Name: assessment and characterization of hyaloid vessels in mice
Uploaded: 2019-05-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice Video at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door National Institutes of Health (NIH) subsidies (R01 EY024963 en EY028100) aan J.C. Z.W. werd gesteund door een Knights Templar Eye Foundation Career starter subsidie. De hyaloïde isolatie procedure beschreven in deze studie werd aangepast met modificatie van protocollen royaal gedeeld door drs. Richard lang, Toshihide Kurihara, en Lois Smith, aan wie de auteurs zijn dankbaar.

Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de verklaring van de vereniging voor onderzoek in visie en oogheelkunde (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundige en visie onderzoek voor dierproeven, volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health ( NIH) met betrekking tot de verzorging en het gebruik van dieren voor experimentele procedures en de verordeningen die zijn uiteengezet door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) in het Boston Children's Hospital. Lrp5-/-<...

<ol>
	<li>Lutty, G. A., McLeod, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+hyaloid,+choroidal+and+retinal+vasculatures+in+the+fetal+human+eye.">Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).</li><li>Anand-Apte, B., Hollyfield, J., Besharse, J., Bok, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+anatomy+of+the+retinal+and+choroidal+vasculature.">Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature.</a> The Retina and its Disorders. , (2011).</li><li>Hobbs, R. P., Hartnett, M. E., Hartnett, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2:+The+hyaloidal+vasculature+and+its+role+in+development.">Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development.</a> Pediatric Retina: Second Edition. , (2013).</li><li>Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+retinal+vasculature.">Development of the retinal vasculature.</a> Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).</li><li>Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+pathology+of+the+hyaloid,+choroidal+and+retinal+vasculature.">Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).</li><li>Ito, M., Yoshioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+the+hyaloid+vessels+and+pupillary+membrane+of+the+mouse.">Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse.</a> Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).</li><li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+retina+as+an+angiogenesis+model.">The mouse retina as an angiogenesis model.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).</li><li>Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ocular+angiogenesis:+from+development+to+pathologies.">Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies.</a> FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).</li><li>Shastry, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+hyperplastic+primary+vitreous:+congenital+malformation+of+the+eye.">Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).</li><li>Lobov, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNT7b+mediates+macrophage-induced+programmed+cell+death+in+patterning+of+the+vasculature.">WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature.</a> Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).</li><li>Kato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cbfa1-independent+decrease+in+osteoblast+proliferation,+osteopenia,+and+persistent+embryonic+eye+vascularization+in+mice+deficient+in+Lrp5,+a+Wnt+coreceptor.">Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).</li><li>Xia, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+familial+exudative+vitreoretinopathy+caused+by+LPR5+mutations.">A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations.</a> Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+development+in+the+retina+and+inner+ear:+control+by+Norrin+and+Frizzled-4,+a+high-affinity+ligand-receptor+pair.">Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair.</a> Cell. 116 (6), 883-895 (2004).</li><li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norrin,+frizzled-4,+and+Lrp5+signaling+in+endothelial+cells+controls+a+genetic+program+for+retinal+vascularization.">Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization.</a> Cell. 139 (2), 285-298 (2009).</li><li>Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norrie+gene+product+is+necessary+for+regression+of+hyaloid+vessels.">Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+expression+of+Wnt-pathway+mediated+genes+in+low-density+lipoprotein+receptor-related+protein+5+(Lrp5)+knockout+mice.">Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice.</a> PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).</li><li>Nayak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+vascular+regression+is+regulated+by+a+Wnt/beta-catenin,+MYC+and+CDKN1A+pathway+that+controls+cell+proliferation+and+cell+death.">Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death.</a> Development. 145 (12), (2018).</li><li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+pVHL+and+HIF-alpha+isoforms+are+required+for+embryonic-to-adult+vascular+transition+in+the+eye.">Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye.</a> The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).</li><li>Huang, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+HIF-1alpha+partially+rescues+the+abnormal+hyaloid+vascular+system+in+Cited2+conditional+knockout+mouse+eyes.">Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes.</a> Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).</li><li>Yoshikawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regression+of+hyaloid+vasculature+is+triggered+by+neurons.">Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).</li><li>Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+VEGF-A+in+lens+development:+formation+of+the+hyaloid+capillary+network+and+protection+against+transient+nuclear+cataracts.">The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts.</a> Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).</li><li>Hurskainen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+maturation+of+the+retinal+vasculature+in+type+XVIII+collagen/endostatin+deficient+mice+and+changes+in+retinal+glial+cells+due+to+lack+of+collagen+types+XV+and+XVIII.">Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII.</a> FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).</li><li>Fukai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+collagen+XVIII/endostatin+results+in+eye+abnormalities.">Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities.</a> The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).</li><li>McKeller, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arf+tumor+suppressor+gene+promotes+hyaloid+vascular+regression+during+mouse+eye+development.">The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).</li><li>Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2+plays+an+important+role+in+retinal+angiogenesis.">Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis.</a> Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).</li><li>Chang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficient+Bmp4+ocular+phenotypes+include+anterior+segment+dysgenesis+with+elevated+intraocular+pressure.">Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure.</a> BMC Genetics. 2, 18 (2001).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+Activation+of+Wnt+Signaling+by+Lithium+Normalizes+Retinal+Vasculature+in+a+Murine+Model+of+Familial+Exudative+Vitreoretinopathy.">Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy.</a> The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+Image-Guided+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization+Model+in+Mice.">Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).</li><li>Kishimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+characteristics+of+regressing+vessels+in+the+hyaloid+vascular+system+of+neonatal+mice:+Novel+implication+for+vascular+atrophy.">Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy.</a> Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).</li><li>Lang, R. A., Bishop, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+cell+death+and+tissue+remodeling+in+the+developing+mouse+eye.">Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye.</a> Cell. 74 (3), 453-462 (1993).</li><li>Riazifar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterization+of+Bst+/-+mouse+retina.">Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).</li></ol>

