Name: assessment and characterization of hyaloid vessels in mice
Uploaded: 2019-05-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice Video at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud (R01 EY024963 og EY028100) til J.C. Z.W. blev støttet af en Knights Templar Eye Foundation karriere starter Grant. Den hyaloide isolations procedure, der er beskrevet i dette studie, blev tilpasset med ændringer fra protokoller, der er generøst delt af DRs. Richard lang, Toshihide Kurihara og Lois Smith, som forfatterne er taknemmelige for.

Alle dyr blev behandlet i overensstemmelse med Association for forskning i vision og oftalmologi (ARVO) erklæring om anvendelse af dyr i oftalmisk og vision forskning for dyreforsøg, efterretnings linjerne for de nationale institutter for sundhed ( NIH) med hensyn til pasning og anvendelse af dyr til eksperimentelle procedurer og de regler, der er fastsat af den institutionelle dyrepleje og anvendelse Komité (IACUC) på Boston children's Hospital. Lrp5-/- mus (lager nr. 005823; Jackson Laboratory)...

<ol>
	<li>Lutty, G. A., McLeod, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+hyaloid,+choroidal+and+retinal+vasculatures+in+the+fetal+human+eye.">Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).</li><li>Anand-Apte, B., Hollyfield, J., Besharse, J., Bok, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+anatomy+of+the+retinal+and+choroidal+vasculature.">Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature.</a> The Retina and its Disorders. , (2011).</li><li>Hobbs, R. P., Hartnett, M. E., Hartnett, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2:+The+hyaloidal+vasculature+and+its+role+in+development.">Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development.</a> Pediatric Retina: Second Edition. , (2013).</li><li>Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+retinal+vasculature.">Development of the retinal vasculature.</a> Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).</li><li>Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+pathology+of+the+hyaloid,+choroidal+and+retinal+vasculature.">Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).</li><li>Ito, M., Yoshioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+the+hyaloid+vessels+and+pupillary+membrane+of+the+mouse.">Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse.</a> Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).</li><li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+retina+as+an+angiogenesis+model.">The mouse retina as an angiogenesis model.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).</li><li>Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ocular+angiogenesis:+from+development+to+pathologies.">Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies.</a> FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).</li><li>Shastry, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+hyperplastic+primary+vitreous:+congenital+malformation+of+the+eye.">Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).</li><li>Lobov, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNT7b+mediates+macrophage-induced+programmed+cell+death+in+patterning+of+the+vasculature.">WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature.</a> Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).</li><li>Kato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cbfa1-independent+decrease+in+osteoblast+proliferation,+osteopenia,+and+persistent+embryonic+eye+vascularization+in+mice+deficient+in+Lrp5,+a+Wnt+coreceptor.">Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).</li><li>Xia, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+familial+exudative+vitreoretinopathy+caused+by+LPR5+mutations.">A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations.</a> Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+development+in+the+retina+and+inner+ear:+control+by+Norrin+and+Frizzled-4,+a+high-affinity+ligand-receptor+pair.">Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair.</a> Cell. 116 (6), 883-895 (2004).</li><li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norrin,+frizzled-4,+and+Lrp5+signaling+in+endothelial+cells+controls+a+genetic+program+for+retinal+vascularization.">Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization.</a> Cell. 139 (2), 285-298 (2009).</li><li>Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norrie+gene+product+is+necessary+for+regression+of+hyaloid+vessels.">Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+expression+of+Wnt-pathway+mediated+genes+in+low-density+lipoprotein+receptor-related+protein+5+(Lrp5)+knockout+mice.">Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice.</a> PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).</li><li>Nayak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+vascular+regression+is+regulated+by+a+Wnt/beta-catenin,+MYC+and+CDKN1A+pathway+that+controls+cell+proliferation+and+cell+death.">Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death.</a> Development. 145 (12), (2018).</li><li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+pVHL+and+HIF-alpha+isoforms+are+required+for+embryonic-to-adult+vascular+transition+in+the+eye.">Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye.</a> The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).</li><li>Huang, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+HIF-1alpha+partially+rescues+the+abnormal+hyaloid+vascular+system+in+Cited2+conditional+knockout+mouse+eyes.">Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes.</a> Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).</li><li>Yoshikawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regression+of+hyaloid+vasculature+is+triggered+by+neurons.">Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).</li><li>Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+VEGF-A+in+lens+development:+formation+of+the+hyaloid+capillary+network+and+protection+against+transient+nuclear+cataracts.">The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts.</a> Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).</li><li>Hurskainen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+maturation+of+the+retinal+vasculature+in+type+XVIII+collagen/endostatin+deficient+mice+and+changes+in+retinal+glial+cells+due+to+lack+of+collagen+types+XV+and+XVIII.">Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII.</a> FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).</li><li>Fukai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+collagen+XVIII/endostatin+results+in+eye+abnormalities.">Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities.</a> The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).</li><li>McKeller, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arf+tumor+suppressor+gene+promotes+hyaloid+vascular+regression+during+mouse+eye+development.">The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).</li><li>Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2+plays+an+important+role+in+retinal+angiogenesis.">Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis.</a> Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).</li><li>Chang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficient+Bmp4+ocular+phenotypes+include+anterior+segment+dysgenesis+with+elevated+intraocular+pressure.">Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure.</a> BMC Genetics. 2, 18 (2001).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+Activation+of+Wnt+Signaling+by+Lithium+Normalizes+Retinal+Vasculature+in+a+Murine+Model+of+Familial+Exudative+Vitreoretinopathy.">Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy.</a> The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+Image-Guided+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization+Model+in+Mice.">Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).</li><li>Kishimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+characteristics+of+regressing+vessels+in+the+hyaloid+vascular+system+of+neonatal+mice:+Novel+implication+for+vascular+atrophy.">Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy.</a> Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).</li><li>Lang, R. A., Bishop, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+cell+death+and+tissue+remodeling+in+the+developing+mouse+eye.">Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye.</a> Cell. 74 (3), 453-462 (1993).</li><li>Riazifar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterization+of+Bst+/-+mouse+retina.">Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).</li></ol>

