Name: determining the egg fertilization rate of bemisia tabaci using a cytogenetic technique
Uploaded: 2019-04-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique at JoVE.com

Dit onderzoek werd gefinancierd door een subsidie van NSF (DEB-1020460) te M.S.H. en een USDA AFRI-grant (2010-03752) te M.S.H. De auteurs bedanken Brennan Zehr kleuring wittevlieg eieren met veel vaardigheid en Zen. De auteurs bedanken Mike Riehle voor het toestaan van het gebruik van zijn fluorescente microscoop voor imaging. De auteurs bedanken Suzanne Kelly en Marco Gebiola voor de beelden van het ei. De auteurs bedanken Suzanne Kelly en Jimmy Conway voor het helpen op beslissende momenten tijdens de experimenten.

Opmerking: Zorg ervoor dat alle werkzaamheden wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur in een goed geventileerde ruimte of in een zuurkast. Alle 'druppels' in dit protocol worden gedefinieerd als 5 – 20 µL, afhankelijk van de voorkeur van de exploitant.
1. eerste Setup
<ol><li>Toestaan dat vrouwelijke wittevlieg te oviposit op schone bladeren. Voorbeelden voor oviposition arenas zijn clip kooien of bladeren gesneden te passen op agar in een petrischaal. Maak een coverable ga...

<ol>
	<li>Charnov, E. L., May, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+ratio+in+spatially+structured+populations.">Sex ratio in spatially structured populations.</a> The Theory of Sex Allocation. , 67-92 (1982).</li><li>Godfray, H. C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , (1994).</li><li>Bourke, A. F. G., Franks, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Social Evolution in Ants. , (1995).</li><li>Pascal, S., Callejas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+interspecific+competition+between+biotypes+B+and+Q+of+Bemisia+tabaci+(Hemiptera:+Aleyrodidae)+from+Spain.">Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain.</a> Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).</li><li>Liu, S. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+mating+interactions+drive+widespread+invasion+and+displacement+in+a+whitefly.">Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly.</a> Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).</li><li>Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carri&#232;re, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+discrimination+in+invasive+whitefly+species.">Mate discrimination in invasive whitefly species.</a> Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).</li><li>Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carri&#232;re, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+mating+behaviour+drives+asymmetric+reproductive+interference+in+whiteflies.">Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies.</a> Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).</li><li>Tsueda, H., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+differences+between+Q+and+B+whiteflies,+Bemisia+tabaci,+on+three+host+plants+and+negative+interactions+in+mixed+cohorts.">Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).</li><li>Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+mating+behavioural+interactions+and+life+history+traits+in+the+competition+between+alien+and+indigenous+whiteflies.">Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies.</a> Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).</li><li>Sun, D. -. B., Li, J., Liu, Y. -. Q., Crowder, D. W., Liu, S. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reproductive+interference+on+the+competitive+displacement+between+two+invasive+whiteflies.">Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies.</a> Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).</li><li>Liu, S. -. S., Colvin, J., De Barro, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+concepts+as+applied+to+the+whitefly+Bemisia+tabaci+systematics:+how+many+species+are+there?.">Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there?.</a> Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).</li><li>Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+insect+supervectors+Bemisia+tabaci+and+Frankliniella+occidentalis+in+the+emergence+and+global+spread+of+plant+viruses.">Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses.</a> Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).</li><li>Giorgini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+symbionts+cause+parthenogenetic+reproduction+in+the+parasitoid+wasp+Pingala+soemius+(Hymenoptera:+Eulophidae).">Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae).</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).</li><li>Himler, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+a+bacterial+symbiont+in+an+invasive+whitefly+is+driven+by+fitness+benefits+and+female+bias.">Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias.</a> Science. 332 (6026), 254-256 (2011).</li><li>Cass, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+endosymbiont+Rickettsia+in+an+insect+pest.">Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest.</a> Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).</li><li>Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+mechanism+and+genetic+consequences+of+thelytoky+in+the+wasp+Trichogramma+cacoeciae.">Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae.</a> Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).</li><li>Cass, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+fitness+benefits+of+the+Rickettsia+bacterial+symbiont+in+an+insect+pest.">Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest.</a> Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).</li><li>Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+nuclear+genotype+influences+phenotype+of+a+conditional+mutualist+symbiont.">Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont.</a> Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).</li><li>Gottlieb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+intracellular+ecosystem:+symbiotic+bacteria+share+bacteriocytes+in+whiteflies.">Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies.</a> FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).</li><li>Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+inheritance+of+a+single+somatic+animal+cell+displayed+by+the+bacteriocyte+in+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci.</a> Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).</li><li>Guo, J. -. Y., Cong, L., Wan, F. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+generation+effects+of+high+temperature+on+the+development+and+fecundity+of+Bemisia+tabaci+(Gennadius)+(Hemiptera:+Aleyrodidae)+biotype+B.">Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B.</a> Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).</li><li>Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+heat+shock+on+survival+and+reproduction+of+two+whitefly+species,+Trialeurodes+vaporariorum+and+Bemisia+tabaci+biotype+B.">Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B.</a> Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).</li><li>Boykin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bemisia+tabaci+nomenclature:+Lessons+learned.">Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned.</a> Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).</li><li>Qin, L., Pan, L. -. L., Liu, S. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+insight+into+reproductive+incompatibility+between+putative+cryptic+species+of+the+Bemisia+tabaci+whitefly+complex.">Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex.</a> Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).</li></ol>

