Name: compartmentalization of human stem cell-derived neurons within pre-assembled plastic microfluidic chips
Uploaded: 2019-05-03T13:00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips at JoVE.com

ويعترف المؤلفون بالدعم المقدم من Xona Microfluidics, LLC, the National Institute of Mental Health (R42 MH097377), and the National Institute of Neuro Disorders and Stroke (R41 NS108895, P30 NS045892). والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

ملاحظة: الشكل 1A،B يظهر مخطط من رقاقة COC تجميعها مسبقاً، بما في ذلك مواقع القنوات الرئيسية أو المقصورات، والآبار، وmicrogrooves. رقاقة مجزأة يمكن إنشاء البيئات الدقيقة السائلة متميزة داخل مقصورة كما يدل على ذلك من خلال عزل صبغة تلوين الغذاء (الشكل1C). يتم إعطاء بروتوكول لإعداد رقاقة متعددة المقصورة التي تم تجميعها مسبقا في Nagendran وآخرون، القسم 112.
1. طلاء رقائق متعددة المقصورة للخلايا العصبية hSC
ملاحظة: الشكل 2A يظهر نظرة عامة على إجراءات الطلاء.
<ol><li>حل بولي-L-ornithine في خلية الثقافة الصف الماء المقطر لجعل 600 درجة مئوية من الحل لكل رقاقة من 20 ميكروغرام / مل حل العمل.</li>
	<li>يستنشق ال [ببس] متبقّي يسارا بعد يعدّ الرقائق من الآبار. عند aspirating، تأكد من أن طرف pipet بعيدا عن فتح القناة. ملاحظة: يجب أن تظل القنوات microfluidic ممتلئة لكامل هذا الإجراء. لا يستنشق السائل من القنوات / المقصورات، فقط الآبار.</li>
	<li>تحميل 150 درجة مئوية من بولي-L-ornithine حل العمل في أعلى اليمين جيدا. انتظر 90 ق أو حتى السائل يبدأ لملء أسفل الحق جيدا. إضافة 150 درجة مئوية من وسائل الإعلام إلى أسفل اليمين جيدا وانتظر لمدة 5 دقائق للسماح للسائل تمر من خلال microgrooves.</li>
	<li>إضافة 150 درجة مئوية من وسائل الإعلام إلى أعلى اليسار جيدا. انتظر 90 ثانية ثم أضف 150 درجة مئوية إلى أسفل اليسار بشكل جيد. التفاف حامل رقاقة (ق) مع parafilm ومكان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. ملاحظة: بدلا من ذلك، ضع رقاقة وحامل في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.</li>
	<li>قم بإستنسخ وسائل الإعلام من الآبار، مما يضمن وضع طرف الأنابيب بعيدًا عن فتح القناة. أضف 150 ميكرو لتر من الماء المعقم إلى أعلى اليمين. انتظر 90 ثانية ثم أضف 150 درجة مئوية إلى أسفل اليمين بشكل جيد. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح للسائل بالمرور عبر الأخاديد الدقيقة.</li>
	<li>إضافة 150 درجة مئوية من الماء المعقم إلى أعلى اليسار جيدا، والانتظار 90 ثانية ثم إضافة 150 ميكرولتر أخرى إلى أسفل اليسار جيدا.</li>
	<li>كرر الخطوات 1.5 إلى 1.6.</li>
	<li>إذابة لامينين ببطء في 2 درجة مئوية إلى 8 درجة مئوية وإعداد 10 ميكروغرام / مل حل العمل.</li>
	<li>تحميل 150 درجة مئوية من حل العمل لايمينين إلى أعلى اليمين جيدا. انتظر 90 ق أو حتى السائل يبدأ لملء أسفل الحق جيدا. Pipet 150 درجة مئوية إلى أسفل اليمين جيدا. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح لللامينين بالمرور عبر الأخاديد الدقيقة.</li>
	<li>إضافة 150 درجة مئوية من اللامينين إلى أعلى اليسار جيدا. انتظر 90 ثانية ثم أضف 150 درجة مئوية إلى أسفل اليسار بشكل جيد. احتضان رقاقة داخل حاملها لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>شطف رقاقة مع PBS (دون كاليفورنيا2 + وملغ2+). تحميل 150 درجة مئوية من PBS إلى أعلى اليمين جيدا. انتظر 90 ق أو حتى السائل يبدأ لملء أسفل الحق جيدا. إضافة 150 درجة مئوية من PBS إلى أسفل اليمين جيدا وانتظر لمدة 5 دقائق للسماح PBS تذهب من خلال microgrooves.</li>
	<li>Pipet 150 درجة مئوية من PBS إلى أعلى اليسار جيدا. بعد 90 ثانية pipet 150 μL إلى أسفل اليسار جيدا.</li>
	<li>يستنشق PBS من رقاقة ومن ثم شطف رقاقة مع وسائل الإعلام NSC (انظر جدول المواد). تحميل 150 درجة مئوية من وسائل الإعلام إلى أعلى اليمين جيدا. بعد 90 ثانية أو عندما يمر السائل من خلال القناة اليمنى في أسفل اليمين جيدا، إضافة 150 درجة مئوية إلى أسفل اليمين جيدا. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح للوسائط بالتدفق من خلال الأخاديد الدقيقة.</li>
	<li>إضافة 150 درجة مئوية من وسائل الإعلام إلى أعلى اليسار جيدا وآخر 150 درجة مئوية إلى أسفل اليسار جيدا. احتضان رقاقة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لشرط مسبق رقاقة حتى على استعداد لبذور NSCs. ملاحظة: رقائق يمكن أن تكون مكيفة مسبقا بين عشية وضحاها إذا لزم الأمر.</li>
</ol>2. البذر NSCs في رقاقة متعددة المقصورة
ملاحظة: استخدم هذا البروتوكول NSCs التي تم شراؤها تجاريا، على عكس منشورنا السابق الذي بدأ مع خلايا ينبع الجنينية البشرية5. في هذا البروتوكول يتم طلاء الخلايا الجذعية العصبية مباشرة في رقائق البلاستيك حيث أنها تميز في الخلايا العصبية. يمكن السماح للخلايا بالتكاثر كـ NSCs (بدون تمييز) لمدة تصل إلى 2 ممر وتخزينها في قارورة في السائل N2 لمزيد من الاستخدام. يستخدم هذا البروتوكول قارورة NSC المخزنة في السائل N2 بعد مرور 1 أو 2. ويبين الشكل 2باء لمحة عامة عن إجراءات الطلاء.