Teknikker til at vurdere og karakterisere hyaloide fartøjer er intuitive og nødvendige procedurer for at observere hyaloid fartøjets regression i dyremodeller, for at tillade undersøgelser af de mekanismer, der underliggende den vaskulære regression under udvikling. Mens den in vivo retinale billeddannelse tillader langsgående observation af hyaloideregression i det samme dyr, kan adgang til et gnaver fundus Imaging system for OCT og FFA være en begrænsende faktor. Desuden er in vivo billeddannelse i levende mus ...

Blodforsyningen i øjet er afgørende for at sikre den normale udvikling af nethinden og omgivende okulære væv og for at udstyre en ordentlig visuel funktion. Der er tre vaskulære senge i øjet: retinal vasculature, choroid, og en forbigående embryonale kredsløbssygdomme netværk af hyaloide fartøjer. Udviklingen af den okulære vaskulatur kræver rumlig og tidsmæssig koordination i hele embryogenese og vævs modning. Blandt de tre vaskulære senge, hyaloid Vaskulaturen er den første funktionelle blodforsyning system til at give næring og ilt til den nyligt dannede embryonale linse og den udviklende nethinden. Hyaloid fartøjer tilbagegang på samme tid, at nethinden vasculatures udvikle og modne1. Regression af hyaloid Vaskulaturen er afgørende for at give en klar visuel vej for udviklingen af visuel funktion; Derfor er denne vaskulære regressions proces så vigtig som væksten af retinale vasculature. Nedsat hyaloid regression kan føre til øjensygdomme. Desuden, regression af hyaloid fartøjer giver et model system til at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer involveret i reguleringen af vaskulær regression, som kan have konsekvenser for angiogen regulering i andre organer samt.
Hyaloidevaskulaturen, afledt af hyaloidearterie (ha), består af Vasa hyaloidea propria (VHP), tunica vasculosa lentis (TVL) og pupil membran (PM). Det giver næring til den udviklende nethinden, den primære vitreous, og linsen under fosterudvikling2. Som følge af HA, VHP grene anteriorly gennem glaslegemet til linsen. TVL bægre den bageste overflade af linsen kapsel, og anastomoser til PM, som forbinder til de forreste ciliære arterier, dækker den forreste overflade af linsen2,3, hvilket resulterer i dannelsen af et netværk af fartøjer i PM 3 , 4 , 5. interessant, der er ingen vener i hyaloid Vaskulaturen, og systemet gør brug af koroidal vener til at udføre venøs dræning.
I det menneskelige embryon er hyaloid Vaskulaturen næsten færdig på omtrent den niende uge af drænings perioden og begynder at genvinde, når de første retinale fartøjer vises, i løbet af den fjerde måned af drænings perioden2. Begyndende med atrofi af VHP, regression af kapillar netværk af TVL, PM, og endelig, ha opstår efterfølgende2,3. I mellemtiden begynder de primære glasfiber trækker og den sekundære glasfiber at danne, sammensat af de ekstracellulære matrixkomponenter, herunder kollagen fibre. Den sjette måned af drænings måneden, den primære glaslegemet er reduceret til en lille gennemsigtig kanal, der strækker sig fra synsnerven disken til linsen, kaldet Cloquet kanalen eller hyaloid kanalen, og den sekundære glaslegemet bliver den vigtigste komponent i det bageste segment 2 , 3. den hyaloide cirkulation forsvinder for det meste på 35 til 36 ugers dræelse, lige før fødslen3.
I modsætning til mennesker, i hvem hyaloid Vaskulaturen er helt svandt ved fødslen, musen hyaloid vaskulære system begynder at genvinde efter fødslen. Da musen nethinden er født avaskulære og retinale fartøjer udvikle postnatalt, hyaloid fartøjer tilbagegang samtidig fra postnatal dag (P) 4 og er for det meste helt svandt af P216 (figur 1). PM forsvinder først mellem P10 og P12, og VHP forsvinder mellem P12 og P16, mens et lille antal TVL-og HA-celler forbliver selv på P16, og ved P21 er hyaloid vaskulære system regression næsten komplet6. I mellemtiden begynder retinal Vaskulaturen at udvikle sig efter fødslen. Det overfladiske lag af vaskulære plexus strækker sig fuldt ud til den perifere nethinden på P7 – P8, det dybe lag (placeret i det ydre plexiformlag) udvikler sig fra P7 – P12, og endelig udvikler det mellemliggende plexus i det inderste plexiformlag mellem P12 og P157 . Efterhånden som den retinale vaskulatur udvikler sig, erstatter den gradvist funktionen af samtidigt regresserende hyaloidekar, der giver næring og ilt til det udviklende øje. Den postnatale forekomst af hyaloid-fartøjs regression i mus giver en let tilgængelig eksperimentel model til at observere og studere hyaloidevaskulaturen samt det molekylære grundlag for vaskulære regressions processer under både fysiologiske og patologiske tilstande8.
Svigt af hyaloid regression kan ses i sygdomme som PHPV, som er en sjælden medfødt udviklingsmæssige anomali af øjet som følge af en mislykket eller ufuldstændig regression af den embryologiske, primære glasøse og hyaloid Vaskulaturen9. De mekanismer, der regulerer regressions processen af hyaloid vaskulatur er komplicerede og bredt undersøgt. En af de vigtigste molekylære veje, der er afgørende for den normale regression af hyaloide fartøjer, er WNT signalering pathway10, da genetiske mutationer i denne sti, der påvirker både WNT ligand og receptorer, er blevet forbundet med PHPV i mennesker9. Eksperimentelle undersøgelser identificerede en WNT ligand, Wnt7b, som produceres af makrofager omkring hyaloide fartøjer i det udviklende øje for at mægle denne regressions proces. Wnt7b aktiverer WNT signalering ved binding med receptorerne frizzled4 (FZD4)/LRP5 i tilstødende endotelceller til at initiere celle apoptose, hvilket fører til regression af hyaloid fartøjer10. Som et resultat, Wnt7b-mangelfulde mus viser en persistens af hyaloid fartøjer10. Tilsvarende binder en ikke-konventionel WNT ligand, Norrin (kodet af NDP -genet), også til FZD4/LRP5 for at inducere hyaloid-fartøjets regression under udviklingen. NDPy/-, Lrp5-/-, og Fzd4-/- mus alle display udskudt hyaloid fartøj regression, understøtter en kritisk regulerende rolle i WNT signalering11,12, 13,14,15,16. Desuden er en anden WNT coreceptor LRP6 overlapper med LRP5 i deres funktion på modulering af WNT signalering pathway i hyaloid vaskulære endotheliale celler17. Andre faktorer, der kan også bidrage til hyaloid regression omfatter hypoxia-inducerbarfaktor 18,19, vaskulær endotelial vækstfaktor20,21, kollagen-1822, 23, ARF24, angiopoietin-225, og knogle morfogenetisk protein-426. I dette papir bruger vi Lrp5-/- mus som en model af vedvarende hyaloide fartøjer til at demonstrere teknikker til vurdering og karakterisering af hyaloid Vaskulaturen gennem både in vivo og ex vivo metoder.
