Name: assessment and characterization of hyaloid vessels in mice
Uploaded: 2019-05-15T13:30:00
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Este trabajo fue apoyado por las becas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (R01 EY024963 y EY028100) a J.C. Z.W. contó con el apoyo de una beca de iniciación profesional de la Knights Templar Eye Foundation. El procedimiento de aislamiento hialoide descrito en este estudio fue adaptado con la modificación de protocolos generosamente compartidos por los doctores Richard Lang, Toshihide Kurihara y Lois Smith, a quienes los autores están agradecidos.

Todos los animales fueron tratados de acuerdo con la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el Uso de Animales en La Investigación Oftálmica y de La Visión para experimentos con animales, siguiendo las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud ( NIH) con respecto al cuidado y uso de animales para procedimientos experimentales y las regulaciones establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Boston Children's Hospital. ...

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	<li>Lutty, G. A., McLeod, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+hyaloid,+choroidal+and+retinal+vasculatures+in+the+fetal+human+eye.">Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).</li><li>Anand-Apte, B., Hollyfield, J., Besharse, J., Bok, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+anatomy+of+the+retinal+and+choroidal+vasculature.">Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature.</a> The Retina and its Disorders. , (2011).</li><li>Hobbs, R. P., Hartnett, M. E., Hartnett, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2:+The+hyaloidal+vasculature+and+its+role+in+development.">Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development.</a> Pediatric Retina: Second Edition. , (2013).</li><li>Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+retinal+vasculature.">Development of the retinal vasculature.</a> Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).</li><li>Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+pathology+of+the+hyaloid,+choroidal+and+retinal+vasculature.">Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).</li><li>Ito, M., Yoshioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+the+hyaloid+vessels+and+pupillary+membrane+of+the+mouse.">Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse.</a> Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).</li><li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+retina+as+an+angiogenesis+model.">The mouse retina as an angiogenesis model.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).</li><li>Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ocular+angiogenesis:+from+development+to+pathologies.">Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies.</a> FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).</li><li>Shastry, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+hyperplastic+primary+vitreous:+congenital+malformation+of+the+eye.">Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).</li><li>Lobov, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNT7b+mediates+macrophage-induced+programmed+cell+death+in+patterning+of+the+vasculature.">WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature.</a> Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).</li><li>Kato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cbfa1-independent+decrease+in+osteoblast+proliferation,+osteopenia,+and+persistent+embryonic+eye+vascularization+in+mice+deficient+in+Lrp5,+a+Wnt+coreceptor.">Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).</li><li>Xia, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+familial+exudative+vitreoretinopathy+caused+by+LPR5+mutations.">A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations.</a> Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+development+in+the+retina+and+inner+ear:+control+by+Norrin+and+Frizzled-4,+a+high-affinity+ligand-receptor+pair.">Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair.</a> Cell. 116 (6), 883-895 (2004).</li><li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norrin,+frizzled-4,+and+Lrp5+signaling+in+endothelial+cells+controls+a+genetic+program+for+retinal+vascularization.">Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization.</a> Cell. 139 (2), 285-298 (2009).</li><li>Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norrie+gene+product+is+necessary+for+regression+of+hyaloid+vessels.">Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+expression+of+Wnt-pathway+mediated+genes+in+low-density+lipoprotein+receptor-related+protein+5+(Lrp5)+knockout+mice.">Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice.</a> PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).</li><li>Nayak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+vascular+regression+is+regulated+by+a+Wnt/beta-catenin,+MYC+and+CDKN1A+pathway+that+controls+cell+proliferation+and+cell+death.">Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death.</a> Development. 145 (12), (2018).</li><li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+pVHL+and+HIF-alpha+isoforms+are+required+for+embryonic-to-adult+vascular+transition+in+the+eye.">Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye.</a> The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).</li><li>Huang, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+HIF-1alpha+partially+rescues+the+abnormal+hyaloid+vascular+system+in+Cited2+conditional+knockout+mouse+eyes.">Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes.</a> Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).</li><li>Yoshikawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regression+of+hyaloid+vasculature+is+triggered+by+neurons.">Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).</li><li>Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+VEGF-A+in+lens+development:+formation+of+the+hyaloid+capillary+network+and+protection+against+transient+nuclear+cataracts.">The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts.</a> Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).</li><li>Hurskainen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+maturation+of+the+retinal+vasculature+in+type+XVIII+collagen/endostatin+deficient+mice+and+changes+in+retinal+glial+cells+due+to+lack+of+collagen+types+XV+and+XVIII.">Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII.</a> FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).</li><li>Fukai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+collagen+XVIII/endostatin+results+in+eye+abnormalities.">Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities.</a> The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).</li><li>McKeller, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arf+tumor+suppressor+gene+promotes+hyaloid+vascular+regression+during+mouse+eye+development.">The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).</li><li>Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2+plays+an+important+role+in+retinal+angiogenesis.">Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis.</a> Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).</li><li>Chang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficient+Bmp4+ocular+phenotypes+include+anterior+segment+dysgenesis+with+elevated+intraocular+pressure.">Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure.</a> BMC Genetics. 2, 18 (2001).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+Activation+of+Wnt+Signaling+by+Lithium+Normalizes+Retinal+Vasculature+in+a+Murine+Model+of+Familial+Exudative+Vitreoretinopathy.">Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy.</a> The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+Image-Guided+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization+Model+in+Mice.">Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).</li><li>Kishimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+characteristics+of+regressing+vessels+in+the+hyaloid+vascular+system+of+neonatal+mice:+Novel+implication+for+vascular+atrophy.">Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy.</a> Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).</li><li>Lang, R. A., Bishop, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+cell+death+and+tissue+remodeling+in+the+developing+mouse+eye.">Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye.</a> Cell. 74 (3), 453-462 (1993).</li><li>Riazifar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterization+of+Bst+/-+mouse+retina.">Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).</li></ol>