Technieken voor het beoordelen en karakteriseren van hyaloïde schepen zijn intuïtieve en noodzakelijke procedures om de mellitus-bloedvat regressie in diermodellen te observeren, om studies mogelijk te maken over de mechanismen die ten grondslag liggen aan de vasculaire regressie tijdens de ontwikkeling. Terwijl de in vivo retinale beeldvorming de longitudinale observatie van hyaloïde regressie in hetzelfde dier toestaat, kan de toegang tot een knaagdier fundus Imaging System voor OCT en FFA een beperkende factor zijn...

De bloedtoevoer in het oog is essentieel om de normale ontwikkeling van het netvlies en de omringende oculaire weefsels te waarborgen en een goede visuele functie uit te rusten. Er zijn drie vasculaire bedden in het oog: de retinale vasculatuur, de choroid en een voorbijgaande embryonale circulatie netwerk van hyaloïde vaten. De ontwikkeling van de oculaire vasculatuur vereist ruimtelijke en temporele coördinatie in de gehele embryogenese en weefsel rijping. Onder de drie vasculaire bedden is de mellitus vasculatuur het eerste functionele bloedtoevoer systeem dat voeding en zuurstof levert aan de nieuw gevormde embryonale lens en het ontwikkelende netvlies. Hyaloïde vaten regressie op hetzelfde moment dat de retina vasculaturen ontwikkelen en volwassen1. De regressie van hyaloïde vasculatuur is cruciaal om een duidelijk visueel traject voor de ontwikkeling van visuele functie mogelijk te maken; Vandaar, dit vasculaire regressie proces is net zo belangrijk als de groei van retinale vasculatuur. Verminderde hyaloïde regressie kan leiden tot oogziekten. Bovendien biedt de regressie van hyaloïde vaten een modelsysteem om de cellulaire en moleculaire mechanismen te onderzoeken die betrokken zijn bij de regulering van vasculaire regressie, wat gevolgen kan hebben voor de angiogene regulatie in andere organen ook.
De hyaloïde vasculatuur, afgeleid van de hyaloïde slagader (ha), bestaat uit Vasa hyaloidea propria (VHP), Tunica vasculosa linzen (TVL) en pupil membraan (PM). Het biedt voeding aan de ontwikkelende retina, de primaire glasvocht, en de lens tijdens de embryonale ontwikkeling2. Als gevolg van de HA worden de VHP takken door het glasvocht naar de lens. De TVL cups het achterste oppervlak van de lens capsule, en anastomosen aan de PM, die aansluit op de voorste Ciliaire slagaders, die het voorste oppervlak van de lens2,3, resulterend in de vorming van een netwerk van schepen in de PM 3 , 4 , 5. interessant is dat er geen aderen in de hyaloïde vasculatuur zijn, en het systeem maakt gebruik van choroïdale aderen om veneuze drainage te bereiken.
In het menselijk embryo is de hyaloïde vasculatuur bijna voltooid bij ongeveer de negende week van de dracht en begint te regeren wanneer de eerste retinale vaten verschijnen, tijdens de vierde maand van de dracht2. Beginnend met atrofie van de VHP, regressie van de capillaire netwerken van de TVL, de PM, en ten slotte, de ha treedt vervolgens op2,3. Ondertussen trekt het primaire glasvocht in en de secundaire glasvocht begint te vormen, samengesteld uit de extracellulaire matrix componenten, waaronder collageenvezels. Door de zesde maand van de dracht wordt het primaire glasvocht gereduceerd tot een klein transparant kanaal dat zich uitstrekt van de oogzenuw schijf naar de lens, het Cloquet's kanaal of het hyaloïde kanaal, en het secundaire glasvocht wordt het hoofdbestanddeel van het posterieure segment 2 , 3. de hyaloïde circulatie verdwijnt meestal op 35 tot 36 weken van de dracht, net voor de geboorte3.
In tegenstelling tot mensen, bij wie hyaloïde vasculatuur volledig achteruit is bij de geboorte, begint het hyaloïde vasculaire systeem van de muis na de geboorte te vervallen. Naarmate het netvlies van de muis wordt geboren, worden avasculaire en retinale bloedvaten postnataal ontwikkeld, hyaloïde vaten komen gelijktijdig uit postnatale dag (P) 4 en zijn meestal volledig achteruit gaan door P216 (Figuur 1). De PM verdwijnt eerst tussen P10 en P12, en de VHP verdwijnt tussen P12 en P16, terwijl een klein aantal TVL-en ha-cellen zelfs bij P16 blijft, en door P21 de mellitus-vasculaire systeem regressie is bijna voltooid6. In de tussentijd begint retinale vasculatuur na de geboorte te ontwikkelen. De oppervlakkige laag van vasculaire plexus strekt zich volledig uit tot de perifere Retina bij P7-P8, de diepe laag (gelegen in de buitenste plexiforme laag) ontwikkelt van P7 – P12, en ten slotte ontwikkelt de tussenliggende plexus in de binnenste plexiforme laag tussen P12 en P157 . Naarmate de retinale vasculatuur zich ontwikkelt, vervangt deze geleidelijk de functie van gelijktijdig regressiehoudende hyaloïde vaten, waardoor voeding en zuurstof aan het ontwikkelende oog worden verstrekt. Het postnatale optreden van hyaloïde bloedvat regressie in muizen biedt een gemakkelijk toegankelijk experimenteel model om de hyaloïde vasculatuur te observeren en te bestuderen, evenals de moleculaire basis voor vasculaire regressie processen onder zowel fysiologische als pathologische condities8.
Falen van hyaloïde regressie kan worden gezien bij ziekten zoals PHPV, wat een zeldzame aangeboren ontwikkelings anomalie van het oog is, resulterend uit een mislukte of onvolledige regressie van de embryologische, primaire glasvocht en hyaloïde vasculatuur9. De mechanismen die het regressie proces van hyaloïde vasculatuur reguleren zijn ingewikkeld en breed bestudeerd. Een belangrijk moleculair traject essentieel voor de normale regressie van hyaloïde vaten is de Wnt signalering traject10, als genetische mutaties in dit traject beïnvloeden zowel WNT ligand en receptoren zijn gekoppeld met phpv bij de mens9. Experimentele studies identificeerden een WNT ligand, Wnt7b, die wordt geproduceerd door macrofagen rond hyaloïde vaten in de ontwikkelende ogen te bemiddel dit regressie proces. Wnt7b activeert WNT-signalering door binding met de receptoren frizzled4 (FZD4)/LRP5 in aangrenzende endotheliale cellen om cel apoptosis te initiëren, wat leidt tot de regressie van hyaloïde vaten10. Dientengevolge, Wnt7b-deficiënte muizen tonen een persistentie van hyaloïde schepen10. Evenzo bindt een niet-conventionele WNT ligand, NorriN (gecodeerd door het NDP -gen), ook aan FZD4/LRP5 om de mellitus-bloedvat regressie tijdens de ontwikkeling te induceren. NDPy/-, Lrp5-/-, en Fzd4-/- muizen alle weergeven uitgesteld mellitus vessel regressie, ondersteuning van een cruciale regelgevende rol van WNT signalering11,12, 13,14,15,16. Bovendien, een andere WNT coreceptor LRP6 overlapt met LRP5 in hun functie op het moduleren van de Wnt signalering traject in mellitus vasculaire endotheliale cellen17. Andere factoren die ook kunnen bijdragen aan de hyaloïde regressie omvatten de hypoxie-induciblefactor 18,19, vasculaire endotheliale groeifactor 20,21, collageen-1822, 23, ARF24, angiopoietin-225, en botmorfogenetisch eiwit-426. In dit artikel gebruiken we Lrp5-/- muizen als een model van hardnekkige hyaloïde vaten om de technieken van het beoordelen en karakteriseren van hyaloïde vasculatuur door zowel in vivo als ex vivo-methoden aan te tonen.
