Detta protokoll detaljer användning av en positioneringsenhet för intranasal leverans av biomolekyler till musen CNS. Användningen av denna enhet minskar signifikant hantering av möss och tid för behandling vilket resulterar i förbättrad effektivitet och reproducerbarhet av tekniken. För att påbörja denna procedur, bedöma anestesinivån hos mössen genom pedalreflex för att upprätthålla operationsplanet.
Därefter placerar du positioneringsanordningen på ett lämpligt avstånd och höjd för att ge bekväm åtkomst till alla nödvändiga reagenser. Applicera sedan salva på djurets ögon. Rem en mus med stol bälten, se till att musens framben ger naturligt stöd medan den är i en avslappnad position utan obehag.
Upprepa procedurerna för de kvarvarande mössen. Placera varsamt varje mus på den avsedda stolen genom att lägga sin rygg parallellt med ryggen stöd av stolen och i 90 grader till stolen sätet. Låt djuret ligga naturligt i huvudet nedåt och framåt läge utan att trycka eller trycka.
När alla möss är fastspända, starta omedelbart intranasal inympning. För att utföra intranasal leverans, ladda mikropipettet med två mikroliter av RVG9R siRNA komplex lösning. Håll pipetten i den dominerande handen och stöd den med den andra handen för att undvika okontrollerade rörelser medan du administrerar siRNA.
Placera ungefär en två microliter droppe mycket nära en näsborre så att musen direkt kan andas in den. Om en liten droppe inte är lätt bildas, ersätta pipetteringspetsen med en ny och upprepa operationen. Tryck försiktigt ner mushuvudet med pekfingret i fem sekunder medan det andas in och behåll positionen.
För att förhindra dränering av läkemedel i lungorna är det viktigt att sederat trycka ner mushuvudet med pekfingret i fem sekunder medan musen andas in. Starta ett stoppur för att klocka tre till fyra minuter efter detta för att tid inokulering i den andra nare av den första musen. Detta tidsintervall är nödvändigt för musen att slutföra inandning av den första dosen och återställa normal andning.
I tre till fyra minuters intervall mellan inokulering av alternativa nares på den första musen, komplett intranasal inokulering av en nare i var och en av de återstående tre möss placeras på enheten. När stoppuret ljuder, inokulera den andra näsborren på den första musen och upprepa proceduren för de andra mössen enligt ovan. Upprepa proceduren tills de 20 till 30 mikroliter levereras för alla fyra möss.
Det kommer att ta cirka 30 till 45 minuter att slutföra hela inokulering förfarandet. Återför djuren tillbaka till sina utsedda burar. Lämna inte mössen utan uppsikt förrän de har återfått tillräckligt med medvetande för att upprätthålla sternal recumbency.
För att bedöma gentystning, extrahera RNA från olika hjärnregioner med en RNA-reningssats, omvänd transkription till cDNA med hjälp av en cDNA-syntessats och utföra qPCR med primerpar. De flesta hjärnan leverans av RVG9R peptid märkt med Alexa Fluor 488 testades först genom att använda musen positionering enhet som beskrivs här. Vid 48 timmar post inokulering, olika organ var strukits för att mäta A488 fluorescens.
Ingenting upptäcktes i något av organen i de negativa kontrollerna. Å andra sidan, en stark fluorescerande A488 signal upptäcktes uteslutande i hjärnan hos den RVG9R inokulerade gruppen. Dessutom jämfördes musplaceringspositionen med ryggpositionsmetoden och den vakna metoden för effekt.
Resultaten visade att positionering mössen huvudet ner och framåt förbättrat peneritance och nedfallet av RVG9R A488 i hela hjärnvävnaden. För att ytterligare bekräfta siRNA leverans till hjärnan, full hjärnan skanning utfördes efter en enda intranasal administration av RVG9R komplex till Cy5 märkt siRNA. I motsats till PBS eller RVM9R, komplex med RVG9R resulterade i en stark ansamling av siRNA i större hjärnan regioner inklusive luktbulben, cortex, hippocampus, thalamus, hypotalamus, mitten av hjärnan, och lillhjärnan.
Positioneringsapparaten kan användas för leverans av läkemedel eller molekyler till musen CNS. Tillämpningarna sträcker sig till testning av terapier samt undersöka cellulära mekanismer i CNS. Denna positioneringsenhet har använts av utredarna för att visa styrkan hos siRNAs vid behandling av West Nile Virus sjukdom, samt utforska terapier för andra CNS-sjukdomar.