Las técnicas para evaluar y caracterizar los vasos hialoides son procedimientos intuitivos y necesarios para observar la regresión del vaso hialoide en modelos animales, para permitir estudios sobre los mecanismos subyacentes a la regresión vascular durante el desarrollo. Si bien la imagen retiniana in vivo permite la observación longitudinal de la regresión hialoides en el mismo animal, el acceso a un sistema de imágenes de fondos para roedores para LA OCT y la FFA puede ser un factor limitante. Además, la toma d...

El suministro de sangre en el ojo es esencial para asegurar el desarrollo normal de la retina y los tejidos oculares circundantes y para equipar una función visual adecuada. Hay tres camas vasculares en el ojo: la vasculatura de la retina, la coroides y una red circulatoria embrionaria transitoria de vasos hialoides. El desarrollo de la vasculatura ocular requiere coordinación espacial y temporal a lo largo de la embriogénesis y la maduración de tejidos. Entre las tres camas vasculares, la vasculatura hialoide es el primer sistema funcional de suministro de sangre que proporciona nutrición y oxígeno a la lente embrionaria recién formada y la retina en desarrollo. Los vasos hialoides retroceden al mismo tiempo que las vasculaturas de la retina se desarrollan y maduran1. La regresión de la vasculatura hialoide es fundamental para permitir una vía visual clara para el desarrollo de la función visual; por lo tanto, este proceso de regresión vascular es tan importante como el crecimiento de la vasculatura de la retina. La regresión hialide deteriorada puede conducir a enfermedades oculares. Además, la regresión de los vasos hialoides proporciona un sistema modelo para investigar los mecanismos celulares y moleculares involucrados en la regulación de la regresión vascular, que puede tener implicaciones para la regulación angiogénica en otros órganos también.
La vasculatura hialoide, derivada de la arteria hiloide (HA), se compone de vasa hyaloidea propria (VHP), tunica vasculosa lentis (TVL), y membrana pupilar (PM). Proporciona nutrición a la retina en desarrollo, el vítreoprimario y la lente durante el desarrollo embrionario 2. A partir de la HA, VHP se ramifica anteriormente a través del vítreo a la lente. El TVL copa la superficie posterior de la cápsula de la lente, y anastomosas a la PM, que se conecta a las arterias ciliares anteriores, cubriendo la superficie anterior de la lente2,3, lo que resulta en la formación de una red de vasos en el PM 3 , 4 , 5. Curiosamente, no hay venas en la vasculatura hialoides, y el sistema hace uso de venas coroidas para lograr el drenaje venoso.
En el embrión humano, la vasculatura hialoide está casi completa aproximadamente a la novena semana de gestación ycomienza a retroceder cuando aparecen los primeros vasos retinianos, durante el cuarto mes de gestación 2. Comenzando con la atrofia del VHP, regresión de las redes capilares dela TVL, el PM, y por último, la HA se produce posteriormente 2,3. Mientras tanto, el vítreo primario se retrae y el vítreo secundario comienza a formarse, compuesto por los componentes de la matriz extracelular, incluyendo fibras de colágeno. Para el sexto mes de gestación, el vítreo primario se reduce a un pequeño canal transparente que se extiende desde el disco nervioso óptico hasta la lente, llamado canal o canal hiloide del Cloquet, y el vítreo secundario se convierte en el componente principal del segmento posterior 2 , 3. La circulación hialoides desaparece sobre todo a 35 a 36 semanas de gestación, justo antes del nacimiento3.
A diferencia de los seres humanos, en los que la vasculatura hialoide está completamente regresiva al nacer, el sistema vascular hialoide del ratón comienza a retroceder después del nacimiento. A medida que la retina del ratón nace avascular y los vasos retinianos se desarrollan postnatalmente, los vasos hialoides retroceden simultáneamente desde el día postnatal (P) 4 y son en su mayoría completamente regresivos por P216 (Figura1). El PM desaparece primero entre P10 y P12, y el VHP desaparece entre P12 y P16, mientras que un pequeño número de células TVL yHA permanecen incluso en P16, y para P21 la regresión del sistema vascular hialoide es casi completa 6. Mientras tanto, la vasculatura de la retina comienza a desarrollarse después del nacimiento. La capa superficial del plexo vascular se extiende completamente a la retina periférica en P7–P8, la capa profunda (ubicada en la capa plexiforme externa) se desarrolla a partir de P7–P12, y finalmente, el plexo intermedio en la capa plexiforme interna se desarrolla entre P12 y P157 . A medida que se desarrolla la vasculatura de la retina, reemplaza gradualmente la función de retroceder concomitantemente los vasos hialoides, proporcionando nutrición y oxígeno al ojo en desarrollo. La ocurrencia postnatal de la regresión del vaso hialoide en ratones proporciona un modelo experimental de fácil acceso para observar y estudiar la vasculatura hialoides, así como la base molecular que rige los procesos de regresión vascular bajo la condiciones patológicas8.
El fracaso de la regresión hialoides se puede ver en enfermedades como el PHPV, que es una rara anomalía congénita del desarrollo del ojo resultante deuna regresión fallida o incompleta de la vasculatura embrionaria, vítrea primaria e hialoides 9. Los mecanismos que regulan el proceso de regresión de la vasculatura hialoides son complicados y ampliamente estudiados. Una vía molecular importante esencial para la regresión normal de los vasos hialoides es la vía de señalización Wnt10,yaque las mutaciones genéticas en esta vía que afectan tanto al ligando Wnt como a los receptores se han relacionado con el VPH en los seres humanos 9. Estudios experimentales identificaron un ligando Wnt, Wnt7b, que es producido por macrófagos alrededor de los vasos hialoides en el ojo en desarrollo para mediar este proceso de regresión. Wnt7b activa la señalización Wnt mediante la unión con los receptores frizzled4 (FZD4)/LRP5 en células endoteliales adyacentes para iniciar la apoptosis celular, lo que conduce a la regresión de los vasos hialoides10. Como resultado, los ratones Wnt7b-deficientes muestran una