<ol><li>ذوبان NSCs وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ملاحظة: ينطبق هذا الإجراء على NSCs المشتقة من H9. خطوط الخلايا الأخرى سوف تتطلب تحسين كثافة الخلية.</li>
	<li>عد تركيز الخلية باستخدام مقياس الهيموكيتومات وضبط باستخدام وسائل الإعلام NSC للحصول على تركيز 7 × 106 خلايا لكل مل.</li>
	<li>يستنشق وسائل الإعلام من كل بئر من رقاقة. تجنب التصاص الوسائط من القنوات الرئيسية.</li>
	<li>Pipet 5 μL من محلول الخلية إلى أعلى اليمين جيدا، تليها 5 درجة مئوية إلى أسفل اليمين جيدا (70،000 مجموع الخلايا). تأكد من أن الخلايا يتم توجيهها نحو فتحات القناة الرئيسية. استخدم مجهرًا للتحقق من دخول الخلايا إلى القناة. انتظر 5 دقائق للخلايا التمسك الجزء السفلي من رقاقة. ملاحظة: يمكن استخدام أي من المقصورات أو كليهما لتحميل الخلايا.</li>
	<li>Pipet ~ 150 درجة مئوية من وسائل الإعلام NSC إلى أعلى اليمين جيدا ثم 150 درجة مئوية إلى أسفل اليمين جيدا. كرر على الجانب الأيسر. حضانة في 5٪CO 2، 37 درجة مئوية داخل حاوية رطبة مناسبة.</li>
	<li>بعد 48 ساعة، يستنشق وسائل الإعلام NSC من الآبار واستبدالها بوسائط التمايز العصبي عن طريق إضافة 150 درجة مئوية إلى كل أعلى جيدا وكل أسفل جيدا.</li>
	<li>الخلايا العصبية الثقافة داخل5٪ CO 2، 37 درجة مئوية حاضنة داخل حاوية رطبة مناسبة. ملاحظة: يجب استبدال الوسائط كل 2-3 أيام. بسبب الأحجام الصغيرة المستخدمة في رقاقة، والتبخر حتى داخل حاضنة رطبة يمكن أن تؤثر بشكل كبير على بقاء الخلية. استخدام حاوية ثانوية مناسبة لتوفير الرطوبة إضافية لثقافة طويلة الأجل من الخلايا مع رقاقة (انظر جدولالمواد).</li>
</ol>3. وضع العلامات الفلورسنت الفيروسية من الخلايا العصبية hSC داخل رقاقة
ملاحظة: يمكن استخدام فيروس متعددة لتسمية الخلايا العصبية داخل رقاقة. تصف التعليمات أدناه استخدام فيروس داء الكلب-mCherry g-deleted أو فيروس eGFP. ويجب التعامل مع المواد المعدية المحتملة وفقا للقواعد والأنظمة المعمول بها، وقد تتطلب تدريبا إضافيا وموافقة مؤسسية.
<ol><li>دافئ ~ 400 درجة مئوية من وسائل الإعلام التمايز العصبية الطازجة لكل رقاقة إلى 37 درجة مئوية.</li>
	<li>إزالة 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام من بئر واحد من مقصورة محور عصبي في أنبوب الطرد المركزي ومن ثم إضافة 100،000 وحدة فيروسية من فيروس داء الكلب المعدلة إلى الأنبوب. ملاحظة: التخلص بشكل صحيح من أطراف الأنابيب المستهلكة وأنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على الفيروس.</li>
	<li>إزالة وسائل الإعلام التمايز العصبي المتبقية من المقصورة axonal ووضعها في أنبوب الطرد المركزي. يُحفظ عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. ملاحظة: تأكد من أن القنوات تبقى مليئة بالسائل.</li>
	<li>خلط 50 درجة مئوية من محلول الفيروس مع 150 درجة مئوية من وسائل الإعلام الدافئة. Pipet 100 درجة مئوية إلى بئر واحد من مقصورة أكسون و 100 درجة مئوية إلى مقصورة axon الأخرى بشكل جيد. حضانة لمدة 2 ساعة داخل حاضنة 37 درجة مئوية. ملاحظة: يساعد الفرق في وحدات التخزين بين المقصورات الإبطية والجسدية على ضمان بقاء الفيروس في المقصورة الإبطية أثناء أوقات العدوى/الحضانة.</li>
	<li>سحب الوسائط المحتوية على الفيروسات والتخلص منها. تحذير: لا تقم بإزالة السائل داخل القنوات الدقيقة المغلقة.</li>
	<li>بلطف pipet 75 € L من وسائل الإعلام الطازجة إلى حجرة واحدة axon جيدا والسماح للوسائل الإعلام تتدفق من خلال القناة إلى محور آخر بشكل جيد.</li>
	<li>إزالة الوسائط من حجرة axon والتخلص بشكل صحيح.</li>
	<li>كرر الخطوتين 3.6 و 3.7.</li>
	<li>املأ حجرة axon بالوسائط المحفوظة. Pipet إضافية 50 ميكرول وسائل الإعلام الطازجة، إذا لزم الأمر، ومن ثم العودة رقاقة إلى الحاضنة. هذه الوسائط الجديدة الإضافية هي لحساب نحو فقدان وسائل الإعلام أثناء نقل السائل والتبخر خلال هذه العملية. ملاحظة: يحدث وضع العلامات الفلورية المرئية باستخدام فيروسات داء الكلب المعدلة هذه بمقدار 48 ساعة وحتى 8 أيام بعد ها هي الوفاة الخلوية للخلايا العصبية المصابة تحدث بشكل عام بسبب سمية الفيروس. يمكن إجراء تصوير الخلايا العصبية كما هو الحال مع منصات الثقافة القياسية الأخرى (على سبيل المثال، الأطباق الزجاجية السفلية)، ولكن هناك حاجة إلى اعتبار خاص للحفاظ على الرطوبة الكافية لمنع فقدان التبخر.</li>
</ol>4. عزل السائل، استئصال اللخطات، وتلطيخ المناعة داخل رقاقة
