Name: assessment and characterization of hyaloid vessels in mice
Uploaded: 2019-05-15T13:30:00
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이 작품은 J.C. Z.W.에 국립 보건원 (NIH) 보조금 (R01 EY024963 및 EY028100)에 의해 지원되었다 기사단 눈 재단 경력 스타터 그랜트에 의해 지원되었다. 이 연구에서 설명한 히알로이드 격리 절차는 리처드 랭 박사, 쿠리하라 도시히데, 로이스 스미스 박사가 아낌없이 공유한 프로토콜의 수정으로 조정되었으며, 저자들은 감사하게 생각합니다.

모든 동물은 국립보건원의 지침에 따라 안과 및 동물 실험에 대한 시력 연구에 대한 비전 및 안과학 연구 협회 (ARVO) 성명서에 따라 치료되었습니다. NIH) 보스턴 아동 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 규정 된 실험 절차 및 규정에 대한 동물의 관리 및 사용에 관한. LRP5-/- 마우스 (재고 번호 005823; 잭슨 연구소) 및 그것의 야생 형 (WT) 제어 C57BL/6J 마우스 (재고 번호 0...

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히알로이드 혈관을 평가하고 특성화하는 기술은 동물 모델에서 히알로이드 혈관 회귀를 관찰하는 직관적이고 필요한 절차이며, 개발 중 혈관 회귀의 기초가 되는 메커니즘에 대한 연구를 허용합니다. 생체 내 망막 이미징은 동일한 동물에서 히알로이드 회귀의 세로 관찰을 허용하는 반면, OCT 및 FFA를 위한 설치류 안저 이미징 시스템에 대한 접근은 제한 요인이 될 수 있다. 추가적인 추가, 살아있...