Dit protocol is de eerste om de bevruchting tarief of primaire sex ratio van B. tabacite leggen. De uitdaging van dit protocol is dat er onderzoekers om te leren hoe te te behandelen de wittevlieg eieren snel, ervoor te zorgen dat niet meer dan 1 uur verstreken is sinds de eieren waren oviposited totdat ze zijn vastgesteld. Tijdens voorbereidende experimenten waren de eieren die waren vastgesteld op 3 uur of meer postoviposition te oud om te observeren van bevruchting, als syngamy had plaatsgevonden en mitotisch...

De studie van geslacht verdeling, of de relatieve investering in mannelijke en vrouwelijke nakomelingen, is een hoeksteen van gedragsecologie1,2,3. Naast de macht voor het testen van adaptieve modellen van gedrag, kan te weten de seks toewijzing strategie van een organisme modellen voor de populatiedynamica verbeteren. In vele soorten, wordt seks toewijzing gecontroleerd door moeders. Ter vaststelling van geslacht toewijzing, is het belangrijk om te bepalen van de primaire sex-ratio of het aandeel van vrouwen op het moment van de ei-afzetting. Hoewel de sex ratio op volwassen opkomst aanknopingspunten seks toewijzing bieden kan, kan differentiële developmental sterfte tussen mannelijke en vrouwelijke exemplaren het volwassen sex-ratio aanzienlijk en algemeen scheeftrekken. In sommige soorten Hymenoptera (Vliesvleugeligen), de volgorde van insecten, mieren, bijen en wespen, met is de primaire sex-ratio vastgesteld met cytogenetische tests, kleuring van de embryo's om weer te geven van de genetische DNA. Omdat hymenopterans haplodiploid, een beginnende mannelijke ei is haploïde en bevat alleen de vrouwelijke pronucleus (n), terwijl beginnende vrouwelijke eieren diploïde zijn en zowel mannelijke als vrouwelijke pronuclei (2n bevatten). Hoewel Aleyrodidae, de sap-voeding-familie van true bugs (Hemiptera) bekend als wittevlieg, ook haplodiploid, is er geen een gevestigde assay te vinden van de primaire sex-ratio in deze insecten. Dit is misschien verwonderlijk gezien de intensiteit van de studie van de paar kosmopolitische ernstige plagen uit deze familie en het belang van de sex ratio's in concurrerende interacties van wittevlieg4,5,6,7 ,8,9,10 en in de populatiedynamiek in het algemeen. In haplodiploid insecten ook zijn sex ratio's onbeperkt door geslacht bepaling systemen, waardoor de mogelijkheid van selectieve bevruchting en onstabiele sex-ratio's die met de milieu-2 variëren. Hier presenteren we een techniek om te bepalen van de primaire sex-ratio van het complex van de soorten van wittevlieg gezamenlijk bekend als de sweetpotato wittevlieg, B. tabaci. Deze naam voor één soort omvat meer dan 28 soorten wereldwijd11en omvat enkele van de meest schadelijke global invasieve ongedierte12,13. De toepassing van deze techniek om seks patronen van geheugentoewijzingen die in B. tabaci en andere Aleyrodidae toestaat een strenger onderzoek van variabelen, met inbegrip van temperatuur, waardplant, endosymbiotic bacteriën of plant/wittevlieg ziekteverwekkers, die invloed op de wittevlieg primaire sex ratio's en de populatiedynamiek van de wittevlieg hebben kunnen.