<ol><li>اتبع العزلة المائعة، استئصال الأكسوت، وتلطيخ المناعة مع رقاقة كما هو موضح في Nagendran وآخرون12.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+translation+of+beta-catenin+regulates+synaptic+vesicle+dynamics.">Axonal translation of beta-catenin regulates synaptic vesicle dynamics.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Virlogeux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+Corticostriatal+Network+on-a-Chip+Reveals+the+Contribution+of+the+Presynaptic+Compartment+to+Huntington&#8217;s+Disease.">Reconstituting Corticostriatal Network on-a-Chip Reveals the Contribution of the Presynaptic Compartment to Huntington&#8217;s Disease.</a> Cell Reports. 22 (1), 110-122 (2018).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+&#60;em&#62;In+Vitro&#60;/em&#62;+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of &#60;em&#62;In Vitro&#60;/em&#62; Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Pinto, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteasome+controls+presynaptic+differentiation+through+modulation+of+an+on-site+pool+of+polyubiquitinated+conjugates.">The proteasome controls presynaptic differentiation through modulation of an on-site pool of polyubiquitinated conjugates.</a> The Journal of Cell Biology. 212 (7), 789-801 (2016).</li><li>Bigler, R. L., Kamande, J. W., Dumitru, R., Niedringhaus, M., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNAs+localized+to+distal+projections+of+human+stem+cell+derived+neurons.">Messenger RNAs localized to distal projections of human stem cell derived neurons.</a> Scientific Reports. 7 (1), 611 (2017).</li><li>Nagendran, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distal+axotomy+enhances+retrograde+presynaptic+excitability+onto+injured+pyramidal+neurons+via+trans-synaptic+signaling.">Distal axotomy enhances retrograde presynaptic excitability onto injured pyramidal neurons via trans-synaptic signaling.</a> Nature Communications. 8 (1), 625 (2017).</li><li>Van Laar, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+compartmentalized+axonal+mitochondrial+biogenesis:+Mitochondrial+DNA+replication+increases+in+distal+axons+as+an+early+response+to+Parkinson&#39;s+disease-relevant+stress.">Evidence for compartmentalized axonal mitochondrial biogenesis: Mitochondrial DNA replication increases in distal axons as an early response to Parkinson&#39;s disease-relevant stress.</a> The Journal of Neuroscience. , (2018).</li><li>del R&#237;o, J. A., Ferrer, I., Gav&#237;n, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cellular+prion+protein+in+interneuronal+amyloid+transmission.">Role of cellular prion protein in interneuronal amyloid transmission.</a> Progress in Neurobiology. 165-167, 87-102 (2018).</li><li>Jia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+Regulates+Axonal+Growth+of+Dorsal+Root+Ganglia+Neurons+by+Targeting+FOXP2+and+VAT1+in+Postnatal+and+Adult+Mouse.">MiR-34a Regulates Axonal Growth of Dorsal Root Ganglia Neurons by Targeting FOXP2 and VAT1 in Postnatal and Adult Mouse.</a> Molecular Neurobiology. , (2018).</li><li>Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+local+perfusion+chambers+for+the+visualization+and+manipulation+of+synapses.">Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses.</a> Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).</li><li>Menon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3+Ubiquitin+Ligase+TRIM9+Is+a+Filopodia+Off+Switch+Required+for+Netrin-Dependent+Axon+Guidance.">The E3 Ubiquitin Ligase TRIM9 Is a Filopodia Off Switch Required for Netrin-Dependent Axon Guidance.</a> Developmental cell. 35 (6), 698-712 (2015).</li><li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons.">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (141), (2018).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li><li>Oh, J. H., Jung, C. R., Lee, M. O., Kim, J., Son, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Comparative+analysis+of+human+embryonic+stem+cellderived+neural+stem+cells+as+an+in+vitro+human+model."> Comparative analysis of human embryonic stem cellderived neural stem cells as an in vitro human model.</a> International Journal of Molecular Medicine. 41 (2), 783-790 (2018).</li><li>Lazar, M., Miles, L. M., Babb, J. S., Donaldson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+deficits+in+young+adults+with+High+Functioning+Autism+and+their+impact+on+processing+speed.">Axonal deficits in young adults with High Functioning Autism and their impact on processing speed.</a> Neuroimage Clinical. 4, 417-425 (2014).</li><li>DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatory+repair+strategy+to+promote+axon+regeneration+and+functional+recovery+after+chronic+spinal+cord+injury.">Combinatory repair strategy to promote axon regeneration and functional recovery after chronic spinal cord injury.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9018 (2017).</li></ol>