눈의 혈액 공급은 망막과 주변 안구 조직의 정상적인 발달을 보장하고 적절한 시각 기능을 갖추는 데 필수적입니다. 눈에는 망막 혈관, 코로이드 및 히알로이드 혈관의 일시적인 배아 순환 네트워크의 세 가지 혈관 침대가 있습니다. 안구 혈관의 발달은 배아 발생 및 조직 성숙을 통해 공간적 및 시간적 조정을 필요로 합니다. 3개의 혈관 침대 중, 히알로이드 혈관 구조는 새로 형성된 배아 렌즈 및 발달 망막에 영양과 산소를 공급하는 첫번째 기능성 혈액 공급 시스템입니다. 히알로이드 혈관은 망막 혈관구조가 발달하고 성숙하는 동시에 회귀1. 히알라이드 혈관 구조의 회귀는 시각 기능의 발달을위한 명확한 시각적 경로를 허용하는 중추적 인; 따라서, 이 혈관 회귀 과정은 망막 혈관구조의 성장만큼 중요합니다. 히알로이드 회귀가 손상되어 안과 질환으로 이어질 수 있습니다. 더욱이, 히알로이드 혈관의 회귀는 다른 기관의 혈관신생 조절에 영향을 미칠 수 있는 혈관 회귀의 조절에 관여하는 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 모델 시스템을 제공한다.
히알로이드 동맥 (HA)에서 파생 된 히알로이드 혈관 구조는 바사 히알로 아이디어 프로피아 (VHP), 튜니카 혈관로사 렌티스 (TVL), 및 동공 막 (PM)으로 구성됩니다. 그것은 발달 망막에 영양을 제공합니다, 기본 유리체, 배아개발 동안 렌즈 2. HA에서 발생하는 VHP는 유리체를 통해 렌즈에 전방으로 분기합니다. TVL은 렌즈 캡슐의 후방 표면을 컵, 그리고 PM에 해부학, 이는 렌즈의 전방 표면을 덮고, 전방 섬모 동맥에 연결2,3,PM에 혈관의 네트워크의 형성의 결과 3개 , 4개 , 5. 흥미롭게도, 히알로이드 혈관 구조에는 정맥이 없으며, 시스템은 정맥 배수를 달성하기 위해 경피 정맥을 사용합니다.
인간 배아에서, 히알로이드 혈관 구조는 임신의 대략 9 주에 거의 완료되고 첫번째 망막 혈관이 나타날 때, 임신 2의 4달 도중 회귀하기 시작합니다. VHP의 위축으로 시작하여, TVL의 모세관 네트워크의 회귀, PM, 마지막으로, HA는 이후에2,3. 한편, 1차 유리체 후퇴 및 이차 유리체는 콜라겐 섬유를 포함하는 세포외 매트릭스 성분으로 구성된 형성되기 시작한다. 임신 6개월이 되면, 1차 유리체는 시신경 디스크에서 렌즈로 이어지는 작은 투명 운하로 감소되며, 클로케의 운하 또는 히알로이드 운하라고 불리며, 이차 유리체는 후방 세그먼트의 주성분이 됩니다. 2개 , 3. 히알로이드 순환은 출생 직전 인 임신 35 주에서36 주까지 주로 사라집니다 3.
히알로이드 혈관 구조가 출생 시 완전히 회귀되는 인간과 달리 마우스 히알로이드 혈관 시스템은 출생 후 퇴보하기 시작합니다. 마우스 망막이 태어난 혈관과 망막 혈관이 산후적으로 발달함에 따라, 히알로이드 혈관은 산후 일 (P) 4에서 동시에 회귀하고 대부분 P21 6에 의해 완전히 회귀됩니다 (그림 1). PM은 P10과 P12 사이에서 먼저 사라지고, VHP는 P12와 P16 사이에서 사라지고, 소수의 TVL 및 HA 세포는 P16에서도 남아 있고, P21에 의해히알로이드 혈관 시스템 회귀는 거의 완료된다 6. 그 동안, 망막 혈관은 출생 후에 발달하기 시작합니다. 혈관 신경총의 표면 층은 P7-P8에서 말초 망막으로 완전히 확장되며, 깊은 층 (외부 플렉시폼 층에 위치)은 P7-P12에서 발생하며, 마지막으로 내부 플렉시폼 층의 중간 신경총은 P12와 P15 7 사이에서 발생합니다. . 망막 혈관구조가 발달함에 따라 히알로이드 혈관을 회귀시키는 기능을 점차 대체하여 발달하는 눈에 영양과 산소를 제공합니다. 마우스에서 히알로이드 혈관 회귀의 출생 후 발생은 히알로이드 혈관을 관찰하고 연구할 수 있는 쉽게 접근할 수 있는 실험 모델을 제공하며, 생리학적 및 생리적 및 병리학 적 조건8.
히알로이드 회귀의 실패는 PHPV와 같은 질병에서 볼 수 있는데, 이는 배아, 1차 유리체 및 히알로이드 혈관구조의 실패 또는 불완전한 회귀로 인한눈의 드문 선천성 발달 변칙이다 9. 히알로이드 혈관 구조의 회귀 과정을 조절하는 메커니즘은 복잡하고 광범위하게 연구됩니다. 히알로이드 혈관의 정상적인 회귀에 필수적인 하나의 주요 분자 경로는 Wnt 신호 통로10이며,이 경로에서 의 유전 적 돌연변이가 Wnt 리간드 및 수용체 모두에 영향을 미치는 인간9에서PHPV와 연결되었기 때문이다. 실험 연구는 Wnt 리간드를 확인, Wnt7b, 이는이 회귀 과정을 중재하기 위해 개발 눈에서 히알로이드 혈관 주위 의 대식세포에 의해 생성되는. Wnt7b는 인접한 내피 세포에서 수용체 곱슬곱슬4(FZD4)/LRP5와 결합하여 Wnt 신호를 활성화시켜 세포 세포 사멸을 개시하고, 히알로이드혈관(10)의회귀로 이어집니다. 그 결과, Wnt7b-결핍마우스는 히알로이드혈관(10)의지속성을 나타낸다. 유사하게, 비전통적인 Wnt 리간드, 노린(Ndp 유전자에 의해 인코딩됨)은 또한 개발 중에 히알로이드 혈관 회귀를 유도하기 위해 FZD4/LRP5에 결합한다. Ndpy/-- Lrp5-/-및 Fzd4-/- 마우스 는 모두 히알로이드 혈관 회귀를 연기하고 Wnt 신호11,12의중요한 규제 역할을 지원합니다. 13,14,15,16. 더욱이, 또 다른 Wnt 코수용체 LRP6는 히알로이드 혈관 내피 세포에서 Wnt 신호 화 경로를 조절하는그들의 기능에서 LRP5와 겹친다(17). 또한 히알로이드 회귀에 기여할 수 있는 그밖 요인은 저산소증 유도인자18,19,혈관 내피 성장 인자20,21,교원질-1822, 23,Arf24,혈관포이에틴-225,및 골 형태유전학 단백질-426. 이 논문에서는 Lrp5-/- 마우스를 지속적인 히알로이드 혈관의 모델로 사용하여 생체 내 및 생체 내 방법 모두를 통해 히알로이드 혈관을 평가하고 특성화하는 기술을 입증합니다.
생체 내 히알로이드 혈관 구조의 시각화와 생체 내 생체 내 생체 내 혈관 구조는 히알라로이드 혈관 회귀의 메커니즘을 연구하는 데 필수적입니다. 현재 히알라이드 혈관구조를 관찰하는 방법은 주로 OCT 및 FFA 이미지, 눈 단면 및 히알로이드 플랫 마운트를 통해 VHP 및 HA를 시각화하고 분석하는 데 중점을 둡니다. OCT와 FFA는 생체 내 이미징 도구에서 강력하여 눈을 뜨고 살아있는 동물의 세로 관찰을 허용합니다. 더욱이, 분리된 히알로이드 플랫 마운트는 전체 히알로이드 혈관구조의 시각화및 혈관 수의 정확한 정량화를 달성하는 수단을 제공한다. 그러나 히알로이드 용기의 섬세하고 깨지기 쉬운 특성과 그 고립의 결과로 인한 기술적 어려움은 다소 눈 연구에서 그 사용을 제한 했을 수 있습니다10,17,27. 이 논문에서는, 우리는 이러한 기술의 타당성을 향상시키기 위해 생체 내 살아있는 망막 이미징 및 ex 생체 외 분리 히알로이드 플랫 마운트를 모두 결합하여 히알로이드 혈관의 시각화에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 살아있는 안저스 및 OCT 이미징(28)의 생체 내 방법 및 분리된 히알로이드 플랫마운트(11)의생체내 방법에 대한 이전 간행물들로부터의 수정 및 확장에 적응되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:997px;" width="998">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">AK-Fluor (fluorescein injection, USP)</td>