Visualisering af hyaloid Vaskulaturen in vivo og ex vivo er afgørende for at studere mekanismerne i hyaloid fartøjs regression. Nuværende metoder til at observere hyaloid Vaskulaturen primært fokusere på visualisering og analyse af VHP og ha, gennem Oct og FFA billeder, Eye Cross sektioner, og hyaloid Flat mount. OCT og FFA er kraftfulde in vivo Imaging værktøjer, så langsgående observation i levende dyr, efter at de har åbnet deres øjne. Desuden giver isoleret hyaloid Flat Mount visualisering af hele hyaloid Vaskulaturen og et middel til at opnå en nøjagtig kvantificering af fartøjs numrene. Men den skrøbelige og skrøbelige karakter af hyaloide fartøjer og de deraf følgende tekniske vanskeligheder ved dets isolation kan have begrænset dets anvendelse i øjen forskning noget10,17,27. I dette papir, vi giver en detaljeret protokol af visualisering af hyaloide fartøjer, der kombinerer både in vivo levende retinale Imaging og ex vivo isoleret hyaloid Flat mount for at øge gennemførligheden af disse teknikker. Denne protokol er blevet tilpasset med ændringer og udvidelser fra tidligere publikationer om in vivo-metoden med levende fundus og OCT Imaging28 og ex vivo - metoden for isoleret hyaloid Flat Mount11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:997px;" width="998">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">AK-Fluor (fluorescein injection, USP)</td>
			<td style="width:191px;">Akorn</td>
			<td style="width:156px;">17478-253-10</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Anti-CD31 antibody</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:156px;">ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Antifade mounting medium</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:156px;">S2828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:156px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Artificial tear eyedrop</td>
			<td style="width:191px;">Systane</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">C57BL/6J mice</td>
			<td style="width:191px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:156px;">Stock NO: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Cryostat</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:156px;">CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Cryostat</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:156px;">CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop</td>
			<td>Cyclomydril</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">G9382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:156px;">A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating board</td>
			<td style="width:191px;">Lab-Line Instruments Inc.</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Isolectin GS-IB4, 594 conjugate</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:156px;">I21413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td style="width:191px;">KetaVed</td>
			<td style="width:156px;">NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Lrp5-/- mice</td>
			<td style="width:191px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:156px;">Stock NO. 005823</td>
			<td>Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Micron IV and OCT</td>
			<td style="width:191px;">Phoenix Research Labs</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td>Imaging software: InSight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microscope</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:156px;">discovery v8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microsurgery forceps</td>
			<td style="width:191px;">Scanlan International</td>
			<td style="width:156px;">4004-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microsurgery scissors</td>
			<td style="width:191px;">Scanlan International</td>
			<td style="width:156px;">6006-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Optimal cutting temperature compound</td>
			<td style="width:191px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:156px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Optimal cutting temperature compound</td>
			<td style="width:191px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:156px;">AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Electron&#160;Microscopy&#160;Sciences</td>
			<td style="width:156px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds)</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:156px;">12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X)</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:156px;">P0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Slide cover glass</td>
			<td style="width:191px;">Premiere</td>
			<td style="width:156px;">94-2222-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost microscope slides&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:156px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Xylazine sterile solution</td>
			<td style="width:191px;">Akorn: AnaSed</td>
			<td style="width:156px;">NDC: 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment and characterization of hyaloid vessels in mice