S.P. وT.N. تعلن عن أي مصالح مالية متنافسة. V.P. هو موظف في Xona Microfluidics، LLC. J.H. هو عضو في Xona Microfluidics، LLC. A.M.T. هو مخترع للغرفة microfluidic / رقاقة (الولايات المتحدة 7419822 B2، EPO 2719756 B1) وهو عضو في Xona Microfluidics، LLC.

رقاقة COC متعددة المقصورة المجمعة مسبقاً هي منصة مجزأة سهلة الاستخدام للتمييز والحفاظ على NSCs البشرية في الخلايا العصبية على المدى الطويل (>4 أسابيع). في هذا البروتوكول، ونحن نبين التمايز من NSCs الإنسان في الخلايا العصبية الجلوتاماستيك، الخلايا العصبية تسمية رجعية، وأداء الكيمياء المناعية، تصور مورفولوجيا العمود الفقري الدنيدري ة وإجراء استئصال السموم. هذه الرقائق متوافقة مع التصوير عالية الدقة وليس هناك autofluorescence مع COC12.
رقائق COC متعددة المقصورة هي ما يعادل وظيفيا إلى الأجهزة المجزأة القائمة على السيليكون، ولها فوائد وعيوب كما هو موضح سابقا12. يقارن الجدول 1 رقائق COC متعددة المقصورات وأجهزة السيليكون لزراعة الخلايا العصبية hSC. توفر رقائق COC المجزأة سطحًا مائيًا أفضل للربط بالخلايا الجذعية وصيانتها على مدى فترة ثقافية طويلة. يجب تجميع الأجهزة المستندة إلى PDMS وإرفاقها بأغطية زجاجية. الطبيعة الكارهة للماء من أجهزة PDMS يسبب تجميع الخلايا الجذعية5; وهذا يؤدي إلى كل من التحديات في التصوير على المستوى الخلوي وزيادة التعرض للضرر المادي بسبب حركة المجاميع الخلية أثناء التغيرات وسائل الإعلام. الرقاقة البلاستيكية تتغلب على هذه التحديات. COC هو الغاز غير قابل للنفاذ، على عكس PDMS، لذلك جيوب الهواء المحاصرين أو شكلت داخل القنوات يجب إزالتها من قبل المستخدم. حل ما قبل الطلاء يقلل من إمكانية أن يصبح الهواء محاصرا في القنوات. يتكون هذا الحل من الإيثانول وعوامل أخرى. بروتوكول نشر سابقا لزراعة الخلايا العصبية المورين داخل هذه رقائق البلاستيك يوفر تفاصيل إضافية حول خلايا الأنابيب ووسائل الإعلام داخل رقائق12. NSCs هي أكثر هشاشة أن الخلايا العصبية المورين، لذلك يجب التعامل معها أكثر بلطف. ومن المهم أيضا لخلط الخلايا الجذعية تماما قبل الطلاء عن طريق الأنابيب بلطف لهم صعودا وهبوطا.
استخدام الخلايا العصبية المستمدة من الخلايا الجذعية البشرية المتمايزة في المختبر أصبحت شعبية متزايدة في الطب والبحوث. هذه الخلايا العصبية مهمة للبحوث والتطبيقات السريرية للعديد من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي, بما في ذلك الأمراض العصبية وإصابات الدماغ الصادمة. هذه الخلايا العصبية تشبه بشكل وثيق الخلايا العصبية الجنينية البشرية15. في المستقبل، يمكن توليد الخلايا العصبية الذين تتراوح أعمارهم بين مناسب من الخلايا الجذعية لتقليد وظيفة الخلايا العصبية ذات الصلة بالعمر واستخدامها جنبا إلى جنب مع هذه الأجهزة المجزأة. هذه الأجهزة سوف تسهل البحث في الأمراض التي تؤثر على صحة axon وظيفة مثل العجز في الخلايا العصبية للمرضى تشخيص اضطرابات طيف التوحد وتجديد axonal بعد الإصابة16,17.

الخلايا الجذعية البشرية الخلايا العصبية المتمايزة (hSC-الخلايا العصبية) تستخدم بشكل متزايد للبحوث البيولوجية. هذه الخلايا العصبية، والتي يمكن أن تستمد من المواد المصدر البشري، هي ذات أهمية كبيرة للبحوث الترجمة، بما في ذلك دراسة إصابات الدماغ الصادمة والاضطرابات العصبية مثل مرض الزهايمر. وهكذا، أدوات لتحسين وتسهيل دراسة الخلايا العصبية hSC هي في الطلب.
لدراسة مورفولوجيا الاستقطاب فريدة من الخلايا العصبية، العديد منالباحثين استخدام أجهزة microfluidic متعددة المقصورات 1،2،3،4،5،6، 7،8،9،10،11. هذه الأجهزة تمكين القياسات والتلاعب من الخلايا العصبية إسقاط طويلة مع وصول تحت الخلية فريدة من نوعها. تتكون الأجهزة الدقيقة متعددة الأجزاء من اثنين من المقصورات الميكروفلويدية المتوازية مفصولة بأخاديد دقيقة، والتي توجه النمو الإبطي. الخلايا العصبية أو الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) مطلية في المقصورة السمادودية، ومن ثم التمسك الجزء السفلي من سطح المقصورة بعد دقائق. تنمو الخلايا العصبية المتمايزة وتوسع محاورها/إسقاطاتها عبر منطقة الميكروgroove إلى مقصورة عصبية مجاورة ومعزولة. في الماضي، تم إجراء هذه الأجهزة حصرا باستخدام بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان) (PDMS) صب النسخة المتماثلة. أجهزة PDMS لديها العديد من العيوب التي سبق وصفها12، بما في ذلك هيدروفوبيسيتي المستمرة والحاجة إلى تجميع لغطاء زجاجي مباشرة قبل الاستخدام. قبل تجميعها حقن مصبوب رقائق التغلب على العديد من هذه العيوب وتباع تجاريا (انظر جدولالمواد)12. يتم إجراء مقصورات من هذه الرقائق بشكل دائم hydrophilic ورقاقة كاملة هو حقن مصبوب في شفافة بصريا دوري olefin كوبوليمر (COC).
يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام هذه الشريحة COC للتمييز بين NSCs البشرية في الخلايا العصبية المحفزة، وفصل وعزل بشكل سلس إسقاطاتالخلايا العصبية الطويلة. لهذه المظاهرة، تم تمييز الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية H9 المعتمدة من قبل المعاهد القومية للصحة. ويمكن استخدام إجراءات مماثلة للتمييز بين الخلايا الجذعية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor hydrazide 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A10436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti_beta-tubulin III</td>
			<td>Aves</td>
			<td>TUJ</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-vGAT antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>131 003</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-vGlut1 antibody</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>75-066</td>
			<td>clone N28/9, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>complete neural stem cell media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;REC HU EGF 
			10 UG BIOSOURCE (TM)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td>20ng/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REC HU FGF BASIC 
			10 UG BIOSOURCE (TM)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td>20ng/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>2mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>12660012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Neural Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1050801</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence imaging system</td>
			<td>EVOS Fluorescence imaging system</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td>10x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorinated ethylene propylene film</td>
			<td>American Durafilm</td>
			<td>50A</td>
			<td>0.5 mil thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS without Calcium and Magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIBCO HUMAN NSC (H9) KIT 
			COMBO KIT 
			&#160; 
			&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>N7800200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Laminin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7095D5X SIGMA</td>
			<td>5.75 in length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9-DERIVED HU NEURAL STEM CELL 
			1E6 CELLS/VIAL; 1 ML&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>510088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hibernate-E Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1247601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 5% CO2 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000RS</td>
			<td>30x silicone oil objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modified rabies virus</td>
			<td>Salk Institute for Biological Studies</td>
			<td>G-deleted Rabies-eGFP</td>
			<td>Material Transfer Agreement required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural differentiation media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Per 100 mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240112</td>
			<td>1mL (100X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>200mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PHC7074</td>
			<td>40 ng/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco B27 Plus Supplement (50X)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td>2mL (50X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco CultureOne Supplement (100X)&#160;</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>A3320201</td>
			<td>1mL (100X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Neurobasal Plus Medium</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>A3582901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taylor Wharton Liquid N2 dewar</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>20HCB11M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XC pre-coat&#160;</td>
			<td>Xona Microfluidics, LLC</td>
			<td>XC Pre-Coat</td>
			<td>included with XonaChips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChip</td>
			<td>Xona Microfluidics, LLC</td>
			<td>XC450</td>
			<td>450 &#181;m length microgroove barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifier Tray</td>
			<td>Xona Microfluidics, LLC</td>
			<td>humidifier tray</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

