Name: compartmentalization of human stem cell-derived neurons within pre-assembled plastic microfluidic chips
Uploaded: 2019-05-03T13:00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips at JoVE.com

המחברים מכירים את התמיכה של Xona Microfluidics LLC, המכון הלאומי לבריאות הנפש (R42 MH097377), ואת המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ (R41 NS108895, P30 NS045892). התוכן הינו באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

הערה: איור 1A, B מציג סכמטי של שבב ה-coc המורכב מראש, כולל המיקומים של הערוצים הראשיים או התאים, הבארות והמיקרוחריצים. השבב מידור יכול להקים מיקרופיאידים ברורים בתוך תא כמו להפגין על ידי בידוד של צבע צביעה מזון (איור 1C). הפרוטוקול להכנת השבב הרב-ממדי של ההרכבה מראש מוענק בנגנדרן ואח ', סעיף12.
1. ציפוי שבבי מרובת-תאים עבור hSC-נוירונים
הערה: איור 2A מציג מבט כולל על הליכי הציפוי.
<ol><li>התמוססות פולי-L-אורתך במים מזוקקים כיתה התרבות כיתה כדי להפוך את 600 μL של פתרון לכל שבב של 20 μg/mL פתרון העבודה.</li>
	<li>. אחרי שהכין את האסימונים מבארות כאשר אתה מורח, לוודא את העצה הפייפט הוא הרחק מפתח הערוץ. הערה: הערוצים המיקרופלואידים חייבים להישאר מלאים למשך כל הליך זה. אין לאכול נוזלים מן הערוצים/התאים, רק את הבארות.</li>
	<li>טעינת 150 μL של הפתרון העובד של פולי-L – אוראתה בחלק הימני העליון של הבאר. המתן 90 s או עד הנוזל מתחיל למלא את הטוב הימנית התחתונה. הוסף 150 μL של מדיה לימין הימני התחתון והמתן 5 דקות כדי לאפשר לנוזל לעבור דרך מיקרוחריצים.</li>
	<li>הוסף 150 μL של מדיה לפינה השמאלית העליונה. לחכות 90 s ולאחר מכן להוסיף 150 μL לימין השמאלי התחתון. עוטפים את מחזיק השבבים עם parafilm ומניחים ב -4 ° c בלילה. הערה: לחלופין, הניחו את השבב והמחזיק ב-37 ° c עבור 1 h.</li>
	<li>מוריד את המדיה מבארות, ומוודא שהקצה הפתוח של הערוץ ממוקם הרחק מפתח התעלה. הוסף 150 μL של מים עקרים לימין הימני העליון. המתן 90 s ולאחר מכן להוסיף 150 μL לימין הימני התחתון. המתן 5 דקות כדי לאפשר לנוזל לעבור את המיקרוחריצים.</li>
	<li>הוסף 150 μL של מים סטרילי לפינה השמאלית העליונה, לחכות 90 s ולאחר מכן להוסיף עוד 150 μL לפינה השמאלית התחתונה.</li>
	<li>חזור על שלבים 1.5-1.6.</li>
	<li>הפשרת למינציה באיטיות ב-2 ° צ' עד 8 ° צ' והכינו פתרון עבודה של 10 μg/mL.</li>
	<li>טען 150 μL של המילמינציה בפתרון העבודה לימין הימני העליון. המתן 90 s או עד הנוזל מתחיל למלא את הטוב הימנית התחתונה. Pipet 150 μL למטה בסדר גמור. המתן 5 דקות כדי לאפשר למילמינציה לעבור את המיקרוחריצים.</li>
	<li>הוסף 150 μL של למינציה לפינה השמאלית העליונה. לחכות 90 s ולאחר מכן להוסיף 150 μL לימין השמאלי התחתון. מודקת את השבב בתוך המחזיק שלה 2 h ב 37 ° c.</li>
	<li>לשטוף את השבב עם PBS (ללא Ca2 + ו-Mg2 +). טעינת 150 μL של PBS לימין הימני העליון. המתן 90 s או עד הנוזל מתחיל למלא את הטוב הימנית התחתונה. הוסף 150 μL של PBS לימין הימני התחתון והמתן 5 דקות כדי לאפשר ל-PBS לעבור את המיקרוחריצים.</li>
