Name: important endpoints and proliferative markers to assess small intestinal injury and adaptation using a mouse model of chemotherapy-induced mucositis
Uploaded: 2019-05-12T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis at JoVE.c

Dit werk werd gesteund door een onbeperkte subsidie van het Novo Nordisk Center voor fundamenteel metabolisch onderzoek en de Stichting Lundbeck.

Alle beschreven methoden zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtsnoeren van de Deense wetgeving inzake dierproeven (1987). Studies werden uitgevoerd met toestemming van de Deense Animal experimenten inspectie (2013-15-2934-00833) en de lokale ethische commissie.
Opmerking: vrouwelijke C57BL/6J muizen (~ 20 − 25 g) werden verkregen en ondergebracht acht per kooi in standaard 12 h licht, 12 uur donkere cyclus met gratis toegang tot water en standaard Chow. Dieren werden overgelaten aan...

<ol>
	<li>Weinstein, L. D., Shoemaker, C. P., Hersh, T., Wright, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+intestinal+absorption+after+small+bowel+resection+in+man.">Enhanced intestinal absorption after small bowel resection in man.</a> The Archives of Surgery. 99 (5), 560-562 (1969).</li><li>Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+adaptation+following+massive+small+bowel+resection+in+the+mouse.">Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse.</a> Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).</li><li>Kissow, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+glucagon-like+peptide-2+(GLP-2)+prevents+chemotherapy-induced+mucositis+in+rat+small+intestine.">Exogenous glucagon-like peptide-2 (GLP-2) prevents chemotherapy-induced mucositis in rat small intestine.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 70 (1), 39-48 (2012).</li><li>Kaczmarek, A., Brinkman, B. M., Heyndrickx, L., Vandenabeele, P., Krysko, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity+of+doxorubicin-induced+small+intestinal+mucositis+is+regulated+by+the+TLR-2+and+TLR-9+pathways.">Severity of doxorubicin-induced small intestinal mucositis is regulated by the TLR-2 and TLR-9 pathways.</a> The Journal of Pathology. 226 (4), 598-608 (2012).</li><li>Pontoppidan, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+response+to+myeloablative+chemotherapy+in+piglets.">Intestinal response to myeloablative chemotherapy in piglets.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (1), 94-104 (2014).</li><li>Pontoppidan, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+gastrointestinal+toxicity,+micro+RNA+and+cytokine+production+in+patients+undergoing+myeloablative+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Associations between gastrointestinal toxicity, micro RNA and cytokine production in patients undergoing myeloablative allogeneic stem cell transplantation.</a> International Immunopharmacology. 25 (1), 180-188 (2015).</li><li>Crenn, P., Messing, B., Cynober, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrulline+as+a+biomarker+of+intestinal+failure+due+to+enterocyte+mass+reduction.">Citrulline as a biomarker of intestinal failure due to enterocyte mass reduction.</a> Clinical Nutrition. 27 (3), 328-339 (2008).</li><li>Fijlstra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactose+maldigestion+during+methotrexate-induced+gastrointestinal+mucositis+in+a+rat+model.">Lactose maldigestion during methotrexate-induced gastrointestinal mucositis in a rat model.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (2), G283-G291 (2011).</li><li>Jones, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrulline+as+a+Biomarker+in+the+Murine+Total-Body+Irradiation+Model:+Correlation+of+Circulating+and+Tissue+Citrulline+to+Small+Intestine+Epithelial+Histopathology.">Citrulline as a Biomarker in the Murine Total-Body Irradiation Model: Correlation of Circulating and Tissue Citrulline to Small Intestine Epithelial Histopathology.</a> Health Physics. 109 (5), 452-465 (2015).</li><li>Lutgens, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrulline:+a+physiologic+marker+enabling+quantitation+and+monitoring+of+epithelial+radiation-induced+small+bowel+damage.">Citrulline: a physiologic marker enabling quantitation and monitoring of epithelial radiation-induced small bowel damage.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 57 (4), 1067-1074 (2003).</li><li>Demacker, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+citrulline+measurement+using+UPLC+tandem+mass-spectrometry+to+determine+small+intestinal+enterocyte+pathology.">Plasma citrulline measurement using UPLC tandem mass-spectrometry to determine small intestinal enterocyte pathology.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (4), 387-392 (2009).</li><li>van Eijk, H. M., Rooyakkers, D. R., Deutz, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+routine+determination+of+amino+acids+in+plasma+by+high-performance+liquid+chromatography+with+a+2-3+microns+Spherisorb+ODS+II+column.">Rapid routine determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography with a 2-3 microns Spherisorb ODS II column.