compartmentalization of human stem cell-derived neurons within pre-assembled plastic microfluidic chips

أصبح استخدام الأجهزة الدقيقة لتقسيم الخلايا العصبية المستزرعة طريقة قياسية في علم الأعصاب. يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام رقاقة متعددة المقصورات تم تجميعها مسبقًا في بوليمر أوليفين دوري (COC) لتقسيم الخلايا العصبية المتمايزة عن الخلايا الجذعية البشرية. بصمة هذه رقائق COC هي نفس الشريحة المجهر القياسية ومتوافقة على قدم المساواة مع الفحص المجهري عالية الدقة. يتم تمييز الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية العصبية البشرية (NSCs) إلى الخلايا العصبية الجلوتاماستيكداخل رقاقة والحفاظ عليها لمدة 5 أسابيع، مما يسمح بوقت كاف لهذه الخلايا العصبية لتطوير نقاط الاشتباك العصبي والعمود الفقري الددري. وعلاوة على ذلك، نقوم بتوضيح العديد من الإجراءات التجريبية الشائعة باستخدام هذه الرقائق متعددة المقصورات، بما في ذلك وضع العلامات الفيروسية، وإنشاء البيئات الدقيقة، واستئصال الأكسوو، والكيمياء المناعية.

بعد أسبوع واحد (7-10 أيام) في رقاقة مع وسائل الإعلام التمايز، NSCs تميز فيالخلايا العصبية والإسقاطات العصبية تدخل المقصورة axonal (الشكل 3). داخل رقاقة، الخلايا العصبية إرفاق وتوزيع بالتساوي داخل المقصورة الجسدية. في المقارنة، الخلايا العصبية في أجهزة PDMS تكتل / تجميع في وقت مبكر من 5 أيام بعد إضافة وسائل الإعلام التمايز، مما يؤدي إلى خطر صحة الخلية كما يمكن أن نرى في الشكل 3B (اليوم 13 صورة مكبرة). الخلايا العصبية في رقائق تبدو صحية مع محاور المجمعة. يمكن الحفاظ على الخلايا العصبية الصحية داخل رقائق لمدة 4-5 أسابيع.
لتصور نضج الخلايا العصبية وتطوير العمود الفقري التقشري، تم تسليم فيروس داء الكلب المعدل إلى المقصورة الإبطية في اليوم 29 إلى الخلايا العصبية تسمية رجعية، بما في ذلك العمود الفقري التقشري، مع بروتين الفلورسنت mCherry. بعد أربعة أيام من عدوى فيروس داء الكلب، أعربت الخلايا العصبية التي تمتد المحاور إلى المقصورة الإبطية عن mCherry. وأظهرت الخلايا العصبية في يوم التمايز 33 تشكيلالعمود الفقري التقشري (الشكل 4). التصور من العمود الفقري الددرية يوضح أن الخلايا العصبية المشتقة NSC متباينة داخل رقائق شكل نقاط الاشتباك العصبي ناضجة.
رقاقة متعددة المقصورة متوافق ة أيضا مع الكيمياء المناعية لتصور توطين الخلوية للبروتين. بعد 26 يوما من الحفاظ على الخلايا العصبية في وسائل الإعلام التمايز، وصفت الخلاياالعصبية لعلامة متشابك مثير، vGlut1 (الشكل 5). وتظهر هذه النتائج أن الخلايا العصبية المسماة الفيروسية تشارك في توطين vGlut1 (الشكل 5E) وعلامة محددة الخلايا العصبية، β-tubulin III (الشكل5F-H).
كما أظهرت القدرة على خلق بيئات صغيرة متميزة معزولة إلى محاور باستخدام اليكسا فلور 488 هيدرازيد، صبغة الفلورسنت منخفضة الوزن الجزيئي (الشكل6).
عادة ما يتم إجراء دراسات إصابة أكسون داخل الأجهزة المجزأة. تم إجراء دليل على تجربة المبدأ لإصابة انتقائية محاور الخلايا العصبية المتمايزةمع رقاقة COC التي تم تجميعها مسبقا (الشكل 7). وكانت النتائج تعادل أجهزة السيليكون المجزأة6و13و14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig1.jpg"> الشكل 1: COC تجميعها مسبقا، رقاقة microfluidic متعددة المقصورات. (أ) رسم للرقاقة تحديد الآبار العليا والسفلى. حجم رقاقة هو 75 مم × 25 ملم، وحجم الشرائح المجهر القياسية. (ب) تكبير في المنطقة التي تظهر القنوات والأخاديد الدقيقة التي تفصل القنوات. وترد تفاصيل إضافية في Nagendran وآخرون12. (C) توضح هذه الصورة خلق بيئات صغيرة معزولة داخل كل مقصورة باستخدام صبغتلوين الطعام. وقد تم استنساخ هذا الرقم بأكمله من 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig2.jpg"> الشكل 2: طلاء رقاقة البلاستيك مجزأة والجدول الزمني لطلاء الخلايا NSC. (أ) كانت مغلفة رقائق البلاستيك متعددة المقصورة مع حل ما قبل الطلاء، ومن ثم بولي-L-ornithine ولامينين قبل تكييف مسبق مع وسائل الإعلام NSC. (B) كانت مطلية NSCs مع 7 × 104 خلايا في المقصورة الجسدية للرقاقة. نمت الخلايا في وسائل الإعلام NSC لمدة 24 ساعة ومن ثم تم استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام التمايز العصبي. لوحظت الخلايا العصبية المتمايزة من قبل 7-10 أيام بعد التمايز. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig3.jpg"> الشكل 3: مقارنة نمو الخلايا العصبية hSC في رقائق وأجهزة PDMS. (أ) صورة تباين المرحلة من الخلايا العصبية hSC نمت في 13 يوما بعد التمايز في رقاقة متعددة المقصورات البلاستيكية. (ب) منطقة مكبرة من الخلايا العصبية hSC المستزرعة داخل المربع الأبيض في (أ) ومنطقة مماثلة داخل جهاز PDMS (يمين). hSC-الخلايا العصبية داخل رقائق نعلق بشكل جيد. تتشكل مجموعات الخلايا العصبية المجمعة في الأجهزة المستندة إلى PDMS. ممثل عن تجربتين مستقلتين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig4.jpg"> الشكل 4: تظهر الخلايا العصبية المشتقة من NSC الإنسان مورفولوجيا العمود الفقري الدنيدري. إلى الوراء المسمى mCherry الخلايا العصبية في يوم التمايز 33 نمت داخل رقاقة. المنطقة المكبرة المبينة باللون الأحمر، يسلط الضوء على وجود العمود الفقري الددري، والتي توفر أدلة تدعم تطوير نقاط الاشتباك العصبي الجلوتاساتية الناضجة. السهام الحمراء تشير نحو العمود الفقري التقشري. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig5.jpg"> الشكل 5: الخلايا العصبية المشتقة من NSC الإنسان المستزرعة داخل رقائق تظهر نقاط الاشتباك العصبي المحفزة. تم إجراء التلطيخ المناعي في يوم التمايز 26. تم إجراء تصوير الخلايا العصبية في المقصورة الجسدية. A)vGlut1 (الأخضر) و (ب) DAPI (الأزرق) تصنيف المناعة. (C) الخلايا العصبية التي تحمل اسم الكرز (الأحمر) إلى الوراء المسمى باستخدام فيروس داء الكلب المعدلة. (د) صورة مجهرية الفلورسنت المدمجة من(A-C). (E) العمود الفقري Dendritic وvGlut1 الملتحمة الإيجابية colocalized مع dendrites mCherry إيجابية، كما هو موضح في التكبير في المنطقة من(D). الميكروغرافيا المناعية من (F) علامة محددة الخلايا العصبية ، β-tubulin الثالث (أرجواني) ، و (G) vGlut1 (الأخضر). (H) تراكب بيتا توبولين الثالث، وvGlut1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig6.jpg"> الشكل 6: الخلايا العصبية mCherry المنقولة الفيروسية توسيع التوقعات إلى بيئة صغيرة مترجمة axon أنشئت داخل رقاقة COC تجميعها مسبقا. (أ) mCherry المسمى الخلايا العصبية تمتد المحاور من خلال microgrooves من رقاقة وإلى مقصورة axon معزولة. يتم تصور عزل حجرة محور عصبي باستخدام اليكسا فلور 488 هيدرازيد. تم تصوير الخلايا العصبية في يوم التمايز 26 و 3 أيام بعد العدوى بفيروس داء الكلب المعدل. (ب) يتم دمج صورة الفلورة في (أ) مع صورة DIC. لاحظ موقع microgrooves. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig7.jpg"> الشكل 7: استئصال الأكسوت يُجرى داخل شريحة COC متعددة المقصورات. (أ) تم تصوير الخلايا العصبية المسماة mCherry في يوم التمايز 33 قبل استئصال الساكسوتوكسي. 'النار' لون نظرة متابعة الجدول. (ب) مباشرة بعد استئصال اللمعة، مما يدل على أن يتم قطع المحاور تماما. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>رقائق بلاستيكية متعددة المقصورة</td>
			<td>أجهزة متعددة المقصورات PDMS</td>
		</tr>
<tr>
<td>عزل المحاور</td>
			<td>عزل المحاور</td>
		</tr>
<tr>
<td>إنشاء بيئات صغيرة</td>
			<td>إنشاء بيئات صغيرة</td>
		</tr>
<tr>
<td>الخلايا العصبية الساكستومية</td>
			<td>الخلايا العصبية الساكستومية</td>
		</tr>
<tr>
<td>شفافة بصريا</td>
			<td>شفافة بصريا</td>
		</tr>
<tr>
<td>متوافق مع التصوير عالي الدقة</td>
			<td>متوافق مع التصوير عالي الدقة</td>
		</tr>
<tr>
<td>متوافق مع مجهريال الفلورية</td>
			<td>متوافق مع مجهريال الفلورية</td>
		</tr>
<tr>
<td>تجميعها بالكامل</td>
			<td>التجميع إلى الركيزة المطلوبة</td>
		</tr>
<tr>
<td>محاور صحية > 21 يوما</td>
			<td>محاور صحية >14 يوما</td>
		</tr>
<tr>
<td>سطح الزراعة المائية</td>
			<td>مسعور</td>
		</tr>
<tr>
<td>الغاز لا يمكن نفاذها</td>
			<td>الغاز نفاذية</td>
		</tr>
<tr>
<td>مدورة microgrooves والقنوات</td>
			<td>على التوالي microgrooves</td>
		</tr>
<tr>
<td>غير متوافق مع الاستئصال بالليزر</td>
			<td>يمكن استخدامها للاستئصال بالليزر عندما يتم تجميع غرف PDMS على الشرائح الخاصة متوافقة مع الاستئصال بالليزر.</td>
		</tr>
<tr>
<td>لا يمكن تغيير الجهاز لإزالة أعلى</td>
			<td>أعلى هو القابلة للإزالة لتلطيخ داخل microgrooves</td>
		</tr>
<tr>
<td>غير متوافق مع الزيوت المعدنية القائمة على زيوت الغمر (الزيوت القائمة على السيليكون على ما يرام)</td>
			<td>متوافق مع الزيوت المعدنية القائمة على زيوت الغمر</td>
		</tr>
<tr>
<td>غير قابل ة للنفاذ إلى جزيئات صغيرة ومذيبات عضوية</td>
			<td>امتصاص الجزيئات الصغيرة والمذيبات العضوية</td>
		</tr>
<tr>
<td>لا مشاكل التسرب مع رقاقة</td>
			<td>طلاء مع بولي-L-ornithine واللامينين جعل الأجهزة راشح</td>
		</tr>
<tr>
<td>الخلايا العصبية المتمايزة لا تزال موزعة بالتساوي (> 4 أسابيع) في كثافات الخلايا اختبارها</td>
			<td>الخلايا العصبية المتمايزة تبدأ في التجميع بعد 3-4 أيام في الثقافة في كثافات الخلايا اختبارها</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: مقارنة رقائق COC متعددة المقصورات وأجهزة السيليكون للخلايا العصبية التي تُزرع