	<li>Pipet 150 μL של PBS למעלה השמאלית העליונה. אחרי 90 s pipet 150 μL לשמאל היטב שמאל.</li>
	<li>ולאחר מכן לשטוף את השבב עם מדיה המועצה לבטחון לאומי (ראה לוח חומרים). טען 150 μL של מדיה לימין הימני העליון. אחרי 90 s או כאשר הנוזל עובר דרך הערוץ הימני לתוך הטוב הימנית התחתונה, להוסיף 150 μL לימין הימני התחתון. המתן 5 דקות כדי לאפשר לתקשורת לזרום דרך המיקרוחריצים.</li>
	<li>הוסף 150 μL של מדיה לפינה השמאלית העליונה ועוד 150 μL לפינה השמאלית התחתונה. מודטה את השבב בחממה 37 ° c עם 5% CO2 כדי לקדם תנאי השבב עד מוכן seed NSCs. הערה: ניתן לעשות שבבים ממוזגים ללילה במידת הצורך.</li>
</ol>2. זריעת NSCs לתוך השבב הרב
הערה: פרוטוקול זה השתמש NSCs מסחרית רכשה, בניגוד לפרסום הקודם שלנו אשר החלה עם תאים מעובריים אנושיים5. בפרוטוקול זה בתאי גזע עצביים מצופים ישירות לתוך שבבי פלסטיק שבו הם להבדיל לנוירונים. התאים יכולים להיות מותר להתרבות כמו NSCs (ללא בידול) עבור עד 2 מעברים ומאוחסן בבקבוקונים N נוזלי2 לשימוש נוסף. פרוטוקול זה משתמש בבקבוקונים של המועצה לבטחון לאומי המאוחסנים ב-N הנוזל2 לאחר מעבר 1 או 2. איור 2B מציג סקירה של הליכי הציפוי.
<ol><li>הפשרת NSCs על פי הוראות היצרן. הערה: הליך זה חל על NSCs H9 נגזר. קווי תאים אחרים ידרשו אופטימיזציה של צפיפות תאים.</li>
	<li>לספור את ריכוז התא באמצעות הומוציטוטומטר ולהתאים באמצעות מדיה לבטחון לאומי כדי לקבל ריכוז של 7 x 106 תאים לכל mL.</li>
	<li>מחלק מדיה מכל. חלק בשבב הימנע מלאחד מדיות מהערוצים המרכזיים.</li>
	<li>Pipet 5 μL של פתרון התא לימין הימני העליון, ואחריו 5 μL לימין התחתון טוב (70,000 הכולל תאים). ודא שהתאים מתצינורות לעבר פתחי הערוץ הראשי. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק שתאים נכנסו לערוץ. לחכות 5 דקות לתאים לדבוק בחלק התחתון של השבב. הערה: ניתן להשתמש בשני התאים או בשניהם כדי לטעון תאים.</li>
	<li>Pipet ~ 150 μL של מדיה לבטחון לאומי לימין הימני העליון ולאחר מכן 150 μL לימין הימני התחתון. . חזור על הצד השמאלי דגירה ב 5% CO2, 37 ° c בתוך מיכל לחות מתאים מחולל.</li>
	<li>לאחר 48 שעות, מחלק את התקשורת המועצה לבטחון לאומי מן הבארות ולהחליף עם התקשורת בידול עצבי על ידי הוספת 150 μL לכל הטוב בראש כל היטב בתחתית.</li>
	<li>תרבות נוירונים ברדיוס של 5% CO2, 37 מעלות בחממה בתוך מיכל לחות מתאים. הערה: יש להחליף את המדיה כל 2-3 ימים. בגלל הכרכים הקטנים המשמשים את השבב, אידוי גם בתוך החממה מחולל לחות יכול להשפיע באופן משמעותי על הכדאיות התא. השתמשו במיכל משני מתאים כדי לספק לחות נוספת לתרבות ארוכת טווח של תאים עם השבב (ראו טבלת חומרים).</li>
</ol>3. ויראלי תיוג פלורסנט של hSC-נוירונים בתוך השבב
הערה: וירוס מרובים ניתן להשתמש כדי לתייג נוירונים בתוך השבב. הוראות שלהלן מתארות את השימוש ב-G-כלבת-מדובדבן או בווירוס-eGFP. חומרים מדבקים העלולים להיות מטופלים על פי הכללים והתקנות הישימים, ועשויים לדרוש הכשרה נוספת ואישור מוסדי.
