Name: assessment and characterization of hyaloid vessels in mice
Uploaded: 2019-05-15T13:30:00
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Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Institutes of Health (NIH) (R01 EY024963 und EY028100) an J.C. Z.W. unterstützt, das von einem Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant unterstützt wurde. Das in dieser Studie beschriebene Hyaloid-Isolationsverfahren wurde mit Änderungen an Protokolle angepasst, die von Drs. Richard Lang, Toshihide Kurihara und Lois Smith großzügig geteilt wurden, denen die Autoren dankbar sind.

Alle Tiere wurden gemäß der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) zur Verwendung von Tieren in der Augen- und Sichtforschung für Tierversuche gemäß den Richtlinien der Nationalen Gesundheitsinstitute ( NIH) in Bezug auf die Pflege und Verwendung von Tieren für experimentelle Verfahren und die Vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) im Boston Children es Hospital festgelegten Vorschriften. Lrp5-/- Mäuse (Bestands-Nr. 005823; Jackson Laborator...

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Techniken zur Beurteilung und Charakterisierung von Hyaloidgefäßen sind intuitive und notwendige Verfahren zur Beobachtung der Hyaloidgefäßregression in Tiermodellen, um Studien über die Mechanismen zu ermöglichen, die der gefäßregression während der Entwicklung zugrunde liegen. Während die in vivo retinale Bildgebung die Längsbeobachtung der Hyaloidregression bei demselben Tier ermöglicht, kann der Zugang zu einem Nagetier-Fundus-Bildgebungssystem für OCT und FFA ein begrenzender Faktor sein. Darüber hinau...