persistencia de los vasos hialoide10. Del mismo modo, un ligando Wnt no convencional, Norrin (codificado por el gen Ndp), también se une a FZD4/LRP5 para inducir la regresión del vaso hiloide durante el desarrollo. Los ratones Ndpy/-, Lrp5-/-y Fzd4-/- muestran regresión pospuesta del recipiente hiloide, apoyando un papel regulador crítico de la señalización Wnt11,12, 13,14,15,16. Por otra parte, otro coreceptor Wnt LRP6 se superpone con LRP5 en su función de modulación de la vía de señalización Wnt en células endoteliales vasculares hialoide17. Otros factores que también pueden contribuir a la regresión hialoide incluyen el factor hipoxia-inducible18,19, factor de crecimiento endotelial vascular20,21, colágeno-1822, 23, Arf24, angiopoietin-225, y proteína morfogenética ósea-426. En este artículo, utilizamos ratones Lrp5-/- como modelo de vasos hialoide persistentes para demostrar las técnicas de evaluación y caracterización de la vasculatura hialoides a través de métodos in vivo y ex vivo.
La visualización de la vasculatura hialoide in vivo y ex vivo es esencial para estudiar los mecanismos de regresión de los vasos hialoides. Los métodos actuales para observar la vasculatura hialoide se centran principalmente en visualizar y analizar el VHP y HA, a través de imágenes OCT y FFA, secciones transversales oculares y el montaje plano hialoide. OCT y FFA son potentes herramientas de imagen in vivo, que permiten la observación longitudinal en animales vivos después de que han abierto los ojos. Además, el montaje plano hialoide aislado proporciona la visualización de toda la vasculatura hialoide y un medio para lograr una cuantificación precisa del número de recipientes. Sin embargo, la naturaleza delicada y frágil de los vasos hialoidey y las dificultades técnicas resultantes de su aislamiento pueden haber limitado su uso en la investigación ocular un poco10,17,27. En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado de la visualización de vasos hialoides, combinando imágenes retinianas en vivo in vivo y montaje plano hialoide aislado ex vivo para mejorar la viabilidad de estas técnicas. Este protocolo ha sido adaptado con la modificación y ampliación de publicaciones anteriores sobre el método in vivo de fondo en vivo y pTU imagen28 y el método ex vivo de montaje plano hialoide aislado11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:997px;" width="998">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">AK-Fluor (fluorescein injection, USP)</td>
			<td style="width:191px;">Akorn</td>
			<td style="width:156px;">17478-253-10</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Anti-CD31 antibody</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:156px;">ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Antifade mounting medium</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:156px;">S2828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:156px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Artificial tear eyedrop</td>
			<td style="width:191px;">Systane</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">C57BL/6J mice</td>
			<td style="width:191px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:156px;">Stock NO: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Cryostat</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:156px;">CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Cryostat</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:156px;">CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop</td>
			<td>Cyclomydril</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">G9382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:156px;">A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating board</td>
			<td style="width:191px;">Lab-Line Instruments Inc.</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Isolectin GS-IB4, 594 conjugate</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:156px;">I21413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td style="width:191px;">KetaVed</td>
			<td style="width:156px;">NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Lrp5-/- mice</td>
			<td style="width:191px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:156px;">Stock NO. 005823</td>
			<td>Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Micron IV and OCT</td>
			<td style="width:191px;">Phoenix Research Labs</td>
			<td style="width:156px;">N/A</td>
			<td>Imaging software: InSight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microscope</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:156px;">discovery v8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microsurgery forceps</td>
			<td style="width:191px;">Scanlan International</td>
			<td style="width:156px;">4004-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microsurgery scissors</td>
			<td style="width:191px;">Scanlan International</td>
			<td style="width:156px;">6006-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Optimal cutting temperature compound</td>
			<td style="width:191px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:156px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Optimal cutting temperature compound</td>
			<td style="width:191px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:156px;">AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Electron&#160;Microscopy&#160;Sciences</td>
			<td style="width:156px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds)</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:156px;">12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X)</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:156px;">P0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Slide cover glass</td>
			<td style="width:191px;">Premiere</td>
			<td style="width:156px;">94-2222-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost microscope slides&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:156px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Xylazine sterile solution</td>
			<td style="width:191px;">Akorn: AnaSed</td>
			<td style="width:156px;">NDC: 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment and characterization of hyaloid vessels in mice

