Name: assessment and characterization of hyaloid vessels in mice
Uploaded: 2019-05-15T13:30:00
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Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (NIH) (R01 EY024963 et EY028100) à J.C. Z.W. a été soutenu par une subvention de démarrage de carrière de la Fondation des Templiers. La procédure d'isolement hyaloïde décrite dans cette étude a été adaptée avec une modification des protocoles généreusement partagés par les Drs Richard Lang, Toshihide Kurihara et Lois Smith, à qui les auteurs sont reconnaissants.

Tous les animaux ont été traités conformément à la Déclaration de l'Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l'utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle pour des expériences animales, conformément aux Lignes directrices des National Institutes of Health ( NIH) concernant les soins et l'utilisation des animaux pour des procédures expérimentales et les règlements énoncés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) à l'Hôpital pou...

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Les techniques d'évaluation et de caractérisation des vaisseaux hyaloïdes sont des procédures intuitives et nécessaires pour observer la régression des vaisseaux hyaloïdes dans les modèles animaux, afin de permettre des études sur les mécanismes sous-jacents à la régression vasculaire au cours du développement. Tandis que l'imagerie rétinienne in vivo permet l'observation longitudinale de la régression hyaloïde chez le même animal, l'accès à un système d'imagerie de fonds de rongeur pour OCT et FFA pe...