Wij zijn niet op de hoogte van eventuele vergelijkbare ei-kleuring technieken voor B. tabaci. Het protocol is handig in vergelijking met verkleurende methoden die worden gebruikt voor andere insecten eieren14 omdat het nalaat een overnachting fixatie stap en, dus, kan worden voltooid binnen de 3 uur. Als een voorbeeld van een toepassing, een endosymbiotic bacterie Rickettsia sp. nr. bellii, wordt geassocieerd met vrouwelijke bias in ons laboratorium lijnen B. tabaci Midden-Oosten en Azië kleine 1 (MEAM1)15,16. In één B. tabaci MEAM1 laboratorium regel ("MAC1," verzameld vanuit het midden van de landbouw Maricopa), testen we of Rickettsia-besmette (R+) vrouwen bevruchten meer eieren dan niet-geïnfecteerde (R-) vrouwtjes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1XPBS</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1XTBST</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>5X solution made from 30g Tris, 43.8g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0g NaN3 pH7.5, and brought to 1L with PCR grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td>Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI dilactate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc300415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Dilute to 70% EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10X magnification can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>UN2789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Wild</td>
			<td></td>
			<td>A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide covers</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Methods are for 18mm x 18mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minuten nadel pins</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>1208SA</td>
			<td>Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-propyl-gallate</td>
			<td>Sigma/Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>P3130/sc-250794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small dropper bulb</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Must fit on Pasteur pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the egg fertilization rate of bemisia tabaci using a cytogenetic technique

Een paar soorten sap-zuigende wittevlieg zijn enkele van de meest schadelijke terrestrische plagen wereldwijd vanwege de gewas-schade die ze toebrengen en plantenvirussen die ze vector. Ondanks talrijke studies van de biologie van deze soorten in verschillende omgevingen, een belangrijke levensgeschiedenis parameter, offspring sex ratio's, weinig aandacht heeft gekregen, maar is belangrijk voor het voorspellen van de populatiedynamiek. De primaire verhouding van de sex (sex ratio op oviposition) van Bemisia tabaci is nooit gemeld maar kan worden gevonden door de bepaling van het tarief van de bevruchting ei van dit insect van de haplodiploid. De techniek gaat de dechorionation van de eieren met bleekmiddel, een reeks fixatie stappen en de toepassing van de algemene DNA fluorescerende vlek, DAPI (4 ': 6-diamidino-2-phenylindole, een DNA-bindende fluorescente kleurstof), te binden aan mannelijke en vrouwelijke pronuclei. Hier presenteren we de techniek, en een voorbeeld van de toepassing ervan, om te testen of een endosymbiotic bacterie Rickettsia sp. nr. bellii, beïnvloed de primaire sex-ratio van B. tabaci. Deze methode kan helpen bij bevolkingsonderzoeken van wittevlieg, of vast te stellen of geslacht toewijzing bestaat met bepaalde milieu prikkels.