			<td style="width:191px;">Akorn</td>
			<td style="width:156px;">17478-253-10</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Anti-CD31 antibody</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:156px;">ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Antifade mounting medium</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:156px;">S2828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:156px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Artificial tear eyedrop</td>
			<td style="width:191px;">Systane</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">C57BL/6J mice</td>
			<td style="width:191px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:156px;">Stock NO: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Cryostat</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:156px;">CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Cryostat</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:156px;">CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop</td>
			<td>Cyclomydril</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">G9382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:156px;">A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating board</td>
			<td style="width:191px;">Lab-Line Instruments Inc.</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Isolectin GS-IB4, 594 conjugate</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:156px;">I21413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td style="width:191px;">KetaVed</td>
			<td style="width:156px;">NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Lrp5-/- mice</td>
			<td style="width:191px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:156px;">Stock NO. 005823</td>
			<td>Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Micron IV and OCT</td>
			<td style="width:191px;">Phoenix Research Labs</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td>Imaging software: InSight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microscope</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:156px;">discovery v8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microsurgery forceps</td>
			<td style="width:191px;">Scanlan International</td>
			<td style="width:156px;">4004-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microsurgery scissors</td>
			<td style="width:191px;">Scanlan International</td>
			<td style="width:156px;">6006-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Optimal cutting temperature compound</td>
			<td style="width:191px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:156px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Optimal cutting temperature compound</td>
			<td style="width:191px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:156px;">AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Electron&#160;Microscopy&#160;Sciences</td>
			<td style="width:156px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds)</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:156px;">12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X)</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:156px;">P0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Slide cover glass</td>
			<td style="width:191px;">Premiere</td>
			<td style="width:156px;">94-2222-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost microscope slides&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:156px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Xylazine sterile solution</td>
			<td style="width:191px;">Akorn: AnaSed</td>
			<td style="width:156px;">NDC: 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment and characterization of hyaloid vessels in mice