Die Blutversorgung im Auge ist wichtig, um die normale Entwicklung der Netzhaut und des umgebenden Augengewebes zu gewährleisten und eine angemessene Sehfunktion zu gewährleisten. Es gibt drei Gefäßbetten im Auge: die Netzhautvaskulatur, die Aderhaut und ein vorübergehendes embryonales Kreislaufnetz von Hyaloidgefäßen. Die Entwicklung der okulären Vaskulatur erfordert räumliche und zeitliche Koordination während der Embryogenese und Gewebereifung. Unter den drei Gefäßbetten ist die Hyaloid-Vaskulatur das erste funktionelle Blutversorgungssystem, das der neu gebildeten embryonalen Linse und der sich entwickelnden Netzhaut Nahrung und Sauerstoff liefert. Hyaloidgefäße treten gleichzeitig zurück, dass sich die Netzhautvaskulaturen entwickeln und reifen1. Die Regression der hyaloiden Vaskulatur ist entscheidend, um einen klaren visuellen Weg für die Entwicklung der visuellen Funktion zu ermöglichen; Daher ist dieser vaskuläre Regressionsprozess ebenso wichtig wie das Wachstum der Netzhautvaskulatur. Beeinträchtigte Hyaloid-Regression kann zu Augenerkrankungen führen. Darüber hinaus bietet die Regression von Hyaloidgefäßen ein Modellsystem zur Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen, die an der Regulation der gefäßregression beteiligt sind, was Auswirkungen auf die angiogene Regulation auch in anderen Organen haben kann.
Die hyaloide Vaskulatur, abgeleitet von der Hyaloidarterie (HA), besteht aus Vasa hyaloidea propria (VHP), Tunica vasculosa lentis (TVL) und Pupillenmembran (PM). Es versorgt die sich entwickelnde Netzhaut, den primären Glaskörper und die Linse während der embryonalen Entwicklung2. VHP, das aus dem HA entsteht, zweigt sich vordergründ durch den Glaskörper zur Linse. Der TVL bechert die hintere Oberfläche der Linsenkapsel und Anastomosen zum PM, der sich mit den vorderen Ziliararterien verbindet und die vordere Oberfläche der Linse2,3bedeckt, was zur Bildung eines Netzes von Gefäßen in der PM führt. 3 , 4 , 5. Interessanterweise gibt es keine Venen in der Hyaloid-Vaskulatur, und das System nutzt Adernvenen, um venöse Drainage zu erreichen.
Im menschlichen Embryo ist die Hyaloid-Vaskulatur etwa in der neunten Schwangerschaftswoche nahezu vollständig und beginnt sich zu regressieren, wenn die ersten Netzhautgefäße während des vierten Schwangerschaftsmonats2erscheinen. Beginnend mit der Atrophie des VHP, Regression der Kapillarnetze des TVL, der PM, und schließlich tritt die HA später2,3. In der Zwischenzeit beginnt sich der primäre Glaskörper zurückzieht und der sekundäre Glaskörper beginnt sich zu bilden, bestehend aus den extrazellulären Matrixkomponenten, einschließlich Kollagenfasern. Bis zum sechsten Monat der Trächtigkeit wird der primäre Glaskörper auf einen kleinen transparenten Kanal reduziert, der sich von der Sehnervenscheibe bis zur Linse erstreckt, der als Cloquet-Kanal oder Hyaloidkanal bezeichnet wird, und der sekundäre Glaskörper wird zum Hauptbestandteil des hinteren Segments 2 , 3. Die Hyaloidzirkulation verschwindet meist bei 35 bis 36 Wochen Schwangerschaft, kurz vor der Geburt3.
Im Gegensatz zum Menschen, bei dem die Hyaloid-Vaskulatur bei der Geburt vollständig zurückgeht, beginnt das hyaloide Gefäßsystem der Maus nach der Geburt zurückzufallen. Da die Mausnetzhaut avaskulär geboren wird und netzhautgefäße sich postnatal entwickeln, treten Hyaloidgefäße gleichzeitig vom postnatalen Tag (P) 4 zurück und werden meist vollständig durch P216 (Abbildung 1) zurückgeleitet. Die PM verschwindet zuerst zwischen P10 und P12, und die VHP verschwindet zwischen P12 und P16, während eine kleine Anzahl von TVL- und HA-Zellen sogar bei P16 verbleiben und durch P21 die Hyaloid-Gefäßsystemregression fast vollständigist 6. In der Zwischenzeit beginnt sich die Netzhautvaskulatur nach der Geburt zu entwickeln. Die oberflächliche Schicht des Gefäßplexus erstreckt sich vollständig auf die periphere Netzhaut bei P7–P8, die tiefe Schicht (in der äußeren Plexiformschicht) entwickelt sich aus P7–P12, und schließlich entwickelt sich der Zwischenplexus in der inneren Plexiformschicht zwischen P12 und P157 . Während sich die Netzhautvaskulatur entwickelt, ersetzt sie nach und nach die Funktion der gleichzeitig zurückgehenden Hyaloidgefäße und versorgt das sich entwickelnde Auge mit Nahrung und Sauerstoff. Das postnatale Auftreten der hyaloiden Gefäßregression bei Mäusen bietet ein leicht zugängliches experimentelles Modell zur Beobachtung und Untersuchung der Hyaloidvaskulatur sowie der molekularen Grundlage für vaskuläre Regressionsprozesse sowohl unter physiologischen als auch pathologische Bedingungen8.
Das Versagen der Hyaloid-Regression kann bei Krankheiten wie PHPV beobachtet werden, die eine seltene angeborene Entwicklungsanomalie des Auges ist, die aus einer fehlgeschlagenen oder unvollständigen Regression der embryonalen, primären Glaskörper- und Hyaloidvaskulatur9resultiert. Die Mechanismen, die den Regressionsprozess der Hyaloidvaskulatur regulieren, sind kompliziert und breit untersucht. Ein wichtiger molekularer Pfad, der für die normale Regression von Hyaloidgefäßen unerlässlich ist, ist der Wnt-Signalweg10, da genetische Mutationen in diesem Signalweg, die sowohl Wnt-Ligand als auch Rezeptoren betreffen, mit PHPV beim Menschen in Verbindung gebracht wurden9. Experimentelle Studien identifizierten einen Wnt-Ligand, Wnt7b, der durch Makrophagen um Hyaloidgefäße im sich entwickelnden Auge produziert wird, um diesen Regressionsprozess zu vermitteln. Wnt7b aktiviert Die Wnt-Signalisierung durch Bindung mit den Rezeptoren frizzled4 (FZD4)/LRP5 in benachbarten Endothelzellen, um zellapoptose zu initiieren, was zur Regression der Hyaloidgefäße10führt. Als Ergebnis zeigen Wnt7b-Mangelmäuseeine Persistenz von Hyaloidgefäßen10. In ähnlicher Weise bindet ein nicht konventionelles Wnt-Ligand, Norrin (durch das Ndp-Gen kodiert), ebenfalls an FZD4/LRP5, um die Hyaloidgefäßregression während der Entwicklung zu induzieren. Ndpy/-, Lrp5-/-und Fzd4-/- Mäuse zeigen alle verschobene Hyaloidgefäßregression, die eine kritische regulatorische Rolle der Wnt-Signalisierung11,12unterstützt 13,14,15,16. Darüber hinaus überschneidet sich ein anderer Wnt-Corezeptor LRP6 mit LRP5 in seiner Funktion zur Modulation des Wnt-Signalwegs in hyaloiden vaskulären Endothelzellen17. Andere Faktoren, die auch zur Hyaloid-Regression beitragen können, sind der Hypoxie-induzierbare Faktor18,19, vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor20,21, Kollagen-1822, 23, Arf24, Angiopoietin-225, und Knochen morphogenetisches Protein-426. In diesem Beitrag verwenden wir Lrp5-/- Mäuse als Modell persistenter Hyaloidgefäße, um die Techniken zur Beurteilung und Charakterisierung der hyaloiden Vaskulatur durch in vivo- und ex vivo-Methoden zu demonstrieren.