En el ojo, los vasos hialoides embrionarios nutren la lente en desarrollo y la retina y retroceden cuando se desarrollan los vasos retinianos. La regresión persistente o fallida de los vasos hialoidese se puede ver en enfermedades como el vítreo primario hiperplásico persistente (PHPV), lo que conduce a una trayectoria de luz obstruida y a una función visual deteriorada. Comprender los mecanismos subyacentes a la regresión del vaso hialoide puede conducir a nuevas perspectivas moleculares sobre el proceso de regresión vascular y posibles nuevas formas de manejar enfermedades con vasos hialoides persistentes. Aquí describimos los procedimientos para la toma de imágenes de hialoide en ratones vivos con tomografía de coherencia óptica (OCT) y angiografía de fundus fluoresceína (FFA) y un protocolo técnico detallado de aislar y montar hialoide ex vivo para análisis cuantitativo. Los ratones noqueadores relacionados con el receptor de lipoproteínas de baja densidad 5 (LRP5) se utilizaron como modelo experimental de vasos hialoide persistentes, para ilustrar las técnicas. Juntos, estas técnicas pueden facilitar una evaluación exhaustiva de los vasos hialoides como un modelo experimental de regresión vascular y estudios sobre el mecanismo de los vasos hiloide persistentes.

Imágenes in vivo de vasos hialoide en ratones vivos Figura 3 A revela vistas transversales de imágenes de PTU para la retina y los tejidos hialoides en ratones WT y Lrp5-/-de 3 meses de edad, un modelo animal con hiloide persistente. El ojo WT muestra la ausencia de tejido hialoide, mientras que el ojo Lrp5-/-muestra dos vasos hialoide persistentes derivados de la cabeza del nervio óptico. Fi...

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Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice Video (Video) | JoVE

Este protocolo describe métodos in vivo y ex vivo para visualizar y caracterizar completamente los vasos hialoide, un modelo de regresión vascular en los ojos del ratón, utilizando tomografía de coherencia óptica y angiografía de fundus fluoresceina para la imagen en vivo y ex vivo aislamiento y posterior montaje plano del hialoides para el análisis cuantitativo.

Evaluación y caracterización de recipientes hialoides en ratones

In the eye, the embryonic hyaloid vessels nourish the developing lens and retina and regress when the retinal vessels develop. Persistent or failed ...