눈에, 배아 히알로이드 혈관은 망막 혈관이 발전할 때 개발 렌즈및 망막및 회귀에 영양을 공급합니다. 히알라이드 혈관의 지속적 또는 실패한 회귀는 지속적인 과소 플라스틱 1 차 유리체 (PHPV)와 같은 질병에서 볼 수 있으며, 방해된 빛 경로 및 시각 기능 장애를 초래합니다. 히알로이드 혈관 회귀의 근본적인 메커니즘을 이해하면 혈관 회귀 과정에 대한 새로운 분자 통찰력과 지속적인 히알로이드 혈관으로 질병을 관리하는 새로운 방법을 얻을 수 있습니다. 여기에서 우리는 광학 일관성 단층 촬영 (OCT) 및 안저 플루오레세인 혈관 조영술 (FFA)를 가진 살아있는 마우스에 있는 화상 진찰 히알로이드를 위한 절차 및 정량 분석을 위한 격리 및 평면 장착 hyaloid ex vivo의 상세한 기술 프로토콜을 기술합니다. 저밀도 지단백 수용체 관련 단백질 5(LRP5) 녹아웃 마우스는 지속적인 히알로이드 혈관의 실험 모델로서, 기술을 설명하기 위해 사용하였다. 함께, 이러한 기술은 지속적인 히알로이드 혈관의 메커니즘에 대한 혈관 회귀 및 연구의 실험 모델로서 히알로이드 혈관의 철저한 평가를 용이하게 할 수 있다.