Watch this Scientific Journal Video about Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips at JoVE.com

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

تقسيم الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية داخل رقائق Microfluidic البلاستيكية التي تم تجميعها مسبقًا

يوضح هذا البروتوكول استخدام رقائق microfluidic المجزأة، والحقن مصبوب في البوليمر الأوليفين دوري إلى الخلايا العصبية المستزرعة المتمايزة عن الخلايا الجذعية البشرية. يتم تجميع هذه الرقائق مسبقا وأسهل للاستخدام من الأجهزة التقليدية متعددة المجزأة (dimethylsiloxane). يتم وصف العديد من النماذج التجريبية الشائعة هنا، بما في ذلك وضع العلامات الفيروسية، والعزل ة السوائل، واستئصال الأكسوتو، وتلطيخ المناعة.

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

أجهزة microfluidic مجزأة تسمح الخلايا العصبية إلى أن تدرس في شكلها الاستقطاب الشديد. هذه الأجهزة هي مفيدة لكل من البحوث الأساسية والبحوث علم الأعصاب الترجمة. يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام رقائق الكوبوليمر الأوليفين الدوري لتقسيم الخلايا العصبية المتمايزة عن الخلايا الجذعية البشرية.هذه رقائق COC إنتاج ثقافات أكثر صحة من الخلايا العصبية المتمايزة على أجهزة متعددة المقصورة PDMS. في هذا البروتوكول، ونحن نبرهن على ثقافة الخلايا العصبية التي تميّز من خط الخلايا الجذعية H9 المعتمد من المعاهد القومية للصحة. ويمكن استخدام إجراءات مماثلة لتمييز الخلايا العصبية من mIPSCs.يجب وضع رقائق متعددة المقصورة في احتواء الثانوية مع الترطيب إضافية. يجب أن تكون قنوات رقائق متعددة المقصورة مليئة بحل معطف، ومن ثم مسح مع برنامج تلفزيوني. للبدء، حل بولي-L-ornithine في ثقافة الخلية الصف الماء المقطر لجعل 600 ميكرولترات من الحل لكل رقاقة.التعرق برنامج تلفزيوني المتبقية من الآبار، والتأكد من أن تلميح ماصة بعيدا عن افتتاح القناة. تحميل 150 ميكرولترات من بولي-L-أورنيثين حل العمل في أعلى اليمين جيدا. انتظر لمدة 90 ثانية وإضافة 150 ميكرولترات من الحل إلى أسفل اليمين جيدا.انتظر خمس دقائق وكرر عملية التحميل مع الحل للآبار اليسرى. ثم ضع درج المرطب مع رقاقة عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. إذا كان استخدام طبق بيتري، قم بلفه ببارا فيلم وضعه عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.بعد ذلك، يُفطّن المحلّل من الآبار، مع ضمان وضع طرف الماصات بعيدًا عن فتحة القناة. وكرر تحميل الآبار اليمنى واليسرى مع 150 ميكرولترر كل من الماء المعقم مرتين. إعداد حل العمل اللامينين.تحميل الآبار اليمنى واليسرى مع 150 ميكرولترات كل من حل العمل اللامينيين. احتضان رقاقة داخل علبة لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية. شطف رقاقة مع برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم.تحميل الآبار اليمنى واليسرى مع 150 ميكرولترس كل من برنامج تلفزيوني. انتظر خمس دقائق التعرق برنامج تلفزيوني من الآبار وشطف رقاقة مع وسائل الإعلام NSC.قم بتحميل الآبار اليمنى واليسرى مع 150 ميكروليتر لكل من وسائط NSC. احتضان رقاقة في علبة بين عشية وضحاها في حاضنة درجة مئوية 37 مع 5٪ CO2 لشرط مسبق للرقاقة. لزرع الخلايا الجذعية العصبية البشرية في رقاقة متعددة المقصورة، عد أولا تركيز الخلية باستخدام مقياس الدم.ثم، الطامح وسائل الإعلام من الآبار. Pipette خمسة ميكرولترات من حل الخلية إلى أعلى اليمين جيدا، تليها خمسة microliters إلى أسفل الحق جيدا. استخدم المجهر للتحقق من أن الخلايا قد دخلت القناة.انتظر خمس دقائق حتى تلتزم الخلايا بالجزء السفلي من الشريحة. ما يقرب من 150 ميكرولترات من وسائل الإعلام NSC إلى الآبار اليمنى واليسرى. احتضان في 5٪ CO2، 37 درجة مئوية داخل حاوية مرطب مناسبة.بعد 48 ساعة، تُشعّر وسائط NSC من الآبار وتستبدلها بوسائط تمايز عصبية بإضافة 150 ميكرولترات إلى كل بئر وكل قاع جيد. الخلايا العصبية الثقافة داخل 5٪ CO2، 37 درجة مئوية حاضنة داخل علبة مرطب. إزالة وسائل الاعلام التمايز العصبي المتبقية من مقصورة محور عصبي ووضعها في أنبوب الطرد المركزي.