De visualisatie van mellitus vasculatuur in vivo en ex vivo is essentieel voor het bestuderen van de mechanismen van mellitus-bloedvat regressie. De huidige methoden voor het observeren van hyaloïde vasculatuur richten zich vooral op het visualiseren en analyseren van de VHP en ha, door middel van Oct-en FFA-beelden, oogdwars secties en de mellitus-vlakke bevestiging. OCT en FFA zijn krachtige in vivo beeldvormings hulpmiddelen, waardoor longitudinale observatie in levende dieren mogelijk wordt nadat ze hun ogen hebben geopend. Bovendien biedt geïsoleerde hyaloïde platte steun een visualisatie van de gehele mellitus-vasculatuur en een middel om een nauwkeurige kwantificering van de vaartuig nummers te bereiken. Toch kan de delicate en fragiele aard van de hyaloïde schepen en de daaruit voortvloeiende technische moeilijkheden van zijn isolement het gebruik ervan in oogonderzoek enigszins10,17,27hebben beperkt. In dit artikel bieden we een gedetailleerd protocol van de visualisatie van hyaloïde vaten, waarbij zowel in vivo levende retinale beeldvorming als ex vivo geïsoleerde hyaloïde platte steun wordt gecombineerd om de haalbaarheid van deze technieken te verbeteren. Dit protocol is aangepast met aanpassing en uitbreiding van eerdere publicaties over de in vivo-methode van Live fundus en OCT Imaging28 en de ex vivo-methode van geïsoleerde hyaloïde platte Mount11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:997px;" width="998">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">AK-Fluor (fluorescein injection, USP)</td>
			<td style="width:191px;">Akorn</td>
			<td style="width:156px;">17478-253-10</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Anti-CD31 antibody</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:156px;">ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Antifade mounting medium</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:156px;">S2828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:156px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Artificial tear eyedrop</td>
			<td style="width:191px;">Systane</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">C57BL/6J mice</td>
			<td style="width:191px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:156px;">Stock NO: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Cryostat</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:156px;">CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Cryostat</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:156px;">CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop</td>
			<td>Cyclomydril</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">G9382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:156px;">A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating board</td>
			<td style="width:191px;">Lab-Line Instruments Inc.</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Isolectin GS-IB4, 594 conjugate</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:156px;">I21413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td style="width:191px;">KetaVed</td>
			<td style="width:156px;">NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Lrp5-/- mice</td>
			<td style="width:191px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:156px;">Stock NO. 005823</td>
			<td>Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Micron IV and OCT</td>
			<td style="width:191px;">Phoenix Research Labs</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td>Imaging software: InSight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microscope</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:156px;">discovery v8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microsurgery forceps</td>
			<td style="width:191px;">Scanlan International</td>
			<td style="width:156px;">4004-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microsurgery scissors</td>
			<td style="width:191px;">Scanlan International</td>
			<td style="width:156px;">6006-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Optimal cutting temperature compound</td>
			<td style="width:191px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:156px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Optimal cutting temperature compound</td>
			<td style="width:191px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:156px;">AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Electron&#160;Microscopy&#160;Sciences</td>
			<td style="width:156px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds)</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:156px;">12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X)</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:156px;">P0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Slide cover glass</td>
			<td style="width:191px;">Premiere</td>
			<td style="width:156px;">94-2222-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost microscope slides&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:156px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Xylazine sterile solution</td>
			<td style="width:191px;">Akorn: AnaSed</td>
			<td style="width:156px;">NDC: 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment and characterization of hyaloid vessels in mice