살아있는 마우스에 있는 히알라로이드 혈관의 생체 내 화상 진찰 그림 3 A는 3개월 된 WT및 Lrp5마우스에서망막 및 히알로이드 조직에 대한 OCT 이미지의 단면 뷰를 보여 주며, 지속적인 히알로이드를 가진 동물 모델입니다. WT 눈은 히알로이드 조직의 부재를 나타내고, Lrp5-/-눈은 시신경 머리에서 파생된 두 개의 지속적?...

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Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice

이 프로토콜은 생체 내 및 생체 내 생체 내 방법 모두, 마우스 눈의 혈관 회귀 모델인 히알로이드 혈관을 완전히 시각화하고 특성화하는 방법, 실시간 이미징 및 ex 생체 내 생체 내 생체 내 혈관 조영술을 위한 광학 일관성 단층 촬영 및 안저 플루오레세인 혈관 조영술을 사용하여 설명합니다. 정량 분석을 위한 히알로이드의 격리 및 후속 플랫 마운트.

쥐에서 히알로이드 혈관의 평가 및 특성화

In the eye, the embryonic hyaloid vessels nourish the developing lens and retina and regress when the retinal vessels develop. Persistent or failed ...

당사의 프로토콜은 혈관 회귀를 연구하기 위한 유용한 실험 모델로 서눈 내의 히알로이드 혈관을 시각화하고 특성화하기 위한 생체 내 및 전 생체 내 측정값을 모두 제공합니다. 이 기술은 살아있는 마우스와 전 생체 시각화 및 해부된 전체 hyaloid 용기의 정확한 정량화를 통해 히알로이드 용기의 생체 내 세로 관측을 결합합니다. 우리의 기술은 지속적인 태아 혈관의 병기 및 기초 기계장치를 연구하기 위한 실용적이고 실행 가능한 방법을 제공합니다.이 방법은 또한 그밖 기관에 있는 혈관신생 연구를 위해 관련있을 수 있는 안구 혈관 회귀의 규칙에 관련되었던 세포 및 분자 기계장치에 통찰력을 제공합니다. hyaloid 절연 단계는 초보자를 위한 기술적으로 도전적일 지도 모릅니다. 많은 연습과 인내심이 성공적인 해부를 보장하는 데 도움이 될 것입니다.이 방법을 시각화하면 시청자가 기술을 보다 효율적으로 마스터하는 데 도움이 될 수 있는 기술에 대한 자세한 실습 정보와 팁을 제공합니다. 광학 일관성 단층 촬영 또는 OCT 이미징의 경우, 마우스와 프로브를 조정하여 광학 신경 헤드가 fundus 이미지의 시야 중심에 있도록 조정하고 OCT 이미징 소프트웨어에서 표시된 선의 초점과 각도를 조정하여 이미지를 얻기 전에 지속적인 hyaloid 용기를 드러냅니다. hyaloid 용기의 fundus 형광 혈관 학화상 화상 진찰의 경우, 시신경 헤드를 시야 의 중심에 배치하고 현미경 필터를 녹색 형광 채널로 변경하도록 정렬을 약간 조정합니다.그런 다음 지속적인 hyaloid 용기에 초점을 맞추고 혈관을 관찰하기 위한 신호 대 배경 비율에 가장 적합한 시간 지점을 결정하기 위해 1, 3, 5 및 10 분 후 사사 에서 여러 이미지를 얻습니다. 전 생체 효로이드 용기 해부 및 시각화의 경우 미세 수술 집게를 사용하여 산후 8 마우스의 눈꺼풀을 열고 한쪽 눈의 궤도에 곡면 미세 수술 포셉을 배치하여 안구를 압박하지 않고 시신경을 파악합니다. 집게로 안구를 부드럽게 당기고 제거하고 실온에서 4 %의 파라 포름알데히드로 눈을 고정시십시오.30분 후 해부 현미경하에서 고정 안구를 얼음-차가운 PBS로 옮기고 50마이크로리터의 젤라틴 용액을 안구의 유리체 체내에 주입하여 림푸스 주변의 4개의 고르게 간격을 둔 부위에 주입한다. 그런 다음 얼음에 안구를 30분 동안 배양하여 유리체 공간 내에서 주입된 젤라틴을 고화시화합니다. 젤라틴이 해부 현미경하에서 PBS의 페트리 접시에 안구를 전달하고 미세 수술 가위를 사용하여 각막을 제거하기 위해 림푸스에서 절개를 합니다.해부 현미경으로 시신경을 잘라내고 제거합니다. 두 쌍의 집게를 사용하여 껍질을 벗기고 조각, 레티날 안료 상피 층을 버리고 홍채를 제거합니다. 망막의 시신경 측면이 위로 향하고 렌즈가 아래로 향하고, 젤라틴 유리체 몸과 망막 사이에 PBS의 축적을 허용하기 위해 망막 컵 바로 아래에 PBS의 50 마이크로 리터를 주입.미세 수술 집게를 사용하여 유리체 몸에서 망막 컵과 섬모 체를 부드럽게 벗깁니다. PBS에 침지된 히알로이드 조직을 함유한 젤라틴 컵을 현미경 슬라이드로 이송파이프를 이체한다. 그리고 렌즈가 향하고 있도록 나머지 조직을 뒤집어.그런 다음 렌즈를 들어 올리고 렌즈 튜니카 바스쿠로사 렌티스와 바사 히알로아이디어 프로프리아 사이의 연결을 부드럽게 느슨하게 한 후 미세 수술 가위로 히알로이드 동맥을 절단하여 렌즈 튜니카 바스쿠로사 렌티스를 제거합니다. 플랫 마운트용 히알로이드 컵의 바사 히알로이트 프로프리아 영역을 보관하십시오. hyaloid 용기 샘플의 평평한 장착을 위해 hyaloid 컵을 신선한 PBS로 부드럽게 헹구어 해부 파편을 제거합니다.PBS에 떠있는 조직으로 부드럽게 배열하고 컵의 테두리가 아래로 향하고 있도록 젤라틴 히알로이드 컵의 위치를 조정하기 위해 미세 수술 집게를 사용합니다. PBS에 침지된 히알로이드 컵과 함께 슬라이드를 섭씨 37도의 슬라이드 워머에 놓습니다. 