L'approvisionnement en sang dans l'œil est essentiel pour assurer le développement normal de la rétine et des tissus oculaires environnants et pour équiper une fonction visuelle appropriée. Il y a trois lits vasculaires dans l'oeil : la vascularisation rétinienne, la choroïde, et un réseau circulatoire embryonnaire transitoire des vaisseaux hyaloïdes. Le développement de la vascularisation oculaire nécessite une coordination spatiale et temporelle tout au long de l'embryogenèse et de la maturation des tissus. Parmi les trois lits vasculaires, la vascularisation hyaloïde est le premier système fonctionnel d'approvisionnement en sang à fournir la nutrition et l'oxygène à la lentille embryonnaire nouvellement formée et à la rétine en développement. Les vaisseaux hyaïdis régressent en même temps que les vascularisations de la rétine se développent et mûrissent1. La régression de la vascularisation hyaloïde est essentielle pour permettre une voie visuelle claire pour le développement de la fonction visuelle ; par conséquent, ce processus vasculaire de régression est aussi important que la croissance de la vascularisation rétinienne. La régression hyaloïde altérée peut mener aux maladies d'oeil. En outre, la régression des vaisseaux hyaloïdes fournit un système modèle pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation de la régression vasculaire, qui peut avoir des implications pour la régulation angiogénique dans d'autres organes aussi bien.
La vascularisation hyaloïde, dérivée de l'artère hyaloïde (HA), est composée de vasa hyaloidea propria (VHP), tunica vasculosa lentis (TVL), et de membrane pupillaire (PM). Il fournit la nourriture à la rétine en développement, le vitré primaire, et la lentille pendant le développement embryonnaire2. En provenance de l'HA, VHP branches antérieurement à travers le vitré à la lentille. Le TVL tasse la surface postérieure de la capsule de lentille, et anastomoses au PM, qui se connecte aux artères ciliaires antérieures, couvrant la surface antérieure de la lentille2,3, résultant en la formation d'un réseau de vaisseaux dans le PM 3 (en) , 4 ( en plus) , 5. Il est intéressant de noter qu'il n'y a pas de veines dans la vascularisation hyaloïde, et le système utilise des veines choroïdes pour accomplir le drainage veineux.
Dans l'embryon humain, la vascularisation hyaloïde est presque terminée vers la neuvième semaine de gestation et commence à régresser lorsque les premiers vaisseaux rétiniens apparaissent, au cours du quatrième mois de gestation2. Commençant par l'atrophie du VHP, la régression des réseaux capillaires de la TVL, le PM, et enfin, l'HA se produit par la suite2,3. Pendant ce temps, les rétractations vitrées primaires et le vitreux secondaire commence à se former, composé des composants de matrice extracellulaire, y compris les fibres de collagène. Au sixième mois de gestation, le vitré primaire est réduit à un petit canal transparent s'étendant du disque nerveux optique à la lentille, appelé le canal du Cloquet ou le canal hyaloïde, et le vitré secondaire devient la composante principale du segment postérieur 2 (en) , 3. La circulation hyaloïde disparaît principalement à 35 à 36 semaines de gestation, juste avant la naissance3.
Contrairement aux humains, chez qui la vascularisation hyaloïde est complètement régressée à la naissance, le système vasculaire hyaloid de souris commence à régresser après la naissance. À mesure que la rétine de la souris naît avasculaire et que les vaisseaux rétiniens se développent postnatals, les vaisseaux hyaïdides régressent simultanément du jour postnatal (P) 4 et sont la plupart du temps complètement régressés par P216 (figure 1). Le PM disparaît d'abord entre P10 et P12, et le VHP disparaît entre P12 et P16, tandis qu'un petit nombre de cellules TVL et HA restent même à P16, et par P21 la régression du système vasculaire hyaloïde est presque terminée6. En attendant, la vascularisation rétinienne commence à se développer après la naissance. La couche superficielle du plexus vasculaire s'étend entièrement à la rétine périphérique à P7-P8, la couche profonde (située dans la couche plexiforme externe) se développe à partir de P7-P12, et enfin, le plexus intermédiaire dans la couche plexiforme interne se développe entre P12 et P157 . Au fur et à mesure que la vascularisation rétinienne se développe, elle remplace progressivement la fonction de la régression concomitante des vaisseaux hyaïdïdes, fournissant de la nutrition et de l'oxygène à l'œil en développement. L'occurrence postnatale de la régression des vaisseaux hyaïdïdes chez la souris fournit un modèle expérimental facilement accessible pour observer et étudier la vascularisation hyaloïde, ainsi que la base moléculaire régissant les processus de régression vasculaire sous physiologique et conditions pathologiques8.
L'échec de la régression hyaloïde peut être vu dans les maladies telles que PHPV, qui est une anomalie congénitale rare développementale de l'oeilrésultant d'une régression échouée ou incomplète de la vascularisation embryologique, primaire vitrée et hyaloïde 9. Les mécanismes régulant le processus de régression de la vascularisation hyaloïde sont compliqués et largement étudiés. Une voie moléculaire majeure essentielle pour la régression normale des vaisseaux hyaïdides est la voie de signalisation Wnt10, comme des mutations génétiques dans cette voie affectant à la fois Wnt ligand et les récepteurs ont été liés à PHPV chez l'homme9. Des études expérimentales ont identifié un Wnt ligand, Wnt7b, qui est produit par des macrophages autour des vaisseaux hyaloïdes dans l'œil en développement pour médiation de ce processus de régression. Wnt7b active la signalisation Wnt en se liant avec les récepteurs frizzled4 (FZD4)/LRP5 dans les cellules endothéliales adjacentes pour initier l'apoptose cellulaire, conduisant à la régression des vaisseaux hyaloïdes10. En conséquence, les souris Wnt7b-déficientes montrent une persistance des vaisseaux hyaloïdes10. De même, un Wnt ligand non conventionnel, Norrin (encodé par le gène du Npd), se lie également à FZD4/LRP5 pour induire la régression du vaisseau hyaloïde pendant le développement. Npdy/-, Lrp5-/-, et Fzd4-/- les souris affichent toutes la régression des vaisseaux hyaïdides reportées, soutenant un rôle réglementaire critique de Wnt signalant11,12, 13,14,15,16. En outre, un autre corécepteur Wnt LRP6 chevauche avec LRP5 dans leur fonction sur la modulation de la voie de signalisation Wnt dans les cellules endothéliales vasculaires hyaloid17. D'autres facteurs qui peuvent également contribuer à la régression hyaloid incluent le facteur hypoxia-inductible18,19, facteur de croissance endothéliale vasculaire20,21, collagène-1822, 23, Arf24, angiopoietine-225, et la protéine morphogénétique osseuse-426. Dans cet article, nous utilisons Lrp5-/- souris comme modèle des vaisseaux hyaloïdes persistants pour démontrer les techniques d'évaluation et de caractérisation de la vascularisation hyaloïde par des méthodes in vivo et ex vivo.