Nuestro protocolo proporciona medidas in vivo y ex vivo para visualizar y caracterizar la vasculatura hialoides dentro del ojo como un modelo experimental útil para estudiar la regresión vascular. Esta técnica combina tanto la observación longitudinal in vivo de los vasos hialoides en ratones vivos como la visualización ex vivo y la cuantificación precisa de los vasos hialoides enteros diseccionados. Nuestra técnica proporciona un método práctico y factible para el estudio de la patogénesis y los mecanismos básicos de la vasculatura fetal persistente.Este método también proporciona información sobre los mecanismos celulares y moleculares implicados en la regulación de la regresión vascular ocular que puede ser relevante para la investigación de la angiogénesis en otros órganos. Los pasos de aislamiento hialoides pueden ser técnicamente desafiantes para los principiantes. Mucha práctica y paciencia ayudarán a asegurar una disección exitosa.Visualizar este método proporcionará información práctica detallada y consejos sobre la técnica que pueden ayudar a los espectadores a dominar las habilidades de manera más eficiente. Para la tomografía de coherencia óptica o la imagen de OCT, ajuste el ratón y la sonda de modo que la cabeza del nervio óptico esté en el centro del campo visual en la imagen del fondo y ajuste el enfoque y el ángulo de la línea indicada en el software de imágenes OCT para revelar los vasos hialoides persistentes antes de obtener imágenes. Para la angiografía de fluoresceína fundus de los vasos hialoides, ajuste la alineación ligeramente para colocar la cabeza del nervio óptico en el centro del campo de visión y cambie el filtro del microscopio a un canal fluorescente verde.A continuación, concéntrese en los vasos hialoides persistentes y obtenga varias imágenes en uno, tres, cinco y 10 minutos de postinyección para determinar el mejor punto de tiempo para la relación señal-fondo para observar los vasos. Para la disección y visualización de recipientes hialoides ex vivo, utilice fórceps de microcirugía para abrir los párpados de un ratón postnatal de ocho días y coloque fórceps de microcirugía curvadas debajo del globo en la órbita de un ojo para agarrar el nervio óptico sin apretar el globo ocular. Tire suavemente y retire el globo ocular con fórceps y fije el ojo en 4%paraformaldehído a temperatura ambiente.Después de 30 minutos transferir los globos oculares fijos a PBS helado bajo un microscopio de disección e inyectar 50 microlitros de solución de gelatina en el cuerpo vítreo del globo ocular en cuatro sitios separados uniformemente diferentes alrededor del limbo. Luego incubar el globo ocular sobre hielo durante 30 minutos para solidificar la gelatina inyectada dentro del espacio vítreo. Cuando la gelatina se haya curado, transfiera el globo ocular a un plato de Petri de PBS bajo el microscopio diseccionador y utilice tijeras de microcirugía para hacer una incisión en el limbo para eliminar la córnea.Cortar y extraer el nervio óptico bajo el microscopio de disección. Usando dos pares de fórceps pelar y desechar las capas de epitelio de pigmento esclero, coroides y de la retina, seguido de la eliminación del iris. Con el lado del nervio óptico de la retina hacia arriba y las lentes hacia abajo, inyecta 50 microlitros de PBS justo debajo de la copa de la retina para permitir la acumulación del PBS entre el cuerpo vítreo gelatinizado y la retina.Usa fórceps de microcirugía para pelar suavemente la copa de la retina y el cuerpo ciliar del cuerpo vítreo. Mediante una pipeta de transferencia, transfiera la copa de gelatina que contiene el tejido hialoides sumergido en PBS a un portaobjetos. Y gire los tejidos restantes para que la lente esté mirando hacia arriba.A continuación, levante la lente y afloje suavemente la conexión entre la lente tunica vasculosa lentis y la vasa hyaloidea propria antes de cortar la arteria hialoid con las tijeras de microcirugía para eliminar la lente tunica vasculosa lentis. Conservar