</a> Journal of Chromatography. 620 (1), 143-148 (1993).</li><li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ki-67+protein:+from+the+known+and+the+unknown.">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).</li><li>Khoshyomn, S., Lew, S., DeMattia, J., Singer, E. B., Penar, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+invasion+rate+measured+in+vitro+does+not+correlate+with+Ki-67+expression.">Brain tumor invasion rate measured in vitro does not correlate with Ki-67 expression.</a> Journal of Neuro-Oncology. 45 (2), 111-116 (1999).</li><li>Matatall, K. A., Kadmon, C. S., King, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Hematopoietic+Stem+Cell+Proliferation+Using+BrdU+Incorporation.">Detecting Hematopoietic Stem Cell Proliferation Using BrdU Incorporation.</a> Methods in Molecular Biology. , 91-103 (2018).</li><li>Hytting-Andreasen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+glucagon-like+peptide-+1+and+2+are+essential+for+regeneration+after+acute+intestinal+injury+in+mice.">Endogenous glucagon-like peptide- 1 and 2 are essential for regeneration after acute intestinal injury in mice.</a> PLoS One. 13 (6), e0198046 (2018).</li><li>Elliott, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide-1+(7-36)amide+and+glucose-dependent+insulinotropic+polypeptide+secretion+in+response+to+nutrient+ingestion+in+man:+acute+post-prandial+and+24-h+secretion+patterns.">Glucagon-like peptide-1 (7-36)amide and glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in response to nutrient ingestion in man: acute post-prandial and 24-h secretion patterns.</a> Journal of Endocrinology. 138 (7-36), 159-166 (1993).</li><li>Orskov, C., Wettergren, A., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+the+incretin+hormones+glucagon-like+peptide-1+and+gastric+inhibitory+polypeptide+correlates+with+insulin+secretion+in+normal+man+throughout+the+day.">Secretion of the incretin hormones glucagon-like peptide-1 and gastric inhibitory polypeptide correlates with insulin secretion in normal man throughout the day.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 31 (7), 665-670 (1996).</li><li>Drucker, D. J., Erlich, P., Asa, S. L., Brubaker, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+intestinal+epithelial+proliferation+by+glucagon-like+peptide+2.">Induction of intestinal epithelial proliferation by glucagon-like peptide 2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (15), 7911-7916 (1996).</li><li>Lee, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+murine+Glp2r+impairs+Paneth+cell+function+and+increases+susceptibility+to+small+bowel+enteritis.">Disruption of the murine Glp2r impairs Paneth cell function and increases susceptibility to small bowel enteritis.</a> Endocrinology. 153 (3), 1141-1151 (2012).</li><li>Shin, E. D., Estall, J. L., Izzo, A., Drucker, D. J., Brubaker, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+Adaptation+to+Enteral+Nutrients+is+Dependent+on+the+Physiologic+Actions+of+Glucagon-Like+Peptide-2+in+Mice.">Mucosal Adaptation to Enteral Nutrients is Dependent on the Physiologic Actions of Glucagon-Like Peptide-2 in Mice.</a> Gastroenterology. 128 (5), 1340-1353 (2005).</li><li>Tsai, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+growth-promoting+properties+of+glucagon-like+peptide-2+in+mice.">Intestinal growth-promoting properties of glucagon-like peptide-2 in mice.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (1), E77-E84 (1997).</li><li>Sangild, P. T., Shen, R. L., Pontoppidan, P., Rathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+chemotherapy-induced+mucositis:+translational+relevance+and+challenges.">Animal models of chemotherapy-induced mucositis: translational relevance and challenges.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 314 (2), G231-G246 (2017).</li><li>Gibson, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irinotecan+causes+severe+small+intestinal+damage,+as+well+as+colonic+damage,+in+the+rat+with+implanted+breast+cancer.">Irinotecan causes severe small intestinal damage, as well as colonic damage, in the rat with implanted breast cancer.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (9), 1095-1100 (2003).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cells+upregulate+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+2+and+4,+gap+junction+protein+connexin-43+and+synaptophysin+after+stroke+in+rats.">Bone marrow stromal cells upregulate expression of bone morphogenetic proteins 2 and 4, gap junction protein connexin-43 and synaptophysin after stroke in rats.</a> Neuroscience. 141 (2), 687-695 (2006).</li><li>Biebl, M., Cooper, C. M., Winkler, J., Nl Kuhn, H. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neurogenesis+and+programmed+cell+death+reveals+a+self-renewing+capacity+in+the+adult+rat+brain.">Analysis of neurogenesis and programmed cell death reveals a self-renewing capacity in the adult rat brain.</a> Neuroscience Letters. 291 (1), 17-20 (2000).</li></ol>