In het oog voeden de embryonale hyaloïde vaten de ontwikkelende lens en het netvlies en regressie wanneer de retinale bloedvaten zich ontwikkelen. Aanhoudende of mislukte regressie van hyaloïde vaten kan worden gezien bij ziekten zoals persistent hyperplastische primair glasvocht (PHPV), wat leidt tot een belemmerd lichtpad en een verminderde visuele functie. Inzicht in de onderliggende mechanismen van de hyaloïde bloedvat regressie kan leiden tot nieuwe moleculaire inzichten in het vasculaire regressie proces en potentiële nieuwe manieren om ziekten met aanhoudende hyaloïde vaten te beheersen. Hier beschrijven we de procedures voor het beeldvormende mellitus in levende muizen met optische coherentie tomografie (OCT) en fundus fluoresceïne angiografie (FFA) en een gedetailleerd technisch protocol van isolerende en platte mellitus ex vivo voor kwantitatieve analyse. Low-density lipoproteïne receptor-gerelateerde proteïne 5 (LRP5) Knockout muizen werden gebruikt als een experimenteel model van aanhoudende hyaloïde vaten, ter illustratie van de technieken. Samen kunnen deze technieken een grondige beoordeling van hyaloïde vaten mogelijk maken als een experimenteel model van vasculaire regressie en studies over het mechanisme van aanhoudende hyaloïde vaten.