Die Visualisierung der hyaloiden Vaskulatur in vivo und ex vivo ist für die Untersuchung der Mechanismen der Hyaloidgefäßregression von wesentlicher Bedeutung. Aktuelle Methoden zur Beobachtung der Hyaloid-Vaskulatur konzentrieren sich hauptsächlich auf die Visualisierung und Analyse von VHP und HA, durch OCT- und FFA-Bilder, Augenquerschnitte und die hyaloide Flachhalterung. OCT und FFA sind leistungsstarke In-vivo-Bildgebungswerkzeuge, die eine Längsbeobachtung bei lebenden Tieren ermöglichen, nachdem sie ihre Augen geöffnet haben. Darüber hinaus bietet die isolierte hyaloide Flachmontage die Visualisierung der gesamten hyaloiden Vaskulatur und ein Mittel, um eine genaue Quantifizierung der Gefäßzahlen zu erreichen. Doch die empfindliche und zerbrechliche Natur der Hyaloidgefäße und die daraus resultierenden technischen Schwierigkeiten seiner Isolierung können seine Verwendung in der Augenforschung etwas eingeschränkt haben10,17,27. In diesem Beitrag stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung von Hyaloidgefäßen zur Verfügung, das sowohl in vivo live retinale Bildgebung als auch ex vivo isolierte hyaloide Flachmontage kombiniert, um die Durchführbarkeit dieser Techniken zu verbessern. Dieses Protokoll wurde mit Modifikation und Erweiterung von früheren Veröffentlichungen über die In-vivo-Methode des Live-Fundus und der OCT-Bildgebung28 und die ex vivo-Methode der isolierten hyaloiden Flachhalterung11angepasst.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:997px;" width="998">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">AK-Fluor (fluorescein injection, USP)</td>
			<td style="width:191px;">Akorn</td>
			<td style="width:156px;">17478-253-10</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Anti-CD31 antibody</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:156px;">ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Antifade mounting medium</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:156px;">S2828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:156px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Artificial tear eyedrop</td>
			<td style="width:191px;">Systane</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">C57BL/6J mice</td>
			<td style="width:191px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:156px;">Stock NO: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Cryostat</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:156px;">CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Cryostat</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:156px;">CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop</td>
			<td>Cyclomydril</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">G9382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:156px;">A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating board</td>
			<td style="width:191px;">Lab-Line Instruments Inc.</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Isolectin GS-IB4, 594 conjugate</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:156px;">I21413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td style="width:191px;">KetaVed</td>
			<td style="width:156px;">NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Lrp5-/- mice</td>
			<td style="width:191px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:156px;">Stock NO. 005823</td>
			<td>Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Micron IV and OCT</td>
			<td style="width:191px;">Phoenix Research Labs</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td>Imaging software: InSight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microscope</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:156px;">discovery v8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microsurgery forceps</td>
			<td style="width:191px;">Scanlan International</td>
			<td style="width:156px;">4004-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microsurgery scissors</td>
			<td style="width:191px;">Scanlan International</td>
			<td style="width:156px;">6006-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Optimal cutting temperature compound</td>
			<td style="width:191px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:156px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Optimal cutting temperature compound</td>
			<td style="width:191px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:156px;">AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Electron&#160;Microscopy&#160;Sciences</td>
			<td style="width:156px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds)</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:156px;">12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X)</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:156px;">P0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Slide cover glass</td>
			<td style="width:191px;">Premiere</td>
			<td style="width:156px;">94-2222-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost microscope slides&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:156px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Xylazine sterile solution</td>
			<td style="width:191px;">Akorn: AnaSed</td>
			<td style="width:156px;">NDC: 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment and characterization of hyaloid vessels in mice