Hier demonstreren we een breed toegankelijke methode om SI-letsel en regeneratie in een muismodel te bestuderen. Een breed scala van preklinische dierlijke modellen van intestinale letsel bestaan, maar het is van vitaal belang dat we begrijpen dat elk model uniek is en dat de eindpunten geschikt moet zijn om de onderzoeksvraag te beantwoorden. Dit model is uitstekend om te studeren adaptieve reactie op letsel, maar de eindpunten moeten worden gewijzigd bij het gebruik van het model als een pre-klinische model van mucosit...

Intestinale adaptatie is het natuurlijke compenserende mechanisme dat optreedt wanneer de darm verloren gaat als gevolg van ziekte of chirurgie1,2. Na trauma, de darm ondergaat een Morfometrische en functionele adaptieve reactie, gekenmerkt door de proliferatie van crypte cellen en verhoogde nutriënten absorptie3. Deze stap is van cruciaal belang in herstel, maar slecht begrepen. Experimentele studies van de intestinale adaptieve respons zijn gericht op de veranderingen die zich voordoen na de kleine darm resectie bij muizen, ratten en varkens, maar inzicht in het moleculaire mechanisme achter de adaptieve respons bij andere soorten verwondingen (bijv. chemische of bacteriële) is van cruciaal belang om de identificatie van voedingsstoffen of drugs te vergemakkelijken aanpassing. Experimenteel zijn verschillende benaderingen gebruikt om de complexe moleculaire en cellulaire index van kleine intestinale pathologie te beschrijven, waaronder histopathologische scoring en het meten van de uitkomst van letsel. Desondanks is wat afwezig is in de literatuur een gedetailleerde beschrijving van het uitvoeren van de procedures die nodig zijn om reproduceerbare gegevens te verkrijgen. Bij het identificeren van factoren die betrokken zijn bij de aanpassing, zoals gut hormonen, een gemakkelijk, lage kosten, en reproduceerbare diermodel is gerechtvaardigd en hier raden wij het gebruik van een model van chemotherapie-geïnduceerde intestinale mucositis (CIM).
Een van de eenvoudigste en zeer informatieve eindpunten van zowel letsel en aanpassing is het meten van de massa van de dunne darm (SI). We weten dat een kenmerk van mucositis is apoptosis van enterocyten, tijdafhankelijke villus atrofie en verminderde mitose. Daarom is het onderzoeken van de darm morfologie zeer relevant in preklinische modellen4,5. Bij de mens, een afname van het plasma citrulline, een marker van functionerende enterocyten, correleert met toxiciteit scores en inflammatoire markers6 naast de absorptiecapaciteit7, suggereren dit aminozuur is een uitstekende biomarker van mucositis. Citrulline kan worden gemeten in zowel muizen en ratten, en heeft aangetoond uitstekende correlaties met villus lengte8, Crypt Survival9, en straling-geïnduceerde mucositis10.
Een groot voordeel van het meten van plasma citrulline is de mogelijkheid om herhaalde metingen te verzamelen van een dier. Meervoudige bloedafname bij muizen is echter beperkt tot een totaal bloed volume van 6 μL/g/week en vereist algemene anesthesie. Dit helaas ook beperkt het gebruik van citrulline metingen bij muizen. Bovendien, de meting van citrulline vereist High-Performance vloeibare chromatografie11,12, dat is kostbaar en tijdrovend. Onlangs, we hebben aangetoond dat citrulline niveaus in muizen correleren significant met SI gewicht (p < 0,001) (niet-gepubliceerde gegevens), waardoor citrulline een directe meting reflecterend enterocyten massa. Een beperking tot de meting van het SI-gewicht is de noodzaak om de muizen op te offeren en dus zijn er geen herhaalde metingen binnen dezelfde muis mogelijk. Toch biedt de methode de mogelijkheid om verschillende andere weefsel analyses uit te voeren die gericht zijn op de onderzoeksvraag, en deze feiten kunnen denkbaar zijn voor het extra gebruik van dieren. We raden daarom aan om SI-gewicht te gebruiken als een eenvoudige, goedkope en snelle biomarker voor letsel en aanpassing aan muizen. Om de reproduceerbaarheid en aanvaardbare analytische variatie te garanderen, moeten de darmen zorgvuldig worden verwijderd uit het dier, gespoeld met zout, geleegd en gedroogd vóór het wegen. In dit artikel laten we precies zien hoe deze procedure wordt uitgevoerd.
Een ander kenmerk van mucositis is het verlies van de prolifererende cellen in de crypten en een compenserende hyperproliferatie tijdens de regeneratieve periode3. De cellulaire marker Ki67 is vaak gebruikt om snelle proliferatieve cellen te bepalen door middel van immunohistochemie13. Hoewel Ki67 een eenvoudige marker van proliferatie is, heeft het een neiging tot onnauwkeurigheid omdat Ki67 aanwezig is tijdens alle actieve fasen van de celcyclus (G1, S, G2 en M)14. Specifieke etikettering is essentieel voor het opsporen van replicerende cellen, daarom stellen we voor in situ-integratie van 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU), een synthetisch analoog van thymidine, omdat het grotendeels beperkt is tot het repliceren van cellen in de S-fase15. BrdU wordt geïnjecteerd in de dieren 150 minuten voor het offeren en cellen kunnen vervolgens worden gedetecteerd met immunohistochemie met behulp van BrdU specifieke antilichamen. In deze methode artikel laten we precies zien hoe het gebied van BrdU immunopositive cellen binnen een crypte meten met behulp van een gratis beeld software.