In vivo beeldvorming van hyaloïde vaten in levende muizen Figuur 3 A onthult transversale beelden van Oct-afbeeldingen voor de retina en hyaloïde weefsels in 3 maanden oude WT en Lrp5-/-muizen, een diermodel met aanhoudende hyaloïde. De WT oog toont de afwezigheid van mellitus weefsel, terwijl de Lrp5-/-Eye toont twee hardnekkige hyaloïde vaten afgeleid van de oogzenuw hoofd. Figuur 3</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice Video at JoVE.com

Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice Video (Video) | JoVE

Dit protocol beschrijft zowel in vivo-als ex vivo-methoden om hyaloïde vaten volledig te visualiseren en karakteriseren, een model van vasculaire regressie in muis ogen, met behulp van optische coherentie tomografie en fundus fluoresceïne angiografie voor de Live Imaging en ex vivo isolatie en daaropvolgende vlakke houder van hyaloïde voor kwantitatieve analyse.

Beoordeling en karakterisering van Hyaloïde vaten bij muizen

In the eye, the embryonic hyaloid vessels nourish the developing lens and retina and regress when the retinal vessels develop. Persistent or failed ...

Ons protocol biedt zowel in vivo als ex vivo maatregelen voor het visualiseren en karakteriseren van de hyaloïde vasculatuur in het oog als een nuttig experimenteel model voor het bestuderen van vasculaire regressie. Deze techniek combineert zowel in vivo longitudinale observatie van hyaloïde vaten in levende muizen als ex vivo visualisatie en nauwkeurige kwantificering van ontleede hele hyaloïde vaten. Onze techniek biedt een praktische en haalbare methode voor het bestuderen van de pathogenese en basismechanismen van aanhoudende foetale vasculatuur.Deze methode geeft ook inzicht in cellulaire en moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de regulering van oculaire vasculaire regressie die relevant kunnen zijn voor angiogenese onderzoek in andere organen. De hyaloïde isolatie stappen kunnen technisch uitdagend zijn voor beginners. Veel oefening en geduld zal helpen om een succesvolle dissectie te garanderen.Het visualiseren van deze methode zal gedetailleerde hands-on informatie en tips over de techniek die kijkers kan helpen bij het beheersen van de vaardigheden efficiënter. Voor optische coherentietomografie of OCT-beeldvorming, pas de muis en sonde, zodat de optische zenuwkop is in het midden van het gezichtsveld in het fundus beeld en pas de focus en de hoek van de aangegeven lijn in de OCT imaging software om de aanhoudende hyaloïde vaten te onthullen voordat het verkrijgen van beelden. Voor fundus fluoresceïne angiografie beeldvorming van de hyaloïde vaten, pas de uitlijning iets aan de optische zenuwkop in het midden van het gezichtsveld en verander de microscoop filter naar een groene tl-kanaal.Focus dan op de aanhoudende hyaloïde vaten en verkrijg meerdere beelden op één, drie, vijf en 10 minuten na injectie om het beste tijdspunt voor de signaal-achtergrondverhouding voor het observeren van de vaten te bepalen. Voor ex vivo hyaloïde vat dissectie en visualisatie gebruik microchirurgie tangen om de oogleden van een postnatale dag-acht muis te openen en plaats gebogen microchirurgie tangen onder de bol in de baan van een oog om de oogzenuw te grijpen zonder knijpen de oogbol. Trek en verwijder voorzichtig de oogbol met tangen en bevestig het oog in 4%paraformaldehyde bij kamertemperatuur.Na 30 minuten breng de vaste oogbollen naar ijskoude PBS onder een dissectiemicroscoop en injecteer 50 microliters gelatineoplossing in het glasvochtlichaam van de oogbol op vier verschillende gelijkmatig verdeelde plaatsen rond de limbus. Vervolgens incubeer de oogbol op ijs gedurende 30 minuten om de geïnjecteerde gelatine stollen in de glasvocht ruimte. Wanneer de gelatine heeft genezen overdracht van de oogbol naar een petrischaaltje van PBS onder de ontledenmicroscoop en gebruik microchirurgschaar om een incisie te maken bij limbus om het hoornvlies te verwijderen.Knip en verwijder de oogzenuw onder de ontledenmicroscoop. Met behulp van twee paar tangen afpellen en gooi de sclera, choroïde en retinale pigment epitheel lagen, gevolgd door