<ol><li>חם ~ 400 μL של מדיה בידול עצבי חדש לכל שבב ל 37 ° c.</li>
	<li>הסר 50 μl של מדיה מבאר אחת של תא אקסון לתוך שפופרת צנטריפוגה ולאחר מכן להוסיף 100,000 יחידות ויראליות של וירוס כלבת שונה לצינור. הערה: כראוי להיפטר בילה טיפים pipet וצינורות צנטריפוגה המכיל וירוס.</li>
	<li>הסירו את מדיית הבידול העצבית הנותרת מהתא האקונאלי והניחו לצינור הצנטריפוגה. חנות ב37 ° c. הערה: ודא שהערוצים נותרים מלאים בנוזל.</li>
	<li>מערבבים את 50 μL של פתרון וירוס עם 150 μL של מדיה מחומם. Pipet 100 μl אחד היטב של תא אקסון ו 100 μl אל האקסון השני היטב. המשך 2 שעות בתוך החממה 37 ° c. הערה: ההבדל באמצעי האחסון בין התאים האקונאליות ובתאי הסומטיים מסייע להבטיח שהוירוס יישאר בתא האקונאליות בזמן הידבקות/דגירה.</li>
	<li>נסיגה והיפטר ממדיה המכילה וירוסים. התראה: אין להסיר נוזלים בתוך ערוצי המיקרו-פלואידים הסגורים.</li>
	<li>בעדינות pipet 75 μl של מדיה טרייה אחד אקסון תא היטב ולתת את זרימת התקשורת דרך הערוץ לתוך אקסון אחרים היטב.</li>
	<li>הסר מדיה מהתא אקסון והיפטר כראוי.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.6 ו-3.7.</li>
	<li>מלא את תא ה-אקסון במדיה השמורה. Pipet נוסף 50 μL מדיה טרייה, במידת הצורך, ולאחר מכן להחזיר את השבב לחממה. מדיה חדשה נוספת היא לספור לקראת אובדן התקשורת במהלך העברה נוזלית והתאיידות במהלך התהליך. הערה: תיוג פלורסנט גלוי באמצעות אלה וירוסים ששונו כלבת מתרחשת על ידי 48 h ועד 8 ימים לאחר איזה תא מוות של נוירונים נגועים בדרך כלל מתרחשת עקב רעילות וירוסים. הדמיה תא העצב ניתן לבצע כמו בפלטפורמות אחרות התרבות הסטנדרטית (למשל, זכוכית מנות בתחתית), אבל שיקול מיוחד נדרש כדי לשמור על לחות מספקת כדי למנוע הפסדים התטיבי.</li>
</ol>4. בידוד פלואידיק, פיום וכתמים בתוך השבב
<ol><li>עקוב אחר בידוד פלואידיק, הפיום והמעבד החיסוני עם השבב כפי שמתואר בניונדרזו ואח '12.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+translation+of+beta-catenin+regulates+synaptic+vesicle+dynamics.">Axonal translation of beta-catenin regulates synaptic vesicle dynamics.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Virlogeux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+Corticostriatal+Network+on-a-Chip+Reveals+the+Contribution+of+the+Presynaptic+Compartment+to+Huntington&#8217;s+Disease.">Reconstituting Corticostriatal Network on-a-Chip Reveals the Contribution of the Presynaptic Compartment to Huntington&#8217;s Disease.</a> Cell Reports. 22 (1), 110-122 (2018).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+&#60;em&#62;In+Vitro&#60;/em&#62;+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of &#60;em&#62;In Vitro&#60;/em&#62; Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Pinto, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteasome+controls+presynaptic+differentiation+through+modulation+of+an+on-site+pool+of+polyubiquitinated+conjugates.">The proteasome controls presynaptic differentiation through modulation of an on-site pool of polyubiquitinated conjugates.</a> The Journal of Cell Biology. 212 (7), 789-801 (2016).</li><li>Bigler, R. L., Kamande, J. W., Dumitru, R., Niedringhaus, M., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNAs+localized+to+distal+projections+of+human+stem+cell+derived+neurons.">Messenger RNAs localized to distal projections of human stem cell derived neurons.</a> Scientific Reports. 7 (1), 611 (2017).</li><li>Nagendran, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distal+axotomy+enhances+retrograde+presynaptic+excitability+onto+injured+pyramidal+neurons+via+trans-synaptic+signaling.">Distal axotomy enhances retrograde presynaptic excitability onto injured pyramidal neurons via trans-synaptic signaling.</a> Nature Communications. 8 (1), 625 (2017).