I øjet nærer de embryonale hyaloide fartøjer den udviklende linse og nethinden og genstigning, når nethinde skibene udvikler sig. Persisterende eller mislykket regression af hyaloide fartøjer kan ses i sygdomme som vedvarende hyperplastisk primær glaslegemet (PHPV), hvilket fører til en blokeret lysvej og nedsat visuel funktion. Forståelse af mekanismerne bag hyaloid-fartøjets regression kan føre til ny Molekylær indsigt i den vaskulære regressions proces og mulige nye måder at håndtere sygdomme med persistente hyaloide fartøjer på. Her beskriver vi procedurerne for billeddannelse hyaloid i levende mus med optisk kohærens tomografi (OCT) og fundus fluorescein angiografi (FFA) og en detaljeret teknisk protokol om isolering og flad montering hyaloid ex vivo til kvantitativ analyse. Lavdensitets lipoprotein receptor-relaterede protein 5 (LRP5) Knockout-mus blev brugt som en eksperimentel model af vedvarende hyaloide fartøjer for at illustrere teknikkerne. Tilsammen kan disse teknikker lette en grundig vurdering af hyaloide fartøjer som en eksperimentel model af vaskulær regression og undersøgelser af mekanismen af persistente hyaloide fartøjer.

In vivo billeddannelse af hyaloide fartøjer i levende mus Figur 3 A afslører tværsnits udsigt over OLT billeder til nethinden og hyaloid væv i 3-måneders-gamle WT og Lrp5-/-mus, en dyremodel med vedvarende hyaloid. WT Eye viser fraværet af hyaloid væv, mens Lrp5-/-Eye viser to vedvarende hyaloide fartøjer afledt af synsnerven hoved. Figur 3 B viser FFA billeder ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice Video at JoVE.com

Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice Video (Video) | JoVE

Denne protokol beskriver både in vivo og ex vivo metoder til fuldt ud at visualisere og karakterisere hyaloide fartøjer, en model af vaskulær regression i muse øjne, ved hjælp af optisk kohærens tomografi og fundus fluorescein angiografi for levende billeddannelse og ex vivo isolering og efterfølgende flad mount af hyaloid for kvantitativ analyse.

Vurdering og karakterisering af Hyaloide fartøjer i mus

In the eye, the embryonic hyaloid vessels nourish the developing lens and retina and regress when the retinal vessels develop. Persistent or failed ...