La visualisation de la vascularisation hyaloïde in vivo et ex vivo est essentielle pour étudier les mécanismes de la régression des vaisseaux hyaloïdes. Les méthodes actuelles pour observer la vascularisation hyaloïde se concentrent principalement sur la visualisation et l'analyse du VHP et de l'HA, à travers des images OCT et FFA, des sections transversales des yeux et la monture plate hyaloïde. L'OCT et la FFA sont de puissants outils d'imagerie in vivo, permettant l'observation longitudinale chez les animaux vivants après qu'ils ont ouvert les yeux. De plus, la monture plate hyaloïde isolée permet de visualiser l'ensemble de la vascularisation hyaloïde et de fournir une quantification précise du nombre de navires. Pourtant, la nature délicate et fragile des vaisseaux hyaloïdes et les difficultés techniques qui en résultent de son isolement peuvent avoir limité son utilisation dans la recherche oculaire quelque peu10,17,27. Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé de la visualisation des vaisseaux hyaloïdes, combinant la formation image rétinienne vivante in vivo et la monture plate hyaloid isolée ex vivo pour améliorer la faisabilité de ces techniques. Ce protocole a été adapté avec la modification et l'expansion des publications précédentes sur la méthode in vivo de base en direct et d'imagerie OCT28 et la méthode ex vivo de la monture plate hyaloïde isolée11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:997px;" width="998">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">AK-Fluor (fluorescein injection, USP)</td>
			<td style="width:191px;">Akorn</td>
			<td style="width:156px;">17478-253-10</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Anti-CD31 antibody</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:156px;">ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Antifade mounting medium</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:156px;">S2828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:156px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Artificial tear eyedrop</td>
			<td style="width:191px;">Systane</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">C57BL/6J mice</td>
			<td style="width:191px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:156px;">Stock NO: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Cryostat</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:156px;">CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Cryostat</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:156px;">CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop</td>
			<td>Cyclomydril</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">G9382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:156px;">A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating board</td>
			<td style="width:191px;">Lab-Line Instruments Inc.</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Isolectin GS-IB4, 594 conjugate</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:156px;">I21413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td style="width:191px;">KetaVed</td>
			<td style="width:156px;">NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Lrp5-/- mice</td>
			<td style="width:191px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:156px;">Stock NO. 005823</td>
			<td>Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Micron IV and OCT</td>
			<td style="width:191px;">Phoenix Research Labs</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td>Imaging software: InSight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microscope</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:156px;">discovery v8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microsurgery forceps</td>
			<td style="width:191px;">Scanlan International</td>
			<td style="width:156px;">4004-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microsurgery scissors</td>
			<td style="width:191px;">Scanlan International</td>
			<td style="width:156px;">6006-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Optimal cutting temperature compound</td>
			<td style="width:191px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:156px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Optimal cutting temperature compound</td>
			<td style="width:191px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:156px;">AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Electron&#160;Microscopy&#160;Sciences</td>
			<td style="width:156px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds)</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:156px;">12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X)</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:156px;">P0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Slide cover glass</td>
			<td style="width:191px;">Premiere</td>
			<td style="width:156px;">94-2222-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost microscope slides&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:156px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Xylazine sterile solution</td>
			<td style="width:191px;">Akorn: AnaSed</td>
			<td style="width:156px;">NDC: 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment and characterization of hyaloid vessels in mice