verwijdering van de iris. Met de oogzenuw kant van het netvlies naar boven en de lenzen naar beneden gericht, injecteren 50 microliters van PBS net onder het netvlies beker om accumulatie van de PBS tussen de gelatineiseerde glasvoed lichaam en het netvlies mogelijk te maken.Gebruik microchirurgie tangen om voorzichtig schil het netvlies beker en ciliary lichaam uit het glasvocht lichaam. Met behulp van een transfer pipet overdracht van de gelatine beker met het hyaloïde weefsel ondergedompeld in PBS naar een microscoop dia. En draai de resterende weefsels om, zodat de lens naar boven wordt gericht.Til vervolgens de lens op en maak voorzichtig de verbinding tussen de lens tunica vasculosa lentis en de vasa hyaloidea propria los voordat u de hyaloïde slagader snijdt met de microchirurgschaar om de lens tunica vasculosa lentis te verwijderen. Houd de vasa hyaloidea propria regio van de hyaloïde beker voor de vlakke berg. Voor een vlakke montage van de hyaloïde vat monsters voorzichtig spoelen de hyaloïde beker met verse PBS om eventuele dissectie puin te verwijderen.Met het weefsel drijvend in PBS gebruik microchirurgie tangen om voorzichtig te regelen en de positie van de gelatineiseerde hyaloid beker aan te passen, zodat de rand van de beker naar beneden wordt gericht. Plaats de glijbaan met de hyaloïde beker ondergedompeld in PBS op een dia-warmer op 37 graden Celsius. Nadat de gelatine smelt en de hyaloid vlakt verwijder de dia wanneer het nauwelijks droog is en voeg een druppel anti-fade montagemedium met DAPI toe om de kernen in de hyaloïde vaten te bevlekken.Plaats vervolgens voorzichtig een coverlip op het tongbeen om de platte berg te voltooien. Om de DAPI-kleuring van de hyaloïde vaten in beeld te brengen, breng het gemonteerde monster over op het stadium van een fluorescerende microscoop en bevestigt u dat de centrale hyaloïde slagader zichtbaar is. Identificeer vervolgens de vaattakken die rechtstreeks zijn afgeleid van de hyaloïde slagader en tel handmatig het aantal vaattakken voor kwantificering.Hier worden cross-sectionele weergaven van OCT-beelden voor het netvlies en hyaloïde weefsels in drie maanden oud wildtype en low-density lipoprotein receptor-gerelateerde eiwit vijf of LRP5 knock-out muizen, een dierlijk model met aanhoudende hyaloïde vaten, getoond. In deze fundus fluoresceïne angiografie beelden van persistente hyaloid vaten acht takken van hyaloid vaten worden waargenomen in het glasvocht lichaam van zes weken oude knock-out muizen, terwijl er geen overblijfsel van de hyaloïde vaten wordt waargenomen bij wilde type dieren van dezelfde leeftijd. In deze hyaloïde vat flat mounts de vasculaire cellen en de bijbehorende macrofagen kunnen worden geïdentificeerd door hun nucleaire DAPI kleuring.En elke lijn cellen vertakking van de centrale hyaloïde slagader vertegenwoordigt een vat vasa hyaloidea propria. Wild type muizen hebben een gemiddelde van 12 takken van hyaloïde vaten op postnatale dag acht, terwijl leeftijd-matched LRP5 knock-out pups vertonen ongeveer 25 takken van hyaloïde vaten waaruit een aanzienlijk verminderde regressie van hyaloïde vasculatuur. Bovendien, vertraagde en onvolledige retina vasculaire ontwikkeling wordt ook waargenomen in LRP5 knock-out pups.Inderdaad, hyaloïde vaten kunnen nog steeds worden geïdentificeerd in dwarsdoorsnedes van LRP5 knock-out oogweefsel secties op postnatale dag acht. Terwijl de wilde ogen deze vaten niet meer vertonen. Het belangrijkste om te onthouden is om zacht en geduldig bij het isoleren van het hyaloïde systeem van het netvlies en andere oculaire weefsels.Na het isoleren van de hyaloïde vaten immunostaining met verschillende celmarkers kunnen worden uitgevoerd om de cellulaire interacties te ontdekken die hyaloïde regressie reguleren. Deze techniek onderzoekt de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen van aanhoudende foetale vasculatuur in oculaire angiogenese onderzoek. Paraformaldehyde, ketamine en xylazine zijn gevaarlijk.Bereid deze reagentia in een chemische rookkap met behulp van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test Video (Video) | JoVE