Im Auge nähren die embryonalen Hyaloidgefäße die sich entwickelnde Linse und Netzhaut und treten zurück, wenn sich die Netzhautgefäße entwickeln. Eine anhaltende oder fehlgeschlagene Regression von Hyaloidgefäßen kann bei Krankheiten wie persistenten hyperplastischen Primärglaskörpern (PHPV) beobachtet werden, was zu einem verstopften Lichtpfad und einer beeinträchtigten Sehfunktion führt. Das Verständnis der Mechanismen, die der Regression des Hyaloidgefäßes zugrunde liegen, kann zu neuen molekularen Erkenntnissen über den vaskulären Regressionsprozess und potenziellen neuen Möglichkeiten zur Behandlung von Krankheiten mit persistenten Hyaloidgefäßen führen. Hier beschreiben wir die Verfahren zur Abbildung von Hyaloid bei lebenden Mäusen mit optischer Kohärenztomographie (OCT) und Fundusfluorescein-Angiographie (FFA) und einem detaillierten technischen Protokoll der Isolierung und Flachmontage von Hyaloid ex vivo für die quantitative Analyse. Low-Density Lipoprotein-Rezeptor-bezogene Protein 5 (LRP5) Knockout-Mäuse wurden als experimentelles Modell von persistenten Hyaloid-Gefäßen verwendet, um die Techniken zu veranschaulichen. Zusammen können diese Techniken eine gründliche Bewertung von Hyaloidgefäßen als experimentelles Modell der vaskulären Regression und Studien über den Mechanismus persistenter Hyaloidgefäße erleichtern.

