Denne protokollen beskriver bruken av en posisjoneringsenhet for intranasal levering av biomolekyler til musen CNS. Bruken av denne enheten reduserer håndteringen av mus og behandlingstid betydelig, noe som resulterer i forbedret effektivitet og reproduserbarhet av teknikken. For å begynne denne prosedyren, vurder anestesinivået til musene ved pedalrefleks for å opprettholde det kirurgiske planet.
Plasser deretter posisjoneringsenheten på en passende avstand og høyde for å gi praktisk tilgang til alle nødvendige reagenser. Deretter påfør salve på dyrets øyne. Spenn en mus med stolbelter, og sørg for at musens forben gir naturlig støtte mens den er i en avslappet posisjon uten ubehag.
Gjenta prosedyrene for de resterende musene. Plasser forsiktig hver mus på den angitte stolen ved å legge ryggen parallelt med ryggen støtte av stolen og ved 90 grader til stolsetet. La dyret ligge naturlig i hodet ned og fremover posisjon uten å skyve eller trykke.
Når alle musene er festet, start umiddelbart intranasal inokulasjon. For å utføre intranasal levering, last mikropipetten med to mikroliter rvg9R siRNA kompleks løsning. Hold pipetten i den dominerende hånden og støtt den med den andre hånden for å unngå ukontrollerte bevegelser mens du administrerer siRNA.
Plasser omtrent en to mikroliterdråpe svært nær ett nesebor, slik at musen kan inhalere den direkte. Hvis en liten dråpe ikke er lett å danne, bytt ut pipettespissen med en ny og gjenta operasjonen. Skyv forsiktig musehodet ned med pekefingeren i fem sekunder mens den inhalerer og opprettholder posisjonen.
For å forhindre drenering av stoffet i lungene er det viktig å skyve musehodet ned med pekefingeren i fem sekunder mens musen inhalerer. Start en stoppeklokke for å klokke tre til fire minutter etter dette til tid inokulasjon i den andre nare av den første musen. Dette tidsintervallet er nødvendig for at musen skal fullføre innånding av den første dosen og gjenopprette normal pusting.
I tre til fire minutters intervall mellom inokulasjon av alternative nares på den første musen, komplett intranasal inokulasjon av en nare i hver av de resterende tre musene plassert på enheten. Når stoppeklokken høres, inokulerer det andre neseboret på den første musen og gjenta prosedyren for de andre musene som ovenfor. Gjenta prosedyren til 20 til 30 mikroliter leveres til alle fire musene.
Det vil ta ca 30 til 45 minutter å fullføre hele inokulasjonsprosedyren. Returner dyrene tilbake til sine utpekte bur. Ikke la musene stå uten tilsyn før de har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
For å vurdere genavaktivering, trekk ut RNA fra ulike hjerneregioner med et RNA-rensesett, omvendt transkripsjon til cDNA ved hjelp av et cDNA-syntesesett, og utfør qPCR med primerpar. De fleste hjernelevering av RVG9R peptid merket med Alexa Fluor 488 ble først testet ved hjelp av musen posisjonering enheten beskrevet her. Ved 48 timer etter inokulasjon ble ulike organer skåret ut for å måle A488 fluorescens.
Ingenting ble oppdaget i noen av organene i de negative kontrollene. På den annen side ble et sterkt fluorescerende A488-signal oppdaget utelukkende i hjernen til RVG9R-inokulert gruppe. I tillegg ble museplasseringsposisjonen sammenlignet med liggende posisjonsmetode og våken metode for effekt.
Resultatene indikerte at posisjonering av musene hodet ned og fremover forbedret penetrance og avsetning av RVG9R A488 gjennom hjernevevet. For ytterligere å bekrefte siRNA levering til hjernen, full hjerneskanning ble utført etter en enkelt intranasal administrasjon av RVG9R komplekst til Cy5 merket siRNA. I motsetning til PBS eller RVM9R resulterte kompleks med RVG9R i en sterk akkumulering av siRNA i store hjerneregioner, inkludert olfaktorisk pære, cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, mid-brain, og lillehjernen.
Posisjoneringsenheten kan brukes til levering av legemidler eller molekyler til musen CNS. Programmene strekker seg til testing av terapeutiske midler samt undersøke cellulære mekanismer i CNS. Denne posisjoneringsenheten har blitt brukt av forskerne for å demonstrere styrken til siRNAs i behandling av West Nile Virus sykdom, samt utforske terapi for andre CNS sykdommer.