la región vasa hyaloidea propria de la copa hialoides para el montaje plano. Para el montaje plano de las muestras del recipiente hialoides enjuague suavemente la copa hialoides con PBS fresco para eliminar cualquier residura de disección.Con el tejido flotando en PBS utilizar fórceps de microcirugía para organizar suavemente y ajustar la posición de la copa hialoides gelatinizada de modo que el borde de la copa está mirando hacia abajo. Coloque el portaobjetos con la copa hialoides sumergida en PBS en un calentador de diapositivas a 37 grados Centígrados. Después de que la gelatina se derrite y los aplanamientos hialoides retiran el deslizamiento cuando apenas está seco y añaden una gota de medio de montaje anti-fade con DAPI para manchar los núcleos en los vasos hialoides.A continuación, coloque suavemente un cubreobjetos en el hialoides para completar el soporte plano. Para imaginar la tinción DAPI de los vasos hialoides, transfiera la muestra montada a la etapa de un microscopio fluorescente y confirme que la arteria hialoides central es visible. A continuación, identifique las ramas del vaso directamente derivadas de la arteria hialoides y cuente manualmente el número de ramas de los vasos para la cuantificación.Aquí, se muestran vistas transversales de imágenes DE OCT para la retina y los tejidos hialoides en un tipo salvaje de tres meses de edad y proteína relacionada con receptores de lipoproteínas de baja densidad cinco o ratones noqueadores LRP5, un modelo animal con vasos hialoides persistentes. En estas angiografías de fluoresceína de fundente de vasos hialoides persistentes se observan ocho ramas de vasos hialoides en el cuerpo vítreo de ratones nocaut de seis semanas de edad, mientras que no se observa ningún remanente de los vasos hialoides en animales de tipo salvaje de la misma edad. En estos montajes planos de recipientes hialoides, las células vasculares y los macrófagos asociados pueden ser identificados por su tinción nuclear DAPI.Y cada línea de células que se ramifican de la arteria hialoid central representa un vaso de vasa hyaloidea propria. Los ratones de tipo salvaje tienen un promedio de 12 ramas de vasos hialoides en el día ocho postnatal, mientras que los cachorros de LRP5 que coinciden con la edad exhiben alrededor de 25 ramas de vasos hialoides que demuestran una regresión significativamente deteriorada de la vasculatura hialoides. Además, el desarrollo vascular de la retina retardado e incompleto también se observa en los cachorros de nocaut LRP5.De hecho, los vasos hialoides todavía se pueden identificar en secciones transversales de las secciones de tejido ocular knockout LRP5 en el día ocho postnatal. Mientras que los ojos de tipo salvaje ya no muestran estos vasos. Lo más importante a recordar es ser suave y paciente al aislar el sistema hialoides de la retina y otros tejidos oculares.Después de aislar los vasos hialoides se puede realizar inmunomancha con diferentes marcadores celulares para descubrir las interacciones celulares que regulan la regresión hiloide. Esta técnica explora los mecanismos celulares y moleculares subyacentes de la vasculatura fetal persistente en la investigación de la angiogénesis ocular. Paraformaldehído, ketamina y xilazina son peligrosos.Por favor, prepare estos reactivos en una campana química utilizando el equipo de protección personal adecuado.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test Video (Video) | JoVE

Evaluación del vaciamiento gástrico en ratones diabéticos no obesos mediante un [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-octanoico prueba del aliento ácido

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Induction and Characterization of Pulmonary Hypertension in Mice using the Hypoxia/SU5416 Model

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Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

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Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...