Morfologische en functionele veranderingen worden vaak bestudeerd in 5-FU geïnduceerde mucositis modellen, waar de intestinale adaptatie wordt beoordeeld door villus hoogte en crypte diepte. Tijdens deze studie ontdekten we dat tijdens de acute fase van mucositis, die gelijk is aan de blessure fase, proliferatie gemeten door BrdU-opname niet gecorreleerd is met crypte diepte. In tegenstelling tot deze, crypte diepte is significant gecorreleerd met proliferatie gezien in de reparatiefase van mucositis, 3 tot 5 dagen na inductie. Dit suggereert dat de acute fase van mucositis niet meetbaar is door de crypte diepte alleen. We stellen voor dat bij het gebruik van proliferatie als een eindpunt in de acute fase van mucositis muizen, BrdU-opname bij voorkeur moet worden gebruikt, maar bij het kwantificeren van Hyper proliferatie in het latere stadium tijdens de regeneratieve fase, is de crypte diepte een redelijke alternatief voor de oprichting van BrdU. Het doel van deze studie was om dit model te beschrijven op een manier dat het kan worden gebruikt door alle onderzoekers, zowel op het gebied van oncologie, maar vooral onderzoekers niet bekend met intestinale schademodellen.
Het beschreven model kan worden gebruikt om fenotype transgene modellen volgens de adaptieve respons met behulp van lichaamsgewicht, SI gewicht en crypte diepte als eindpunten. Als voorbeeld laten we hier zien hoe we het model van 5-fluorouracil (5-FU) geïnduceerde mucositis hebben gebruikt in een cellulair knock-out model met onvoldoende L-cel secretie16. Glucagon-achtige peptide-1 (GLP-1) en glucagon-achtige peptide-2 (GLP-2) zijn intestinale hormonen die worden afgescheiden van de enteroendocrine L-cellen in reactie op voedselinname17,18. GLP-2 wordt erkend als een belangrijke factor voor intestinale genezing, de regulering van mucosale apoptosis en de verbetering van de barrièrefunctie van de si19,20,21,22. Op basis van de literatuur veronderstellen we dat endogene hormonen essentieel zijn voor compenserende hyperproliferatie die zich voordoet in de adaptieve reactie na letsel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Fluorouracil</td>
			<td>Hospira Nordic AB, Sweden</td>
			<td>137853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaminol&#174;Vet</td>
			<td>Merck, New Jersey, USA</td>
			<td>511485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun&#174;Vet Xylazine</td>
			<td>Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany.</td>
			<td>148999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% nautral formalin buffer</td>
			<td>Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom</td>
			<td>BAF-5000-08A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoClear</td>
			<td>National Diagnostics, United Kingdom</td>
			<td>HS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex</td>
			<td>HistoLab&#174;, Sweden</td>
			<td>840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany.</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/EDTA pH 9 buffer</td>
			<td>Thermofisher scientific, Denmark</td>
			<td>TA-125-PM4X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxide Block</td>
			<td>Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark</td>
			<td>TL-060-QHDM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Block buffer</td>
			<td>Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark</td>
			<td>TL-060-QHDM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>Thermofisher Scientific, Denmark.</td>
			<td>MA1-81890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto</td>
			<td>Thermofisher Scientific, Denmark.</td>
			<td>TA-125-ADQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark</td>
			<td>TL-060-QHDM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Quanto Substrate</td>
			<td>DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark</td>
			<td>TA-125-QHDX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Quanto Chromogen</td>
			<td>DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark</td>
			<td>TA-125-QHDX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Lite Software (Blue edition)</td>
			<td>Carl Zeiss A/S</td>
			<td></td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>LOCI, University of Wisconsin</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