Vores protokol giver både in vivo og ex vivo foranstaltninger til visualisering og karakterisering af hyaloid vaskulatur i øjet som en nyttig eksperimentel model for at studere vaskulær regression. Denne teknik kombinerer både in vivo langsgående observation af hyaloid fartøjer i levende mus og ex vivo visualisering og nøjagtig kvantificering af dissekeret hele hyaloid fartøjer. Vores teknik giver en praktisk og gennemførlig metode til undersøgelse af patogenese og grundlæggende mekanismer i vedvarende føtal vaskulatur.Denne metode giver også indsigt i cellulære og molekylære mekanismer, der er involveret i reguleringen af okulær vaskulær regression, som kan være relevante for angiogenese forskning i andre organer. Den hyaloid isolation trin kan være teknisk udfordrende for begyndere. Masser af praksis og tålmodighed vil bidrage til at sikre en vellykket dissektion.Visualisering af denne metode vil give detaljerede praktiske oplysninger og tips om den teknik, der kan hjælpe seerne med at mestre færdighederne mere effektivt. For optisk sammenhæng tomografi eller OLT billeddannelse, justere musen og sonden, så den optiske nerve hovedet er i midten af det visuelle felt i fundus billedet og justere fokus og vinklen på den angivne linje i OCT imaging software til at afsløre den vedvarende hyaloid fartøjer, før du får billeder. For fundus fluorescein angiografi billeddannelse af hyaloid fartøjer, justere tilpasningen lidt for at placere synsnerven hovedet i midten af synsfeltet og ændre mikroskop filter til en grøn fluorescerende kanal.Fokuser derefter på de vedvarende hyaloidbeholdere og få flere billeder på et, tre, fem og 10 minutter efterindtøbning for at bestemme det bedste tidspunkt for signal-til-baggrund-forholdet til observation af fartøjerne. For ex vivo hyaloid fartøj dissektion og visualisering bruge mikrokirurgi pincet til at åbne øjenlågene i en postnatal dag-otte mus og placere buede mikrokirurgi pincet under kloden i kredsløb om det ene øje til at forstå synsnerven uden at klemme øjeæblet. Træk forsigtigt og fjern øjeæblet med scer og fastgør øjet i 4% paraformaldehyd ved stuetemperatur.Efter 30 minutter overføre de faste øjne til iskold PBS under en dissektion mikroskop og injicere 50 mikroliter af gelatine opløsning i glaslegeme af øjeæblet på fire forskellige jævnt fordelte steder omkring limbus. Derefter inkubere øjeæblet på is i 30 minutter for at størkne den injicerede gelatine i glaslegeme rummet. Når gelatine har hærdet overføre øjeæblet til en petriskål af PBS under dissekere mikroskop og bruge mikrokirurgi saks til at foretage et snit på limbus at fjerne hornhinden.Klip og fjern synsnerven under det dissekerende mikroskop. Ved hjælp af to par saftler skalle af og kassere sclera, choroid og retinale pigment epitellag, efterfulgt af fjernelse af iris. Med synsnerven side af nethinden vender opad og linserne vender nedad, injicere 50 mikroliter af PBS lige under nethinden kop til at tillade ophobning af PBS mellem gelatinerede glaslegeme og nethinden.Brug mikrokirurgi kraftpind til forsigtigt at skrælle nethinden kop og ciliaere krop fra glaslegeme. Ved hjælp af en overførsel pipet overføre gelatine kop indeholder hyaloid væv nedsænket i PBS til