In-vivo-Bildgebung von Hyaloidgefäßen bei lebenden Mäusen Abbildung 3 A zeigt Querschnittsansichten von OCT-Bildern für die Netzhaut und hyaloide Gewebe in 3 Monate alten WT und Lrp5-/-Mäusen, einem Tiermodell mit persistentem Hyaloid. Das WT-Auge zeigt das Fehlen von Hyaloidgewebe, während das Lrp5-/-Auge zwei persistente Hyaloidgefäße zeigt, die vom Sehnervenkopf abgeleitet sind. Abbil...

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Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice

Dieses Protokoll beschreibt sowohl in vivo- als auch ex vivo-Methoden zur vollständigen Visualisierung und Charakterisierung von Hyaloidgefäßen, einem Modell der vaskulären Regression in Mausaugen, unter Verwendung von optischer Kohärenztomographie und Fundusfluorescein-Angiographie für die Live-Bildgebung und ex vivo Isolation und anschließende flache Montage von Hyaloid für die quantitative Analyse.

Bewertung und Charakterisierung von Hyaloidgefäßen bei Mäusen

In the eye, the embryonic hyaloid vessels nourish the developing lens and retina and regress when the retinal vessels develop. Persistent or failed ...

Unser Protokoll bietet sowohl in vivo- als auch ex vivo-Maßnahmen zur Visualisierung und Charakterisierung der hyaloiden Vaskulatur im Auge als nützliches experimentelles Modell zur Untersuchung der vaskulären Regression. Diese Technik kombiniert sowohl in vivo Längsbeobachtung von Hyaloidgefäßen in lebenden Mäusen als auch ex vivo Visualisierung und genaue Quantifizierung von sezierten ganzen Hyaloidgefäßen. Unsere Technik bietet eine praktische und praktikable Methode zur Untersuchung der Pathogenese und der grundlegenden Mechanismen der persistenten fetalen Vaskulatur.Diese Methode bietet auch Einblicke in zelluläre und molekulare Mechanismen, die an der Regulation der okularen Gefäßregression beteiligt sind, die für die Angiogeneseforschung in anderen Organen relevant sein können. Die Hyaloid-Isolationsschritte können für Anfänger technisch eine Herausforderung darstellen. Viel Übung und Geduld werden dazu beitragen, eine erfolgreiche Sektion zu gewährleisten.Die Visualisierung dieser Methode bietet detaillierte praktische Informationen und Tipps zur Technik, die den Betrachtern dabei helfen kann, die Fähigkeiten effizienter zu beherrschen. Passen Sie für die optische Kohärenztomographie oder OCT-Bildgebung die Maus und die Sonde so an, dass sich der optische Nervenkopf in der Mitte des Gesichtsfeldes im Fundusbild befindet, und passen Sie den Fokus und den Winkel der angegebenen Linie in der OCT-Bildgebungssoftware an, um die persistenten Hyaloidgefäße zu enthüllen, bevor Sie Bilder erhalten. Passen Sie bei der Fundusfluorescein-Angiographie der Hyaloidgefäße die Ausrichtung leicht an, um den Sehnervenkopf in der Mitte des Sichtfeldes zu positionieren, und ändern Sie den Mikroskopfilter in einen grünen Fluoreszenzkanal.Konzentrieren Sie sich dann auf die persistenten Hyaloidgefäße und erhalten Sie mehrere Bilder bei einer, drei, fünf und 10 Minuten nach der Injektion, um den besten Zeitpunkt für das Signal-Hintergrund-Verhältnis für die Beobachtung der Gefäße zu bestimmen. Für ex vivo hyaloid Gefäßsektion und Visualisierung verwenden Mikrochirurgie Zangen, um die Augenlider einer postnatalen Tag-acht-Maus zu öffnen und bogenförmige Mikrochirurgie Zangen unter dem Globus in der Umlaufbahn eines Auges zu platzieren, um den Sehnerv zu greifen, ohne den Augapfel zu drücken. Ziehen und entfernen Sie den Augapfel vorsichtig mit Zangen und fixieren Sie das Auge in 4%Paraformaldehyd bei Raumtemperatur.Nach 30 Minuten die fixierten Augäpfel unter einem Seziermikroskop auf eiskaltes PBS übertragen und 50 Mikroliter Gelatinelösung in den Glaskörper des Augapfels an vier verschiedenen gleichmäßig verteilten Stellen um den Limbus injizieren. Dann bebrüten Sie den Augapfel für 30 Minuten auf Eis, um die injizierte Gelatine im Glaskörperraum zu erstarren. Wenn die Gelatine ausgehärtet hat, übertragen Sie den Augapfel auf eine Petrischale von PBS unter dem Sezieren Mikroskop und verwenden Sie Mikrochirurgie-Schere, um einen Schnitt am Limbus zu machen, um die Hornhaut zu entfernen.Schnippen und entfernen Sie den Sehnerv unter dem Sezieren des Mikroskops. Mit zwei Paarzangen abziehen und entsorgen die Sklera, Aderhaut und retinale Pigment epithel schichten, gefolgt von der Entfernung der Iris. Mit der Sehnervseite der Netzhaut nach oben und den Linsen nach unten, injizieren 50 Mikroliter PBS direkt unter der Netzhauttasse, um die Ansammlung der PBS zwischen dem gelatinierten Glaskörper und der Netzhaut zu ermöglichen.Verwenden Sie Mikrochirurgie Zangen, um die Netzhaut Tasse und Ziliarkörper sanft aus dem Glaskörper zu schälen. Übertragen Sie mit einer Transferpipetten den Gelatinenbecher mit dem in PBS eingetauchten Hyaloidgewebe auf ein Mikroskopschlitten. Und drehen Sie die restlichen Gewebe um, so dass die Linse nach oben gerichtet ist.Dann