important endpoints and proliferative markers to assess small intestinal injury and adaptation using a mouse model of chemotherapy-induced mucositis

Intestinale adaptatie is het natuurlijke compenserende mechanisme dat optreedt wanneer de darm verloren gaat als gevolg van trauma. De adaptieve reacties, zoals crypte celproliferatie en verhoogde nutriënten absorptie, zijn van cruciaal belang in herstel, maar slecht begrepen. Inzicht in het moleculaire mechanisme achter de adaptieve responsen is cruciaal om de identificatie van nutriënten of geneesmiddelen te vergemakkelijken om de aanpassing te verbeteren. Verschillende benaderingen en modellen zijn beschreven in de hele literatuur, maar een gedetailleerde beschrijvende manier om de procedures in wezen uit te voeren is nodig om reproduceerbare gegevens te verkrijgen. Hier beschrijven we een methode om belangrijke eindpunten en proliferatieve markers van kleine darm letsel en compenserende hyperproliferatie te schatten met behulp van een model van door chemotherapie geïnduceerde mucositis bij muizen. We demonstreren de detectie van prolifererende cellen met behulp van een celcyclus specifieke marker, evenals met behulp van kleine intestinale gewicht, crypte diepte, en villus hoogte als eindpunten. Enkele van de kritische stappen binnen de beschreven methode zijn het verwijderen en wegen van de dunne darm en het nogal complexe software systeem dat wordt voorgesteld voor de meting van deze techniek. Deze methoden hebben de voordelen dat ze niet tijdrovend zijn en dat ze kosteneffectief en gemakkelijk uit te voeren en te meten zijn.

In het eerste experiment hebben we mucositis geïnduceerd bij muizen op dag 0 en elke dag 5 opeenvolgende dagen een groep muizen opgeofferd. Bij het meten van de SI gewicht, we vonden dat deze parameter daalde van dag 2 tot dag 4 suggereren een verlies in de enterocyt massa. We constateerden ook dat het SI-gewicht op dag 5 niet significant verschilt van dag 0 (onbehandelde muizen) (Figuur 1). De proliferatie gemeten door de opname van BrdU werd bijna afgescha...