</li><li>Van Laar, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+compartmentalized+axonal+mitochondrial+biogenesis:+Mitochondrial+DNA+replication+increases+in+distal+axons+as+an+early+response+to+Parkinson&#39;s+disease-relevant+stress.">Evidence for compartmentalized axonal mitochondrial biogenesis: Mitochondrial DNA replication increases in distal axons as an early response to Parkinson&#39;s disease-relevant stress.</a> The Journal of Neuroscience. , (2018).</li><li>del R&#237;o, J. A., Ferrer, I., Gav&#237;n, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cellular+prion+protein+in+interneuronal+amyloid+transmission.">Role of cellular prion protein in interneuronal amyloid transmission.</a> Progress in Neurobiology. 165-167, 87-102 (2018).</li><li>Jia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+Regulates+Axonal+Growth+of+Dorsal+Root+Ganglia+Neurons+by+Targeting+FOXP2+and+VAT1+in+Postnatal+and+Adult+Mouse.">MiR-34a Regulates Axonal Growth of Dorsal Root Ganglia Neurons by Targeting FOXP2 and VAT1 in Postnatal and Adult Mouse.</a> Molecular Neurobiology. , (2018).</li><li>Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+local+perfusion+chambers+for+the+visualization+and+manipulation+of+synapses.">Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses.</a> Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).</li><li>Menon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3+Ubiquitin+Ligase+TRIM9+Is+a+Filopodia+Off+Switch+Required+for+Netrin-Dependent+Axon+Guidance.">The E3 Ubiquitin Ligase TRIM9 Is a Filopodia Off Switch Required for Netrin-Dependent Axon Guidance.</a> Developmental cell. 35 (6), 698-712 (2015).</li><li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons.">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (141), (2018).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li><li>Oh, J. H., Jung, C. R., Lee, M. O., Kim, J., Son, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Comparative+analysis+of+human+embryonic+stem+cellderived+neural+stem+cells+as+an+in+vitro+human+model."> Comparative analysis of human embryonic stem cellderived neural stem cells as an in vitro human model.</a> International Journal of Molecular Medicine. 41 (2), 783-790 (2018).</li><li>Lazar, M., Miles, L. M., Babb, J. S., Donaldson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+deficits+in+young+adults+with+High+Functioning+Autism+and+their+impact+on+processing+speed.">Axonal deficits in young adults with High Functioning Autism and their impact on processing speed.</a> Neuroimage Clinical. 4, 417-425 (2014).</li><li>DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatory+repair+strategy+to+promote+axon+regeneration+and+functional+recovery+after+chronic+spinal+cord+injury.">Combinatory repair strategy to promote axon regeneration and functional recovery after chronic spinal cord injury.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9018 (2017).</li></ol>

פ מ ו-T.N. לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים. סמנכ ל הוא עובד של Xona מיקרופלואידיקה, LLC. J.H. הוא חבר של Xona מיקרופלואידיקה, LLC. A.M.T. הוא ממציא של קאמרית/שבב מיקרופלואידים (ארה ב 7419822 B2, אריתרופואיטין 2719756 B1) והוא חבר של Xona מיקרופלואידיקה, LLC.

שבב COC מראש multi-תא הוא קל לשימוש הפלטפורמה מידור כדי להבדיל ולשמור על האדם NSCs לתוך נוירונים לטווח ארוך (> 4 שבועות). בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את הבידול של האדם NSCs לתוך הנוירונים glutamatergic, לעצב העצב הרטרוגרדי, לבצע החיסונית, הדמיה מורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטי ולבצע היפוך. שבבים אלה תואמים הדמיה ברזולוציה גבוהה, אין פלואורסצנטית אוטומטי עם COC12.