젤라틴이 녹은 후 히알로이드 플랫텐은 간신히 건조할 때 슬라이드를 제거하고 다피와 함께 페이드 장착 배지한 방울을 첨가하여 히알로이드 용기에 핵을 얼룩지게 한다.그런 다음 히알로이드에 커버슬립을 부드럽게 놓아 플랫 마운트를 완성합니다. 히알로이드 용기의 DAPI 염색을 이미지화하기 위해 탑재된 샘플을 형광 현미경의 단계로 옮기고 중앙 히알로이드 동맥이 보이는지 확인한다. 그런 다음 hyaloid 동맥에서 직접 파생된 혈관 가지를 식별하고 정량화를 위해 선박 분기 수를 수동으로 계산합니다.여기서, 3개월 된 야생형 및 저밀도 지단백 수용체 관련 단백질 5 또는 LRP5 녹아웃 마우스, 지속적인 히알로이드 혈관을 가진 동물 모델인 망막 및 히알로이드 조직을 위한 OCT 이미지의 단면전이 도시되어 있다. 이러한 fundus 형광소 혈관에서 지속적인 히알로이드 혈관의 8가지 분지는 6주 된 녹아웃 마우스의 유리체 체내에서 관찰되며, 히알로이드 용기의 잔재는 같은 시대의 야생동물에서 관찰되지 않는다. 이러한 hyaloid 용기에서 플랫 마운트 혈관 세포 및 관련 대식세포는 핵 DAPI 염색에 의해 식별 될 수있다.그리고 중앙 히알로이드 동맥에서 분기 세포의 각 라인은 vasa hyaloidea propria의 하나의 혈관을 나타냅니다. 야생형 마우스는 8일째산후산기에는 평균 12개의 히알로이드 혈관을 가지고 있으며, 연령일치LRP5 녹아웃 새끼는 효로이드 혈관의 회귀가 현저히 손상된 회귀를 보여주는 효노이드 혈관 의 약 25가지를 전시합니다. 또한 LRP5 녹아웃 새끼에서도 지연되고 불완전한 망막 혈관 발달이 관찰됩니다.실제로, hyaloid 혈관은 아직도 산후 8일에 LRP5 녹아웃 눈 조직 단면의 단면에서 확인될 수 있습니다. 야생 형 눈은 더 이상 이러한 혈관을 표시하지 않는 반면. 기억해야 할 가장 중요한 것은 망막 및 기타 안구 조직에서 히알로이드 시스템을 분리할 때 부드럽고 인내심을 가지는 것입니다.다른 세포 마커로 면역 염색하는 히알로이드 혈관을 분리한 후 히알로이드 회귀를 조절하는 세포 상호 작용을 밝히기 위해 수행될 수 있다. 이 기술은 안구 혈관 신생 연구에서 지속적인 태아 혈관의 기본 세포 및 분자 메커니즘을 탐구합니다. 파라포름알데히드, 케타민, 자일라진은 위험합니다.적절한 개인 보호 장비를 사용하여 화학 연기 후드로 이러한 시약을 준비하십시오.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used techniques require killing of the animals and postmortem recovery of the meal1,2. This approach prevents longitudinal studies to determine changes in gastric emptying with age and progression of disease. The commonly used [13C]-octanoic acid breath test for humans3 has been modified for use in mice4-6 and rats7 and we previously showed that this test is reliable and responsive to changes in gastric emptying in response to drugs and during diabetic disease progression8. In this video presentation the principle and practical implementation of this modified test is explained. As in the previous study, NOD LtJ mice are used, a model of type 1 diabetes9. A proportion of these mice develop the symptoms of gastroparesis, a complication of diabetes characterized by delayed gastric emptying without mechanical obstruction of the stomach10.
This paper demonstrates how to train the mice for testing, how to prepare the test meal and obtain 4 hr gastric emptying data and how to analyze the obtained data. The carbon isotope analyzer used in the present study is suitable for the automatic sampling of the air samples from up to 12 mice at the same time. This technique allows the longitudinal follow-up of gastric emptying from larger groups of mice with diabetes or other long-standing diseases.