Om te testen of Rickettsia is van invloed op het tarief van de bevruchting van B. tabaci MEAM1 vrouwtjes, die wij gefokt Rickettsia-besmet (R+) of niet-geïnfecteerde (R-) B. tabaci op cowpea planten (Vigna unguiculata) in aparte kooien op een 16 h licht/8 h donkere fotoperiode, 27 ° C en 70% relatieve vochtigheid. R+ werden R- vierde instar wittevlieg zorgvuldig verwijderd uit bladeren en geïsoleer...

Watch this Scientific Journal Video about Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique at JoVE.com

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Wij presenteren een eenvoudige cytogenetische techniek met behulp van 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) om te bepalen van het tarief van de bevruchting en primaire sex-ratio van de haplodiploid invasieve plaag Bemisia tabaci.

Bepaling van het tarief van de bevruchting ei van Bemisia tabaci met behulp van een cytogenetische techniek

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

Het protocol dat Liz ontwikkelde stelt ons in staat om de bevruchtingsgraad van wittevliegen te bepalen. Het toepassen van deze techniek zal ons begrip van het gedrag en de ecologie van wittevliegen verbeteren. Witte vliegen zijn haplodiploïde, dus de bevruchting is gelijk aan de geslachtsverhouding bij ovipositie.Dit protocol is de eerste beschreven voor wittevliegen, voor zover wij weten, en kan worden voltooid binnen drie uur. Om te beginnen, maak een afdekbaar gat in de petrischaal deksel in te voegen en om de volwassen wittevliegen te verwijderen. Stel een vochtigheidskamer in en mode een sonde door het invoegen van een dunne pin onder een comfortabele werkhoek in een gesmolten pipet tip om een dunne sonde te maken.Optioneel, langwerpige glazen pipet tips met warmte voor een gemakkelijkere behandeling van wittevlieg eieren. Laat vrouwelijke wittevliegen vervolgens oviposit op een schoon blad, gesneden om te passen op agar in een petrischaaltje. Tijdens de wittevlieg ovipositie, reinig een microscoop schuif met zeep en water.Droog het goed en strek een stuk paraffine film over een uiteinde om vloeistoffen te vormen druppels en eieren gemakkelijker te zien. Om eieren te dechorioneren, gebruik een glas Pasteur pipet om druppels van 83% natrium hypochloriet bleekmiddel oplossing toe te voegen aan de paraffine film vlak voor volwassen verwijdering en ei-collectie. Bleekmiddel en glaciale azijnzuur zijn beide corrosief.Ze moeten worden behandeld met handschoenen in een capuchon of goed geventileerde ruimte. DAPI is ook een irriterend en moet worden behandeld met handschoenen. Verwijder vervolgens de volwassen wittevliegen van het blad en leg het blad onder een microscoop.Til elk ei voorzichtig van de basis tot de pedicel uit het blad wordt verwijderd. Oefen op veel eieren voordat u dit protocol uitvoert. Til de eieren langzaam van de basis en volledig til het uit het blad als je eenmaal zien dat het ei pedicel wordt verwijderd uit het blad.Breng twee tot drie eieren aan elke druppel bleekmiddel en laat ze gedurende 10 minuten. Om de eieren te repareren, gebruik een glazen pipet om het bleekmiddel te verwijderen. Voeg vervolgens druppels glaciale azijnzuur toe en wacht drie minuten.Verwijder vervolgens het glaciale azijnzuur en voeg druppels clarke's oplossing toe. Wacht vervolgens 10 minuten tot het grootste deel van de oplossing is verdampt. Voeg druppels van 70% ethanol toe en wacht 10 minuten opnieuw.Om de eieren te bevlekken, verwijder eerst eventuele resterende ethanol. Voeg vervolgens druppels van 1xPBS toe aan de eieren om de pH bijna zeven te krijgen. Zet de microscoop dia in een vochtigheidskamer om uitdroging te voorkomen.Verwijder na 30 minuten de 1xPBS en voeg druppels van 1 microgram per milliliter DAPI toe. Plaats de