et mikroskop dias. Og drej de resterende væv over, så linsen vender opad.Løft derefter linsen og forsigtigt løsne forbindelsen mellem linsen tunica vasculosa lentis og vasa hyaloidea propria før du skærer hyaloid arterie med mikrokirurgi saks til at fjerne linsen tunica vasculosa lentis. Hold vasa hyaloidea propria regionen hyaloid kop til den flade mount. Til flad montering af hyaloid beholderen prøver forsigtigt skylle hyaloid kop med frisk PBS at fjerne eventuelle dissektion vragrester.Med vævet flyder i PBS bruge mikrokirurgi kraftaffræt til forsigtigt at arrangere og justere placeringen af gelatineret hyaloid kop, således at kanten af koppen vender nedad. Placer dias med hyaloid kop nedsænket i PBS på et dias varmere ved 37 grader Celsius. Efter gelatine smelter og hyaloid flader fjerne dias, når det er knap tør og tilføje en dråbe anti-fade montering medium med DAPI at plette kerner i hyaloid fartøjer.Derefter forsigtigt placere en coverslip på hyaloid at fuldføre den flade mount. For at afbilde DAPI farvning af hyaloid fartøjer overføre den monterede prøve på scenen af en fluorescerende mikroskop og bekræfte, at den centrale hyaloid arterie er synlig. Derefter identificeres de kargrene, der er direkte afledt af hyaloid arterien, og antallet af kargrene tælles manuelt til kvantificering.Her, tværsnitsvisninger af OCT billeder til nethinden og hyaloid væv i tre måneder gamle vilde type og lav densitet lipoprotein receptor-relaterede protein fem eller LRP5 knockout mus, en dyremodel med vedvarende hyaloid fartøjer, er vist. I disse fundus fluorescein angiografi billeder af vedvarende hyaloid fartøjer otte grene af hyaloid fartøjer er observeret i glaslegeme af seks uger gamle knockout mus, mens ingen rest af hyaloid fartøjer er observeret i vilde type dyr af samme alder. I disse hyaloid fartøj flade mounts de vaskulære celler og tilhørende makrofager kan identificeres ved deres nukleare DAPI farvning.Og hver linje af celler forgrening fra den centrale hyaloid arterie repræsenterer et fartøj af vasa hyaloidea propria. Vilde type mus har et gennemsnit på 12 grene af hyaloid fartøjer på postnatal dag otte, mens alder-matchede LRP5 knockout hvalpe udviser omkring 25 grene af hyaloid fartøjer viser en signifikant nedsat regression af hyaloid vaskulatur. Desuden, forsinket og ufuldstændig nethinden vaskulær udvikling er også observeret i LRP5 knockout hvalpe.Faktisk kan hyaloid fartøjer stadig identificeres i tværsnit af LRP5 knockout øjenvæv sektioner på postnatal dag otte. Mens de vilde type øjne ikke længere vise disse fartøjer. Det vigtigste at huske er at være blid og tålmodig, når isolere hyaloid systemet fra retinal og andre okulære væv.Efter isolering af hyaloid fartøjer immunstaining med forskellige celle markører kan udføres for at afdække de cellulære interaktioner regulerer hyaloid regression. Denne teknik udforsker de underliggende cellulære og molekylære mekanismer vedvarende føtal vaskulatur i okulær angiogenese forskning. Paraformaldehyd, ketamin og xylazin er farlige.Opberedning af disse reagenser i en kemisk røghætte ved hjælp af det korrekte personlige værneudstyr.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test Video (Video) | JoVE