heben Sie die Linse und lockern Sie sanft die Verbindung zwischen der Linse tunica vasculosa lentis und der Vasa hyaloidea propria, bevor Sie die Hyaloidarterie mit der Mikrochirurgieschere schneiden, um die Linse Tunica vasculosa lentis zu entfernen. Bewahren Sie die Vasa hyaloidea propria Region des Hyaloidbechers für die flache Halterung auf. Für die flache Montage des Hyaloidgefäßes spülen Proben den Hyaloidbecher vorsichtig mit frischem PBS ab, um zerseten Schmutz zu entfernen.Mit dem in PBS schwebenden Gewebe verwenden Mikrochirurgie Zangen, um die Position des gelatinierten Hyaloidbechers sanft anzuordnen und anzupassen, so dass der Rand des Bechers nach unten gerichtet ist. Legen Sie die Rutsche mit dem in PBS eingetauchten Hyaloidbecher auf einen Gleitwärmer bei 37 Grad Celsius. Nachdem die Gelatine schmilzt und die Hyaloidabflachungen entfernen Sie die Rutsche, wenn es kaum trocken ist und fügen Sie einen Tropfen Anti-Fade-Montagemedium mit DAPI, um die Kerne in den Hyaloidgefäßen zu färben.Legen Sie dann vorsichtig einen Deckelrutsch auf das Hyaloid, um die flache Halterung zu vervollständigen. Um die DAPI-Färbung der Hyaloidgefäße abzubilden, wird die montierte Probe auf die Bühne eines Fluoreszenzmikroskops übertragen und bestätigen, dass die zentrale Hyaloidarterie sichtbar ist. Identifizieren Sie dann die Gefäßzweige, die direkt von der Hyaloidarterie abgeleitet sind, und zählen Sie manuell die Anzahl der Gefäßzweige für die Quantifizierung.Hier werden Querschnittsansichten von OCT-Bildern für die Netzhaut und Hyaloidgewebe in drei Monate altem Wildtyp und low-density Lipoprotein-Rezeptor-bezogenen Protein enoder oder LRP5 Knockout-Mäusen, einem Tiermodell mit persistenten Hyaloidgefäßen, gezeigt. In diesen Fundus fluorescein angiography werden Bilder von persistenten Hyaloidgefäßen acht Zweige von Hyaloidgefäßen im Glaskörper von sechs Wochen alten Knockout-Mäusen beobachtet, während bei wildlebenden Tieren des gleichen Alters kein Überbleibsel der Hyaloidgefäße beobachtet wird. In diesen hyaloiden Gefäß-Flach-Mounts können die Gefäßzellen und die zugehörigen Makrophagen durch ihre nukleare DAPI-Färbung identifiziert werden.Und jede Zelllinie, die sich von der zentralen Hyaloidarterie verzweigt, stellt ein Gefäß der Vasa hyaloidea propria dar. Wildtyp-Mäuse haben durchschnittlich 12 Zweige von Hyaloidgefäßen am postnatalen Tag acht, während altersgerechte LRP5-Knockout-Welpen etwa 25 Zweige von Hyaloidgefäßen aufweisen, die eine signifikant beeinträchtigte Regression der Hyaloidvaskulatur zeigen. Darüber hinaus wird eine verzögerte und unvollständige Retina-Gefäßentwicklung auch bei LRP5 Knockout Welpen beobachtet.Tatsächlich können Hyaloidgefäße noch in Querschnitten von LRP5-Knockout-Augengewebeabschnitten am postnatalen Tag acht identifiziert werden. Während die wilden Typ augen diese Gefäße nicht mehr zeigen. Das Wichtigste, was man sich merken sollte, ist, sanft und geduldig zu sein, wenn man das Hyaloidsystem von der Netzhaut und anderen Augengeweben isoliert.Nach der Isolierung der Hyaloidgefäße kann eine Immunfärbung mit verschiedenen Zellmarkern durchgeführt werden, um die zellulären Wechselwirkungen aufzudecken, die die Hyaloid-Regression regulieren. Diese Technik untersucht die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen der persistenten fetalen Vaskulatur in der okulären Angiogeneseforschung. Paraformaldehyd, Ketamin und Xylazin sind gefährlich.Bitte bereiten Sie diese Reagenzien in einer chemischen Rauchhaube mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung vor.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used techniques require killing of the animals and postmortem recovery of the meal1,2. This approach prevents longitudinal studies to determine changes in gastric emptying with age and progression of disease. The commonly used [13C]-octanoic acid breath test for humans3 has been modified for use in mice4-6 and rats7 and we previously showed that this test is reliable and responsive to changes in gastric emptying in response to drugs and during diabetic disease progression8. In this video presentation the principle and practical implementation of this modified test is explained. As in the previous study, NOD LtJ mice are used, a model of type 1 diabetes9. A proportion of these mice develop the symptoms of gastroparesis, a complication of diabetes characterized by delayed gastric emptying without mechanical obstruction of the stomach10.
This paper demonstrates how to train the mice for testing, how to prepare the test meal and obtain 4 hr gastric emptying data and how to analyze the obtained data. The carbon isotope analyzer used in the present study is suitable for the automatic sampling of the air samples from up to 12 mice at the same time. This technique allows the longitudinal follow-up of gastric emptying from larger groups of mice with diabetes or other long-standing diseases.