Dans l'œil, les vaisseaux hyaloid embryonnaires nourrissent la lentille et la rétine en développement et régressent lorsque les vaisseaux rétiniens se développent. La régression persistante ou échouée des vaisseaux hyaloïdes peut être vue dans des maladies telles que le vitré primaire hyperplastique persistant (PHPV), menant à un chemin de lumière obstrué et à la fonction visuelle altérée. Comprendre les mécanismes sous-jacents à la régression des vaisseaux hyaïdides peut conduire à de nouvelles connaissances moléculaires dans le processus de régression vasculaire et de nouvelles façons potentielles de gérer les maladies avec des vaisseaux hyaloïdes persistants. Ici nous décrivons les procédures pour l'hyaloïde d'imagerie chez les souris vivantes avec la tomographie optique de cohérence (OCT) et l'angiographie de fluorescein de fundus (FFA) et un protocole technique détaillé de l'ex vivo d'hyaloïde isolant et plat-montage pour l'analyse quantitative. Des souris knock-out de protéine 5 (LRP5) liées aux récepteurs de lipoprotéines de faible densité ont été utilisées comme modèle expérimental de vaisseaux hyaloïdes persistants, pour illustrer les techniques. Ensemble, ces techniques peuvent faciliter une évaluation approfondie des vaisseaux hyaloïdes comme modèle expérimental de régression vasculaire et des études sur le mécanisme des vaisseaux hyaloïdes persistants.