تخزينها عند درجة 37 مئوية. مزيج 50 ميكرولترات من حل الفيروس مع 150 ميكرولترات من وسائل الإعلام الدافئة. ماصة 100 ميكرولترات من الخليط إلى كل من الآبار من مقصورة محور عصبي.احتضان لمدة ساعتين في غضون حاضنة 37 درجة مئوية. سحب الوسائط المحتوية على الفيروس والتخلص منها. بلطف ماصة 75 ميكرولترات من وسائل الإعلام الطازجة إلى مقصورة محور واحد جيدا والسماح لوسائل الإعلام تتدفق من خلال القناة إلى محور عصبي آخر جيدا.كرر هذه العملية مرة واحدة. وأخيراً، املأ حجرة المحور بالوسائط المحفوظة، ثم قم بنقل الشريحة إلى الحاضنة. بعد أسبوع واحد في رقاقة مع وسائل الإعلام التمايز، والخلايا الجذعية العصبية البشرية تختلف في الخلايا العصبية، تعلق ووزعت بالتساوي داخل المقصورة الجسدية.وبالمقارنة، جمعت الخلايا العصبية في أجهزة PDMS في وقت مبكر من خمسة أيام بعد إضافة وسائل الإعلام التمايز، مما أدى إلى صحة الخلايا للخطر. أظهر التصور للخلايا العصبية المسماة والعمود الفقري المتجن مع البروتين الفلوري mCherry أن الخلايا العصبية المشتقة من NSC متمايزة داخل رقائق تشكل نقاط الاشتباك العصبي الناضجة. تم تسمية الخلايا العصبية لعلامة متشابك مثير، vGlut1.تظهر نتائج المناعة أن الخلايا العصبية المسماة فيروسية يمكن أن تشارك في التعريب مع vGlut1 ، وعلامة خاصة بالخلايا العصبية ، Beta-tubulin ثلاثة. الخلايا العصبية mCherry التي يتم تحويلها فيروسية توسيع التوقعات إلى بيئة صغيرة محور عصبي محلية أنشئت داخل رقاقة مكمّلة مسبقا. وأظهرت مقارنة بين صور mCherry الخلايا العصبية المسماة قبل ومباشرة بعد axotomy axons مقطوعة تماما.من المهم التأكد من أن القنوات تظل مليئة بالسوائل إلا عند إجراء إجراء الفأس. رقائق COC مجزأة سهلة الاستخدام ويمكن أن تفتح الباب أمام العديد من التحقيقات المتعلقة بإصابة الخلايا العصبية، synaptogenesis، اللدونة متشابك، والفيزيولوجيا المرضية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

مواصفات من الخلايا العصبية الجلوتاميرجي الدماغ الانتهائي من خلايا الجذعية المحفزة

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

تقييم الوظيفي للأعصاب البيولوجية في الثقافات الشبكية من الخلايا الجذعية المستمدة من الجهاز العصبي المركزي الخلايا العصبية

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

نمذجة عدوى فيروس زكى من وضع الدماغ البشري في المختبر باستخدام الخلايا الجذعية المشتقة من أورجانويدس الدماغي

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

جيل بسيطة من ثقافة عالية الغلة المستحث الخلايا العصبية من الخلايا الليفية الجلد الكبار البشرية

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

أسلوب لإصابة الإنسان تمتد عالية السرعة التي يسببها Pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا العصبية في شكل جيد 96

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons

استخدام رقائق موائع جزيئية البلاستيك قبل تجميع لتجزئة الخلايا العصبية مورين الأولية

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

إعادة طلاء الخلايا العصبية البشرية المتعددة القوى المستمدة من الخلايا الجذعية من أجل فحص المحتوى العالي من تكوين النيونيتوجينيووووووين ونضج المشبك

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

الهجرة، والجذب الكيميائي، ومقالات الثقافة المشتركة للخلايا الأنبوسلية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية والخلايا العصبية GABAergic

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

تحليل نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في الخلايا العصبية الجذعية المستحثة البشرية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية في الشلل النصفي التشنجي الوراثي

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

زرع تحت الشبكية لأنسجة الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في نموذج حيواني كبير للقطط

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...