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Determination of gastric emptying with a non-invasive [13C]-octanoic acid breath test for tracking gastroparesis in female NOD LtJ mice.

Beurteilung der Magenentleerung in Non-adipösen diabetischen Mäusen mit a [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-Octansäure Atemtest

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Forschung

Medizin

Echocardiographic Assessment of the Right Heart in Mice

Transgenic and toxic models of pulmonary arterial hypertension (PAH) are widely used to study the pathophysiology of PAH and to investigate potential therapies. Given the expense and time involved in creating animal models of disease, it is critical that researchers have tools to accurately assess phenotypic expression of disease. Right ventricular dysfunction is the major manifestation of pulmonary hypertension. Echocardiography is the mainstay of the noninvasive assessment of right ventricular function in rodent models and has the advantage of clear translation to humans in whom the same tool is used. Published echocardiography protocols in murine models of PAH are lacking.
In this article, we describe a protocol for assessing RV and pulmonary vascular function in a mouse model of PAH with a dominant negative BMPRII mutation; however, this protocol is applicable to any diseases affecting the pulmonary vasculature or right heart. We provide a detailed description of animal preparation, image acquisition and hemodynamic calculation of stroke volume, cardiac output and an estimate of pulmonary artery pressure.

This article provides a protocol for the echocardiographic assessment of right ventricular size and pulmonary hypertension in mice. Applications include phenotype determination and serial assessment in transgenic and toxin-induced mouse models of cardiomyopathy and pulmonary vascular disease.

Echokardiographische Beurteilung des rechten Herzens bei Mäusen

Transgenic and toxic models of pulmonary arterial hypertension (PAH) are widely used to study the pathophysiology of PAH and to investigate potential ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Halsschlagader Infusionen für pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Analyse von Taxanen in Mäusen

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy. 
During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS). 
The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography. 
The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

Ultraschall Basierend Beurteilung der koronaren Herzfluss und koronare Flussreserve Mit der Drucküberlastung Modell an der Maus

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Echocardiographic Approaches and Protocols for Comprehensive Phenotypic Characterization of Valvular Heart Disease in Mice

The aim of this manuscript and accompanying video is to provide an overview of the methods and approaches used for imaging heart valve function in rodents, with detailed descriptions of the appropriate methods for anesthesia, the echocardiographic windows used, the imaging planes and probe orientations for image acquisition, the methods for data analysis, and the limitations of emerging technologies for the evaluation of cardiac and valvular function. Importantly, we also highlight several future areas of research in cardiac and heart valve imaging that may be leveraged to gain insights into the pathogenesis of valve disease in preclinical animal models. We propose that using a systematic approach to evaluating cardiac and heart valve function in mice can result in more robust and reproducible data, as well as facilitate the discovery of previously underappreciated phenotypes in genetically-altered and/or physiologically-stressed mice.

This protocol provides a detailed description of the echocardiographic approach for comprehensive phenotyping of heart and heart valve function in mice.

Echokardiographische Ansätze und Protokolle für die umfassende phänotypischen Charakterisierung von Herzklappenerkrankungen bei Mäusen

The aim of this manuscript and accompanying video is to provide an overview of the methods and approaches used for imaging heart valve function in ...

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to non-invasively assess some features of the respiratory function in humans as well as in laboratory animals. The present article focuses on the application of the double-chamber plethysmography (DCP) in small animals. It provides background information on the methodology as well as a detailed step-by-step procedure to successfully assess respiratory function in conscious, spontaneously breathing animals in a non-invasive manner. The DCP can be used to monitor the respiratory function of multiple animals in parallel, as well as to identify changes induced by aerosolized substances over a chosen time period and in a repeated manner. Experiments on control and allergic mice are used herein to demonstrate the utility of the technique, explain the associated outcome parameters, as well as to discuss the related advantages and shortcomings. Overall, the DCP provides valid and theoretically sound readouts that can be trusted to evaluate the respiratory function of conscious small animals both at baseline and after challenges with aerosolized substances.

The objective of the present article is to provide a detailed description of the recommended procedures to evaluate respiratory function in conscious mice by double-chamber plethysmography.

Beurteilung der Atemfunktion in bewusste Mäuse durch Doppel-Kammer-Plethysmographie

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to ...

Non-invasive Assessment of Dorsiflexor Muscle Function in Mice

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively affect skeletal muscle. This can result in a loss of muscle mass (atrophy) and/or loss of muscle quality (reduced force per unit of muscle mass), both of which are prevalent in chronic disease, muscle-specific disease, immobilization, and aging (sarcopenia). Skeletal muscle function in animals can be evaluated by a range of different tests. All tests have limitations related to the physiological testing environment, and the selection of a specific test often depends on the nature of the experiments. Here, we describe an in vivo, non-invasive technique involving a helpful and easy assessment of force frequency-curve (FFC) in mice that can be performed on the same animal over time. This permits monitoring of disease progression and/or efficacy&#160;of a potential therapeutic treatment.

Measurement of rodent skeletal muscle contractile function is a useful tool that can be used to track disease progression as well as efficacy of therapeutic intervention. We describe here the non-invasive, in vivo assessment of the dorsiflexor muscles that can be repeated over time in the same mouse.

Nicht-invasive Beurteilung des releveurs Muskelfunktion bei Mäusen

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively ...