Watch this Scientific Journal Video about Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis at JoVE.c

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

Hier presenteren we een protocol voor het vaststellen van belangrijke eindpunten en proliferatieve markers van kleine intestinale letsel en compenserende hyperproliferatie met behulp van een model van chemotherapie-geïnduceerde mucositis. We demonstreren de detectie van prolifererende cellen met behulp van een celcyclus specifieke marker en met behulp van kleine intestinale gewicht, crypte diepte, en villus hoogte als eindpunten.

Belangrijke eindpunten en proliferatieve markers om kleine darm letsel en aanpassing te beoordelen met behulp van een muis model van chemotherapie-geïnduceerde Mucositis

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

Dit model van chemotherapie-geïnduceerde mucositis kan worden gebruikt om belangrijke eindpunten en vermenigvuldigde markers van kleine darmletsel en compenserende hyperproliferatie bij muizen te bepalen. Deze methode is tijd- en kostenefficiënt en eenvoudig uit te voeren. Met een gestandaardiseerde methode als deze is het gemakkelijker om analytische eindpunten te vergelijken met weinig variaties.Voor 5-Florauracil of 5FU mucositis inductie, laad een 1-milliliter spuit uitgerust met een 27 meter bij 19 millimeter naald met het juiste volume van 5FU en handmatig beperken een ontvanger muis. Met behoud van de muis in een stevige maar zachte greep, bloot de ventrale kant van het dier en steek de naald in de intraparitoneale holte in een van de onderste kwadranten van de buik. Dan, aanzuigen om de juiste naald plaatsing te garanderen en injecteren van de 5FU.Op het juiste experimentele eindpunt, 4-Bromo-Deoxyuridine of BrdU kwantificering, weeg een 5FU gewonde dierlijke muis en leveren 5 milligram per kilogram BrdU door intraperitoneale injectie in een rookkap. 150 minuten na de BrdU-injetie, bevestig een gebrek aan respons op teensnuifje, registreert u het gewicht van de verdoofde muis en plaatst u het dier in de liggende positie. Voer een laparotomie uit om de buikholte bloot te leggen en maak een incisie van de borstholte om pneumothorax te introduceren.Snijd superieur aan de pylorus, en zorgvuldig extract trekken het darmweefsel uit de buurt van het dier totdat het cecum is bereikt. Klem met tangen het proximale lumen voorzichtig dicht en gebruik een spuit van 10 milliliter uitgerust met een naald van 25 meter om de dunne darm met zout te spoelen. Plaats vervolgens de geleegde darm op schoon blotting papier om zorgvuldig te verwijderen van de overtollige zout oplossing.Voor weefselverzameling, oogst de dunne darm van het geïnjecteerde dier zoals net aangetoond en registreert het gewicht van het gespoelde weefsel. Na histologische verwerking kan het weefsel worden afgebeeld onder de 10x doelstelling van een lichtmicroscoop die is aangesloten op een camera om histologische foto's van het geoogste weefsel te verkrijgen. Als u het gebied van de BrdU-immunoactieve cellen wilt meten, opent u het beeld van interesse in afbeelding J en opent u het beeld van de fasemicrometer.Gebruik het gereedschap Rechte lijnselectie om een rechte lijn op de afbeelding van de micrometer te tekenen om een bekende afstand te definiëren en de ingestelde schaal in het analysemenu te selecteren. Voer een waarde in het bekende afstandsvak in en definieer de lengte-eenheid in het vak Lengte. Open een afbeelding van belang om het gebied van de BrdU-immunoactieve cellen per crypte te meten en stel de kleurenafbeeldingen in op 8-bits onder het menu van het afbeeldingstype.Verhoog het contrast van de afbeelding onder procesverrwaarder contrast en stel de verzadigde pixels in op 0,4%Een drempelwaarde toepassen op de afbeelding om de immunoposiviteit te segmenteren en afbeeldingsweergave te selecteren. Selecteer drempel en rood en verplaats de drempelbalk om een drempelwaarde van ongeveer 10 tot 20 procent te selecteren. Selecteer vervolgens een goed georiënteerde crypte en gebruik het gereedschap uit de vrije hand om het gebied eromheen te markeren.Als u het drempelgebied wilt meten, opent u het tabblad Analyseren en selecteert u deeltjes analyseren. Stel de grootte in het venster Deeltjes analyseren in op 20 op oneindig en klik op de pixeleenheden van het vak. Stel de circulariteit in op nul op