Vurdering af gastrisk tømning hos ikke-overvægtige diabetiske mus ved anvendelse af en [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-octansyre Breath Test

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Echocardiographic Assessment of the Right Heart in Mice

Echocardiographic Assessment of the Right Heart in Mice Video (Video) | JoVE

Ekkokardiografisk Vurdering af højre hjerte i mus

Transgenic and toxic models of pulmonary arterial hypertension (PAH) are widely used to study the pathophysiology of PAH and to investigate potential ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice Video (Video) | JoVE

Halspulsåren infusioner farmakokinetisk og farmakodynamisk analyse af Taxaner i mus

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography Video (Video) | JoVE

Vurdering af virksomhedens rentabilitet for Human Fat Injektion i nøgne mus med Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice Video (Video) | JoVE

Ultralyd funderet vurdering af koronararterie Flow og koronar Flow Reserve Brug af trykoverbelastning Model i mus

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Echocardiographic Approaches and Protocols for Comprehensive Phenotypic Characterization of Valvular Heart Disease in Mice

Echocardiographic Approaches and Protocols for Comprehensive Phenotypic Characterization of Valvular Heart Disease in Mice Video (Video) | JoVE

Ekkokardiografiske Strategier og Protokoller for omfattende fænotypisk karakterisering af Valvular hjertesygdom i mus

The aim of this manuscript and accompanying video is to provide an overview of the methods and approaches used for imaging heart valve function in ...

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography Video (Video) | JoVE

Vurdering af respiratoriske funktion i bevidst mus af dobbelt-kammer Plethysmography

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to ...

Non-invasive Assessment of Dorsiflexor Muscle Function in Mice

Non-invasive Assessment of Dorsiflexor Muscle Function in Mice Video (Video) | JoVE

Non-invasiv vurdering af Dorsiflexor muskelfunktion i mus

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively ...

Induction and Characterization of Pulmonary Hypertension in Mice using the Hypoxia/SU5416 Model

Induction and Characterization of Pulmonary Hypertension in Mice using the Hypoxia/SU5416 Model Video (Video) | JoVE

Induktion og karakterisering af pulmonal hypertension hos mus ved hjælp af Hypoxi/SU5416-modellen

Pulmonary Hypertension (PH) is a pathophysiological condition, defined by a mean pulmonary arterial pressure exceeding 25 mm Hg at rest, as assessed by ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice Video (Video) | JoVE

Invasiv Hæodynamisk vurdering for det højre ventrikel system og hypoxia-induceret pulmonal arteriel hypertension i mus

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...