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Determination of gastric emptying with a non-invasive [13C]-octanoic acid breath test for tracking gastroparesis in female NOD LtJ mice.

를 사용하여 비 비만 당뇨병 마우스의 위 비우는의 평가 [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-octanoic 산성 호흡 시험

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

연구

의학

Echocardiographic Assessment of the Right Heart in Mice

Transgenic and toxic models of pulmonary arterial hypertension (PAH) are widely used to study the pathophysiology of PAH and to investigate potential therapies. Given the expense and time involved in creating animal models of disease, it is critical that researchers have tools to accurately assess phenotypic expression of disease. Right ventricular dysfunction is the major manifestation of pulmonary hypertension. Echocardiography is the mainstay of the noninvasive assessment of right ventricular function in rodent models and has the advantage of clear translation to humans in whom the same tool is used. Published echocardiography protocols in murine models of PAH are lacking.
In this article, we describe a protocol for assessing RV and pulmonary vascular function in a mouse model of PAH with a dominant negative BMPRII mutation; however, this protocol is applicable to any diseases affecting the pulmonary vasculature or right heart. We provide a detailed description of animal preparation, image acquisition and hemodynamic calculation of stroke volume, cardiac output and an estimate of pulmonary artery pressure.

This article provides a protocol for the echocardiographic assessment of right ventricular size and pulmonary hypertension in mice. Applications include phenotype determination and serial assessment in transgenic and toxin-induced mouse models of cardiomyopathy and pulmonary vascular disease.

마우스의 오른쪽 심장의 심 초음파 평가

Transgenic and toxic models of pulmonary arterial hypertension (PAH) are widely used to study the pathophysiology of PAH and to investigate potential ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

마우스의 탁산의 약동학 및 약력 학적 분석을위한 경동맥 팅크

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy. 
During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS). 
The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography. 
The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

마우스의 압력 과부하 모델을 사용하여 관상 동맥 흐름 및 관상 동맥 흐름 준비 제도 이사회의 초음파를 바탕으로 평가

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Echocardiographic Approaches and Protocols for Comprehensive Phenotypic Characterization of Valvular Heart Disease in Mice

The aim of this manuscript and accompanying video is to provide an overview of the methods and approaches used for imaging heart valve function in rodents, with detailed descriptions of the appropriate methods for anesthesia, the echocardiographic windows used, the imaging planes and probe orientations for image acquisition, the methods for data analysis, and the limitations of emerging technologies for the evaluation of cardiac and valvular function. Importantly, we also highlight several future areas of research in cardiac and heart valve imaging that may be leveraged to gain insights into the pathogenesis of valve disease in preclinical animal models. We propose that using a systematic approach to evaluating cardiac and heart valve function in mice can result in more robust and reproducible data, as well as facilitate the discovery of previously underappreciated phenotypes in genetically-altered and/or physiologically-stressed mice.

This protocol provides a detailed description of the echocardiographic approach for comprehensive phenotyping of heart and heart valve function in mice.

마우스의 심장 판막 질환의 종합 표현형 특성에 대한 심 초음파 접근 및 프로토콜

The aim of this manuscript and accompanying video is to provide an overview of the methods and approaches used for imaging heart valve function in ...

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to non-invasively assess some features of the respiratory function in humans as well as in laboratory animals. The present article focuses on the application of the double-chamber plethysmography (DCP) in small animals. It provides background information on the methodology as well as a detailed step-by-step procedure to successfully assess respiratory function in conscious, spontaneously breathing animals in a non-invasive manner. The DCP can be used to monitor the respiratory function of multiple animals in parallel, as well as to identify changes induced by aerosolized substances over a chosen time period and in a repeated manner. Experiments on control and allergic mice are used herein to demonstrate the utility of the technique, explain the associated outcome parameters, as well as to discuss the related advantages and shortcomings. Overall, the DCP provides valid and theoretically sound readouts that can be trusted to evaluate the respiratory function of conscious small animals both at baseline and after challenges with aerosolized substances.

The objective of the present article is to provide a detailed description of the recommended procedures to evaluate respiratory function in conscious mice by double-chamber plethysmography.

더블 챔버 Plethysmography 여 의식 생쥐에 호흡기 기능의 평가

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to ...

Non-invasive Assessment of Dorsiflexor Muscle Function in Mice

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively affect skeletal muscle. This can result in a loss of muscle mass (atrophy) and/or loss of muscle quality (reduced force per unit of muscle mass), both of which are prevalent in chronic disease, muscle-specific disease, immobilization, and aging (sarcopenia). Skeletal muscle function in animals can be evaluated by a range of different tests. All tests have limitations related to the physiological testing environment, and the selection of a specific test often depends on the nature of the experiments. Here, we describe an in vivo, non-invasive technique involving a helpful and easy assessment of force frequency-curve (FFC) in mice that can be performed on the same animal over time. This permits monitoring of disease progression and/or efficacy&#160;of a potential therapeutic treatment.

Measurement of rodent skeletal muscle contractile function is a useful tool that can be used to track disease progression as well as efficacy of therapeutic intervention. We describe here the non-invasive, in vivo assessment of the dorsiflexor muscles that can be repeated over time in the same mouse.

비-침략 적 쥐에서 Dorsiflexor 근육 기능 평가

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively ...