microscoop dia in een donkere vochtigheid kamer en wacht ten minste 15 minuten. Verwijder eerst de DAPI-oplossing om eieren te wassen.Voeg vervolgens druppels van 1xTBST toe aan de eieren. Verwijder na vijf minuten de 1xTBST. Herhaal deze wasbeurt nog twee keer voor een totaal van drie wasbeurten.Na de laatste wasbeurt, voorzichtig pipette alle eieren van de parafilm op een schoon deel van de microscoop schuif. Verwijder overtollige TBST en voeg 20 microliter van montagemedia toe. Tot slot, plaats een schone cover dia op de top van de eieren, verzegelen de cover dia met duidelijke nagellak voor langdurige opslag, en ga naar beeldvorming met behulp van een fluorescerende microscoop.Eidechorionatie gevolgd door DAPI nucleaire kleuring toegestaan de toewijzing van bevruchting en embryo seks wanneer waargenomen met een fluorescerende microscoop. De vrouwelijke pronucleus is in de buurt van het centrum van zowel de bevruchte vrouwelijke eicel en onbevruchte mannelijke ei, en het sperma is zichtbaar als een heldere streep in de buurt van de top van het vrouwelijk ei alleen. Een toepassing van deze techniek is om te bepalen of bacteriële endosymbionts invloed hebben op de primaire geslachtsverhoudingen van wittevliegen.Bijvoorbeeld, de primaire geslachtsverhoudingen van eieren gelegd door Rickettsia-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde B.tabici wittevliegen toonde geen significant verschil tussen de geslachtsverhouding in de twee behandelingen. Zoals voor eieren gefokt tot volwassenheid, soortgelijke resultaten werden gezien voor Rickettsia-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde volwassenen, het verstrekken van geen bewijs, althans in deze studie, voor een grotere bevruchting tarieven door Rickettsia geïnfecteerde vrouwtjes. Door dit protocol te gebruiken, kan men bepalen of interspecifiek sperma eieren kan bevruchten.Als er geen bevruchting wordt waargenomen, kan men een back-up en kijk om te zien of sperma wordt overgedragen tijdens de paring door te kijken in de spermatheca van het vrouwtje. Als de bevruchting optreedt, zou men de geslachtsverhouding van volwassenen kunnen vergelijken met de bevruchtingsgraad om de levensvatbaarheid van hybride nakomelingenontwikkeling te bepalen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Procedure voor Adaptive Laboratorium Evolutie van micro-organismen met behulp van een Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: Een High Throughput Sequencing gebaseerde techniek voor het identificeren van laat repliceren regio's van het genoom

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Bepalen van genoom-brede Transcript verval tarieven in delende en zwakke menselijke fibroblasten

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Een snel zilver kleuring Protocol inschakelen eenvoudig en efficiënte detectie van SSR markeringen met behulp van een niet-denaturering Polyacrylamide-Gel

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Determining the Likelihood of Variant Pathogenicity Using Amino Acid-level Signal-to-Noise Analysis of Genetic Variation

Bepaling van de waarschijnlijkheid van Variant pathogeniteit met behulp van aminozuur-niveau Signal-to-Noise analyse van genetische variatie

Advancements in the cost and speed of next generation genetic sequencing have generated an explosion of clinical whole exome and whole genome testing. ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Met behulp van In Vitro en In cel vorm te onderzoeken klein molecuul veroorzaakte structurele veranderingen van de Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo toepassing van het systeem van de afstandsbediening voor de manipulatie van de endogene genexpressie

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...