Beoordeling van de maaglediging in niet-obese diabetische muizen met behulp van een [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-octaanzuur ademtest

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Echocardiographic Assessment of the Right Heart in Mice

Echocardiographic Assessment of the Right Heart in Mice Video (Video) | JoVE

Echocardiografische Beoordeling van de rechter hart in Muizen

Transgenic and toxic models of pulmonary arterial hypertension (PAH) are widely used to study the pathophysiology of PAH and to investigate potential ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice Video (Video) | JoVE

Halsslagader Infusions voor farmacokinetische en farmacodynamische analyse van Taxanen in Muizen

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography Video (Video) | JoVE

Beoordeling van de levensvatbaarheid van menselijk vet Injectie in Naakt Muizen met Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice Video (Video) | JoVE

Echografie gebaseerde beoordeling van coronaire Flow en Coronaire Flow Reserve Met behulp van de druk overbelasting Model in Muizen

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Echocardiographic Approaches and Protocols for Comprehensive Phenotypic Characterization of Valvular Heart Disease in Mice

Echocardiographic Approaches and Protocols for Comprehensive Phenotypic Characterization of Valvular Heart Disease in Mice Video (Video) | JoVE

Echocardiografische benaderingen en protocollen voor Comprehensive Fenotypische karakterisering van Valvular hart-en vaatziekten in Muizen

The aim of this manuscript and accompanying video is to provide an overview of the methods and approaches used for imaging heart valve function in ...

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography Video (Video) | JoVE

Beoordeling van de ademhalingsfunctie in bewuste muizen door Double-kamer Plethysmography

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to ...

Non-invasive Assessment of Dorsiflexor Muscle Function in Mice

Non-invasive Assessment of Dorsiflexor Muscle Function in Mice Video (Video) | JoVE

Niet-invasieve beoordelingvan releveurs spier functie in muizen

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively ...

Induction and Characterization of Pulmonary Hypertension in Mice using the Hypoxia/SU5416 Model

Induction and Characterization of Pulmonary Hypertension in Mice using the Hypoxia/SU5416 Model Video (Video) | JoVE

Inductie en karakterisering van pulmonale hypertensie bij muizen met behulp van het Hypoxia/SU5416-model

Pulmonary Hypertension (PH) is a pathophysiological condition, defined by a mean pulmonary arterial pressure exceeding 25 mm Hg at rest, as assessed by ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice Video (Video) | JoVE

Invasieve hemodynamische beoordeling voor het rechter ventrikel systeem en hypoxie-geïnduceerde pulmonale arteriële hypertensie bij muizen

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...