Induction and Characterization of Pulmonary Hypertension in Mice using the Hypoxia/SU5416 Model

Pulmonary Hypertension (PH) is a pathophysiological condition, defined by a mean pulmonary arterial pressure exceeding 25 mm Hg at rest, as assessed by right heart&#160;catheterization. A broad spectrum of diseases can lead to PH, differing in their etiology, histopathology, clinical presentation, prognosis, and response to&#160;treatment. Despite significant progress in the last years, PH remains an uncured disease. Understanding the underlying mechanisms can pave the way for the development of new therapies. Animal models are important research tools to achieve this goal. Currently, there are several models available for recapitulating PH. This protocol describes a two-hit mouse PH model. The stimuli for PH development are hypoxia and the injection of SU5416, a vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor antagonist. Three weeks after initiation of Hypoxia/SU5416, animals develop pulmonary vascular remodeling imitating the histopathological changes observed in human PH (predominantly Group 1). Vascular remodeling in the pulmonary circulation results in the remodeling of the right&#160;ventricle (RV). The procedures for measuring RV pressures (using the open chest method), the morphometrical analyses of the RV (by dissecting and weighing both cardiac ventricles) and the histological assessments of the remodeling (both pulmonary by assessing vascular remodeling and cardiac by assessing RV cardiomyocyte hypertrophy and fibrosis) are described in detail. The advantages of this protocol are the possibility of the application both in wild type and in genetically modified mice, the relatively easy and low-cost implementation, and the quick development of the disease of interest (3 weeks). Limitations of this method are that mice do not develop a severe phenotype and PH is reversible upon return to normoxia. Prevention, as well as therapy studies, can easily be implemented in this model, without the necessity of advanced skills (as opposed to surgical rodent models).

This protocol describes the induction of pulmonary hypertension (PH) in mice based on the exposure to hypoxia and the injection of a VEGF receptor antagonist. The animals develop PH and right ventricular (RV) hypertrophy 3 weeks after the initiation of the protocol. The functional and morphometrical characterization of the model is also presented.

Induktion und Charakterisierung der pulmonalen Hypertonie bei Mäusen mit dem Hypoxia/SU5416-Modell

Pulmonary Hypertension (PH) is a pathophysiological condition, defined by a mean pulmonary arterial pressure exceeding 25 mm Hg at rest, as assessed by ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. However, the evaluation of right ventricular pressure (RVP) and pulmonary artery pressure (PAP) remains technically challenging in mice. RVP and PAP are more difficult to measure than left ventricular pressure because of the anatomical differences between the left and right heart systems. In this paper, we describe a stable right heart hemodynamic measurement method and its validation using healthy and PAH mice. This method is based on open-chest surgery and mechanical ventilation support. It is a complicated procedure compared to closed chest procedures. While a well-trained surgeon is required for this surgery, the advantage of this procedure is that it can generate both RVP and PAP parameters at the same time, so it is a preferable procedure for the evaluation of PAH models.

Here, we present a protocol to perform an invasive hemodynamic assessment of the right ventricle and pulmonary artery in mice using an open-chest surgery approach.

Invasive hämodynamische Beurteilung des rechten ventrikulären Systems und Hypoxie-induzierte pulmonale arterielle Hypertonie bei Mäusen

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated with an increased survival rate and greater quality of patient&#8217;s life when compared to conventional dialysis. Regrettably, transplantology suffers from a lack of reliable methods for organ quality assessment. Standard diagnostic techniques are limited to macroscopic appearance inspection or invasive tissue biopsy, which do not provide comprehensive information about the graft. The proposed protocol aims to introduce solid phase microextraction (SPME) as an ideal analytical method for comprehensive metabolomics and lipidomic analysis of all low molecular compounds present in kidneys allocated for transplantation. The small size of the SPME probe enables performance of a chemical biopsy, which enables extraction of metabolites directly from the organ without any tissue collection. The minimum invasiveness of the method permits execution of multiple analyses over time: directly after organ harvesting, during its preservation, and immediately after revascularization at the recipient&#8217;s body. It is hypothesized that the combination of this novel sampling method with a high-resolution mass spectrometer will allow for discrimination of a set of characteristic compounds that could serve as biological markers of graft quality and indicators of possible development of organ dysfunction.

The protocol presents utilization of the chemical biopsy approach followed by comprehensive metabolomic and lipidomic analysis for quality assessment of kidney grafts allocated for transplantation.

Verwendung einer chemischen Biopsie zur Graft-Qualitätsbewertung

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...