één en stel de show in op contouren.Klik vervolgens op de weergaveresultaten, vat samen en voeg gaten op. De meetresultaten worden weergegeven in het overzichtsvenster. Als u de cryptediepte wilt meten, opent u een afbeelding in Zen Light en maakt u verbinding met de camera.Maak momentopnamen in de cameramodus met een doelstelling van 20x en schakel over naar de verwerkingsmodus om de momentopname te openen. Ga naar de metingsweergave. Gebruik de lijn tool om een lijn te starten aan de onderkant van een goed georiënteerde crypte, afwerking van de lijn aan de bovenkant van de crypte.Exporteer vervolgens de metingen en bereken het gemiddelde van de cryptediepte en vul als hoogte. Het gewicht van de dunne darm neemt af van dag 2 tot dag 4, wat wijst op een verlies in de enterocyte massa. Van belang, door dag 5, het gewicht is niet significant anders dan het gewicht van dag 0 op behandelde dieren.De gemeten proliferatie door BrdU-integratie wordt bijna afgeschaft op dag 1 en 2, maar op dag 4 en 5 zijn er respectievelijk ongeveer vier- en vijfvoudige toename van hun proliferatie. Deze hyperproliferatie wordt ook waargenomen bij het meten van de crypte diepte. In de regeneratieve fase van mucositis is er een sterke correlatie tussen BrdU-integratie en cryptediepte die niet wordt waargenomen tijdens de acute fase, wat suggereert dat het gebruik van cryptediepte als eindpunt geschikt zou kunnen zijn in de acute fase van mucositis.Transgene muizen, met een onvoldoende L-celafscheiding, vertonen een aanzienlijk verlies van lichaamsgewicht en een afname van het gewicht van de dunne darm in de herstelfase, vergeleken met die waargenomen bij wilde type 5-FU muizen. Verder, de transgene muizen niet te tonen compenserende hyperproliferatie als de crypten zijn aanzienlijk korter dan in zowel wild-type muizen en gezonde controles. Tijdens een poging deze procedure, zorg ervoor dat de dunne darm volledig leeg, en om de overtollige zoutoplossing te verwijderen voor het wegen van het weefsel om het kleine darmgewicht gewicht alleen te verkrijgen.Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe te gedrag, verzamelen, en bepalen van belangrijke eindpunten van kleine darmletsel. En om reproduceerbare gegevens effectief te verkrijgen. Vergeet niet dat het werken met chemische verbindingen zoals 5FU en BrdU gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het gebruik van een labjas, handschoenen en een rookkap altijd moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedures.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Een muismodel van vermoeidheid geïnduceerd door Peripheral Bestraling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Een genetisch ontwikkeld muis model van sporadische colorectale kanker

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Engraftment van de tumor in een muismodel van Xenograft van menselijke mantel cel lymfoom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET en MRI geleide bestraling van een Glioblastoma Rat-Model met behulp van een Micro-irradiator

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Een preklinische muismodel van osteosarcoom definiëren de extracellulaire vesikel-gemedieerde communicatie tussen Tumor en mesenchymale stamcellen

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Op lange termijn Live-cel Imaging om te beoordelen van cel lot in reactie op Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studeren Triple Negatieve Borstkanker met behulp van Orthotopische Borstkanker Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Computergebaseerde beeldanalyse gebruiken om de kwantificering van longmetastase in het 4T1 Breast Cancer Model te verbeteren

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Een muismodel om de rol van kanker-geassocieerde fibroblasten in tumorgroei te onderzoeken

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Positron Emission Tomography-based Dose Painting Radiation Therapy in a Glioblastoma Rat Model using the Small Animal Radiation Research Platform

Positronemissie Tomografie-gebaseerde dosis schilderen Bestralingstherapie in een glioblastoom rat model met behulp van het Small Animal Radiation Research Platform

A rat glioblastoma model to mimic chemo-radiation treatment of human glioblastoma in the clinic was previously established. Similar to the clinical ...