Imagerie in vivo de vaisseaux hyaloïdes chez des souris vivantes Figure 3 A révèle des vues transversales des images OCT pour la rétine et les tissus hyaloid chez les souris WT et Lrp5de 3 mois, un modèle animal avec hyaloïde persistant. L'oeil de WT montre l'absence de tissu hyaloïde, alors que l'oeil de Lrp5-/-montre deux vaisseaux hyaloïdes persistants dérivés de la tête de nerf optique. <strong class=...

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Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice Video (Video) | JoVE

Ce protocole décrit les méthodes in vivo et ex vivo pour visualiser et caractériser pleinement les vaisseaux hyaloïdes, un modèle de régression vasculaire dans les yeux de souris, utilisant la tomographie de cohérence optique et l'angiographie de fluorescein de fundus pour l'imagerie en direct et ex vivo l'isolement et la monture plate subséquente de hyaloid pour l'analyse quantitative.

Évaluation et caractérisation des navires hyaïdis chez les souris

In the eye, the embryonic hyaloid vessels nourish the developing lens and retina and regress when the retinal vessels develop. Persistent or failed ...

Notre protocole fournit à la fois des mesures in vivo et ex vivo pour visualiser et caractériser la vascularisation hyaloïde dans l’œil comme un modèle expérimental utile pour étudier la régression vasculaire. Cette technique combine à la fois l’observation longitudinale in vivo des vaisseaux hyaloïdes chez les souris vivantes et la visualisation ex vivo et la quantification précise des vaisseaux hyaloïdes entiers disséqués. Notre technique fournit une méthode pratique et faisable pour étudier la pathogénie et les mécanismes de base de la vascularisation foetale persistante.Cette méthode fournit également un aperçu des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation de la régression vasculaire oculaire qui peut être pertinente pour la recherche d’angiogenèse dans d’autres organes. Les étapes d’isolement hyaloïde peuvent être techniquement difficiles pour les débutants. Beaucoup de pratique et de patience aideront à assurer une dissection réussie.La visualisation de cette méthode fournira des informations pratiques détaillées et des conseils sur la technique qui peut aider les téléspectateurs à maîtriser les compétences plus efficacement. Pour la tomographie par cohérence optique ou l’imagerie OCT, ajustez la souris et la sonde de sorte que la tête du nerf optique soit au centre du champ visuel dans l’image du fond et ajustez la mise au point et l’angle de la ligne indiquée dans le logiciel d’imagerie OCT pour révéler les vaisseaux hyaloïdes persistants avant d’obtenir des images. Pour l’imagerie angiographie par fluoréscéine fundus des vaisseaux hyaloïdes, ajustez légèrement l’alignement pour positionner la tête du nerf optique au centre du champ de vision et changez le filtre microscope en canal fluorescent vert.Ensuite, concentrez-vous sur les vaisseaux hyaloïdes persistants et obtenez plusieurs images à un, trois, cinq et 10 minutes après l’injection pour déterminer le meilleur point de temps pour le rapport signal-arrière-plan pour l’observation des navires. Pour la dissection et la visualisation des vaisseaux hyaloïdes ex vivo, utilisez des forceps de microchirurgie pour ouvrir les paupières d’une souris postnatale du jour huit et placer des forceps de microchirurgie incurvés sous le globe dans l’orbite d’un œil pour saisir le nerf optique sans presser le globe oculaire. Tirez doucement et retirez le globe oculaire avec des forceps et fixez l’oeil dans le paraformaldéhyde de 4% à la température ambiante.Après 30 minutes, transférer les globes oculaires fixes au PBS glacé au microscope à dissection et injecter 50 microlitres de solution gélatineuse dans le corps vitreux du globe oculaire à quatre sites uniformément espacés autour du limbe. Puis incuber le globe oculaire sur la glace pendant 30 minutes pour solidifier la gélatine injectée dans l’espace vitreux. Lorsque la gélatine a guéri transférer le globe oculaire à une boîte de Pétri de PBS sous le microscope dissection et utiliser des ciseaux de microchirurgie pour faire une incision à limbus pour enlever la cornée.Pincez et retirez le nerf optique sous le microscope disséquant. À l’aide de deux paires de forceps décoller et jeter les couches d’épithélium pigmentaire sclera, choroïde et rétinien, suivie de l’ablation de l’iris. Avec le côté nerveux optique de la rétine face vers le haut et les lentilles orientées vers le bas, injecter 50 microlitres de PBS juste sous la tasse de rétine pour permettre l’accumulation de la PBS entre le corps vitreux gélatineux et la rétine.Utilisez des forceps de microchirurgie pour peler doucement la tasse de rétine et le corps ciliaire du corps vitreux. À l’aide d’un pipet de transfert, transférer la tasse de gélatine contenant le tissu hyaloïde immergé dans le PBS à une lame de microscope. Et retournez les tissus restants de sorte que la lentille est orientée vers le haut.Soulevez ensuite la lentille et relâchez doucement la connexion entre la lentille tunica vasculosa lentis et la vasa hyaloidea propria avant de couper l’artère hyaloïde avec les ciseaux de microchirurgie pour enlever la lentille tunica vasculosa lentis. Gardez la vasa hyaloidea propria région de la tasse hyaloïde pour la monture plate. Pour le montage plat des échantillons de récipient hyaloïde rincer doucement la tasse hyaloid avec PBS frais pour enlever tous les débris de dissection.Avec le tissu flottant dans PBS utiliser des forceps de microchirurgie pour arranger doucement et ajuster la position de la tasse hyaloïde gélatineuse de sorte que le bord de la tasse est orienté vers le bas. Placez la toboggan avec la tasse hyaloïde immergée dans le PBS sur un chauffe-glissière à 37 degrés Celsius. Après la fonte de la gélatine et l’aplatissement hyaloïde enlever la lame quand il est à peine sec et ajouter une goutte de milieu de montage anti-fondu avec DAPI pour tacher les noyaux dans les vaisseaux hyaloïdes.Ensuite, placez doucement un coverslip sur l’hyaloïde pour compléter la monture plate. Pour imager la coloration DAPI des vaisseaux hyaloïdes transférer l’échantillon monté sur le stade d’un microscope fluorescent et confirmer que l’artère hyaloïde centrale est visible. Identifiez ensuite les branches du navire directement dérivées de l’artère hyaloïde et comptez manuellement le nombre de branches de navires à quantifier.Ici, des vues transversales des images d’OCT pour la rétine et les tissus hyaloïdes dans le type sauvage de trois mois et la protéine récepteur de lipoprotéine de basse densité cinq ou souris de KO de LRP5, un modèle animal avec des vaisseaux hyaloïdes persistants, sont montrées. Dans ces images d’angiographie de fluorescéine de fundus des vaisseaux hyaloïdes persistants huit branches des vaisseaux hyaloïdes sont observées dans le corps vitreux des souris de KO de six semaines tandis qu’aucun reste des vaisseaux hyaloïdes n’est observé chez les animaux sauvages de type du même âge. Dans ces vaisseaux hyaloïdes, les montures plates des cellules vasculaires et des macrophages associés peuvent être identifiés par leur coloration nucléaire DAPI.Et chaque ligne de cellules ramissant de l’artère hyaloïde centrale représente un vaisseau de vasa hyaloidea propria. Les souris sauvages de type ont en moyenne 12 branches de vaisseaux hyaloïdes au huitième jour postnatal, tandis que les chiots KO LRP5 appariés par âge présentent environ 25 branches de vaisseaux hyaloïdes démontrant une régression significativement altérée de la vascularisation hyaloïde. En outre, le développement vasculaire retardé et incomplet de rétine est également observé dans les chiots de KO de LRP5.En effet, les vaisseaux hyaloïdes peuvent encore être identifiés dans les sections transversales des sections de tissu oculaire par KO LRP5 au huitième jour postnatal. Alors que les yeux de type sauvage n’affichent plus ces vaisseaux. La chose la plus importante à retenir est d’être doux et patient lors de l’isolement du système hyaloïde de la rétine et d’autres tissus oculaires.Après isoler les vaisseaux hyaloïdes immunostaining avec différents marqueurs cellulaires peuvent être effectués pour découvrir les interactions cellulaires régulant la régression hyaloïde. Cette technique explore les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents de la vascularisation foetale persistante dans la recherche oculaire d’angiogenèse. Le paraformaldéhyde, la kétamine et la xylazine sont dangereux.S’il vous plaît préparer ces reagents dans un capot de fumée chimique en utilisant l’équipement de protection individuelle approprié.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice

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