Induction and Characterization of Pulmonary Hypertension in Mice using the Hypoxia/SU5416 Model

Pulmonary Hypertension (PH) is a pathophysiological condition, defined by a mean pulmonary arterial pressure exceeding 25 mm Hg at rest, as assessed by right heart&#160;catheterization. A broad spectrum of diseases can lead to PH, differing in their etiology, histopathology, clinical presentation, prognosis, and response to&#160;treatment. Despite significant progress in the last years, PH remains an uncured disease. Understanding the underlying mechanisms can pave the way for the development of new therapies. Animal models are important research tools to achieve this goal. Currently, there are several models available for recapitulating PH. This protocol describes a two-hit mouse PH model. The stimuli for PH development are hypoxia and the injection of SU5416, a vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor antagonist. Three weeks after initiation of Hypoxia/SU5416, animals develop pulmonary vascular remodeling imitating the histopathological changes observed in human PH (predominantly Group 1). Vascular remodeling in the pulmonary circulation results in the remodeling of the right&#160;ventricle (RV). The procedures for measuring RV pressures (using the open chest method), the morphometrical analyses of the RV (by dissecting and weighing both cardiac ventricles) and the histological assessments of the remodeling (both pulmonary by assessing vascular remodeling and cardiac by assessing RV cardiomyocyte hypertrophy and fibrosis) are described in detail. The advantages of this protocol are the possibility of the application both in wild type and in genetically modified mice, the relatively easy and low-cost implementation, and the quick development of the disease of interest (3 weeks). Limitations of this method are that mice do not develop a severe phenotype and PH is reversible upon return to normoxia. Prevention, as well as therapy studies, can easily be implemented in this model, without the necessity of advanced skills (as opposed to surgical rodent models).

This protocol describes the induction of pulmonary hypertension (PH) in mice based on the exposure to hypoxia and the injection of a VEGF receptor antagonist. The animals develop PH and right ventricular (RV) hypertrophy 3 weeks after the initiation of the protocol. The functional and morphometrical characterization of the model is also presented.

저산소증/SU5416 모델을 사용하여 마우스에서 폐 고혈압의 유도 및 특성화

Pulmonary Hypertension (PH) is a pathophysiological condition, defined by a mean pulmonary arterial pressure exceeding 25 mm Hg at rest, as assessed by ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. However, the evaluation of right ventricular pressure (RVP) and pulmonary artery pressure (PAP) remains technically challenging in mice. RVP and PAP are more difficult to measure than left ventricular pressure because of the anatomical differences between the left and right heart systems. In this paper, we describe a stable right heart hemodynamic measurement method and its validation using healthy and PAH mice. This method is based on open-chest surgery and mechanical ventilation support. It is a complicated procedure compared to closed chest procedures. While a well-trained surgeon is required for this surgery, the advantage of this procedure is that it can generate both RVP and PAP parameters at the same time, so it is a preferable procedure for the evaluation of PAH models.

Here, we present a protocol to perform an invasive hemodynamic assessment of the right ventricle and pulmonary artery in mice using an open-chest surgery approach.

마우스에 있는 우심실 시스템 및 저산소증 유도된 폐 동맥 고혈압을 위한 침략적인 혈역학 평가

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated with an increased survival rate and greater quality of patient&#8217;s life when compared to conventional dialysis. Regrettably, transplantology suffers from a lack of reliable methods for organ quality assessment. Standard diagnostic techniques are limited to macroscopic appearance inspection or invasive tissue biopsy, which do not provide comprehensive information about the graft. The proposed protocol aims to introduce solid phase microextraction (SPME) as an ideal analytical method for comprehensive metabolomics and lipidomic analysis of all low molecular compounds present in kidneys allocated for transplantation. The small size of the SPME probe enables performance of a chemical biopsy, which enables extraction of metabolites directly from the organ without any tissue collection. The minimum invasiveness of the method permits execution of multiple analyses over time: directly after organ harvesting, during its preservation, and immediately after revascularization at the recipient&#8217;s body. It is hypothesized that the combination of this novel sampling method with a high-resolution mass spectrometer will allow for discrimination of a set of characteristic compounds that could serve as biological markers of graft quality and indicators of possible development of organ dysfunction.

The protocol presents utilization of the chemical biopsy approach followed by comprehensive metabolomic and lipidomic analysis for quality assessment of kidney grafts allocated for transplantation.

이식 품질 평가를 위해 화학 생검 사용

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...