 움직임을 피하기 위해 다른 손으로 지원합니다.
마우스가 직접 흡입할 수 있도록 두 개의 마이크로리터 액적을 한 콧구멍에 매우 가깝게 놓습니다. 작은 낙하가 쉽게 형성되지 않으면 파이펫 팁을 새 것으로 바꾸고 작업을 반복합니다. 마우스머리를 집게 손가락으로 5초 동안 부드럽게 밀어 내고 위치를 유지합니다.
폐내 약물의 배수를 방지하기 위해 마우스가 흡입하는 동안 5 초 동안 검지 손가락으로 마우스 머리를 진정하게 밀어 넣는 것이 중요합니다. 스톱워치를 시작하여 3~4분 후에 첫 번째 마우스의 두 번째 나레에 접종을 합니다. 이 시간 간격은 마우스가 첫 번째 용량의 흡입을 완료하고 정상적인 호흡을 복원하는 데 필요합니다.
첫 번째 마우스에 대체 나레스의 접종 사이의 3 ~ 4 분 간격에서, 장치에 배치 된 나머지 3 마리의 마우스 각각에 하나의 나레의 완전한 비강 접종. 스톱워치가 울리면 첫 번째 마우스에 두 번째 콧구멍을 접종하고 위와 같이 다른 마우스에 대한 절차를 반복합니다. 20~30마이크로리터가 4개의 마우스모두에 전달될 때까지 절차를 반복한다.
전체 접종 절차를 완료하는 데 약 30~45분이 소요됩니다. 동물을 지정된 케이지로 돌려놓습니다. 그들은 흉골 수직을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 방치 마우스를 떠나지 마십시오.
유전자 침묵을 평가하기 위하여는, RNA 정화 키트를 가진 각종 두뇌 지구에서 RNA를 추출하고, cDNA 합성 키트를 사용하여 cDNA로 전사를 역으로, 프라이머 쌍으로 qPCR을 능력을 발휘합니다. 알렉사 플루서(488)로 표지된 RVG9R 펩타이드의 대부분의 뇌 전달은 여기에 기재된 마우스 포지셔닝 장치를 사용하여 처음 테스트되었다. 접종 후 48 시간에서, 다양한 장기는 A488 형광을 측정하기 위해 절제되었다.
부정적인 통제의 어떤 기관에서도 아무것도 발견되지 않았습니다. 한편, RVG9R 접종군의 뇌에서만 강한 형광 A488 신호가 검출되었다. 또한, 마우스 배치 위치는 효능에 대한 supine 위치 방법 및 깨어 있는 방법에 비해 하였다.
결과는 마우스를 머리를 아래로 그리고 앞으로 배치하는 것은 두뇌 조직을 통해 RVG9R A488의 침투 및 증착을 향상했다는 것을 표시했습니다. 뇌에 대한 siRNA 전달을 추가로 확인하기 위해, 전체 뇌 스캐닝은 Cy5 라벨siRNA로 복잡한 RVG9R의 단일 내비강 투여 후 수행되었다. PBS 또는 RVM9R과 는 대조적으로, RVG9R로 복합화하는 것은 후각 전구, 피질, 해마, 해마, 시상 하부, 중간 두뇌 및 소뇌를 포함하여 주요 두뇌 지구에 있는 siRNA의 강한 축적 귀착되었습니다.
위치 지정 장치는 마우스 CNS에 약물 또는 분자의 전달에 사용될 수 있다. 응용 프로그램은 치료뿐만 아니라 CNS에서 세포 메커니즘을 검사하는 것으로 확장됩니다. 이 포지셔닝 장치는 웨스트 나일 바이러스 질병 치료에 siRNAs의 효능을 입증하고 다른 CNS 질병에 대한 치료법을 탐구하기 위해 조사관에 의해 사용되었습니다.