COC שבבי multi-תא הם שווי מבחינה פונקציונלית התקנים ממוזגים מבוססי סיליקון, ויש להם יתרונות וחסרונות כמתואר בעבר12. טבלה 1 משווה שבבי coc מרובי-תאים והתקני סיליקון עבור Culturing hsc-נוירונים. שבבי COC ממדר מספקים משטח הידרופילי טוב יותר להחזקה ואחזקה של תאי גזע לאורך תקופת תרבות ארוכה. התקנים מבוססי PDMS צריך להיות מורכב ומצורף כיסוי זכוכית. הטבע ההידרופובי של התקני PDMS גורם לצבירת תאי גזע5; זה מוביל את שני האתגרים בהדמיה ברמה התאית ורגישות גבוהה יותר לנזק פיזי עקב התנועה של אגרגטים תאים במהלך שינויי מדיה. שבב הפלסטיק גובר על האתגרים הללו. COC הוא אטום גז, בניגוד PDMS, כך האוויר כיסים לכודים או נוצר בתוך הערוצים יש להסיר על ידי המשתמש. הפתרון טרום ציפוי מפחית את האפשרות אוויר להיות לכוד בערוצים. פתרון זה כולל אתנול וסוכנים אחרים. פרוטוקול שפורסם בעבר עבור נוירונים culturing מורטין בתוך שבבי פלסטיק אלה מספק פרטים נוספים על ליטוף תאים ומדיה בתוך האסימונים12. NSCs הם שבריריים יותר כי נוירונים מורטין, כך יש לטפל בעדינות רבה יותר. זה גם קריטי לערבב את תאי הגזע ביסודיות לפני ציפוי על ידי מלטף אותם בעדינות למעלה ולמטה.
השימוש בנוירונים הנגזרים מתוך הבדיל בתאי גזע האדם הופך להיות פופולרי יותר ויותר ברפואה ובמחקר. נוירונים אלה חשובים עבור מחקר ויישומים קליניים עבור הפרעות המוח הרבות, כולל מחלות ניווניות ופציעות מוחית טראומטית. הנוירונים האלה דומים מאוד. לנוירונים העוברי אדם15 בעתיד, הנוירונים בגילאי כראוי יכול להיווצר מתאי גזע לחקות פונקציה עצבית הקשורים לגיל ומשמש בשילוב עם המכשירים האלה מידור. התקנים אלה יקל על המחקר במחלות המשפיעות על בריאות ותפקוד של אקסון כגון ליקויים אקסון הנוירונים של חולים שאובחנו עם הפרעות ספקטרום האוטיזם התחדשות אקסון לאחר פציעה16,17.

תא גזע האדם הבדיל נוירונים (hSC-נוירונים) משמשים יותר ויותר למחקר ביולוגי. נוירונים אלה, אשר ניתן לגזור מחומר המקור האנושי, הם בעלי עניין רב למחקר טרנסלטיות, כולל לימוד של פציעות מוח טראומטי והפרעות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר. לכן, כלים לשיפור ולהקל על המחקר של hSC-נוירונים הם ביקוש.
כדי ללמוד את מורפולוגיה מקוטב ייחודי של נוירונים, חוקרים רבים להשתמש מכשירים מיקרופלואידיג multi-מידור1,2,3,4,5,6, . 7,8,9,10,11 מכשירים אלה מאפשרים מדידות ומניפולציות של נוירונים ארוכים הקרנה עם גישה subcellular ייחודי. מכשירים מיקרופלואידים בעלי מספר רב מורכבים משני תאי מיקרו-פלואידים מקבילים באמצעות מיקרוחריצים, אשר מנחים את הצמיחה המיונלית. נוירונים או תאי גזע עצביים (NSCs) מצופים בתא הסודנדריטי, ולאחר מכן לדבוק בחלק התחתון של משטח התא לאחר דקות. נוירונים הבדיל לצמוח ולהאריך axons שלהם/תחזיות דרך האזור microgroove לתוך תא axons סמוך ומבודד. בעבר, התקנים אלה נעשו באופן בלעדי באמצעות פולי (diמתיל siloxane) (PDMS) דפוס העתק. התקני PDMS יש חסרונות רבים תיאר בעבר12, כולל hydrophobicity מתמשך ואת הצורך להרכיב שמיכות זכוכית מיד לפני השימוש. מורכב מראש הזרקה שבבים להתגבר על רבים מחסרונות אלה נמכרים מסחרית (ראה לוח חומרים)12. התאים של שבבים אלה נעשים לצמיתות הידרופילי והשבב כולו הוא הזרקה יצוק מחזורית שקופה אופטית אולפין (coc).
פרוטוקול זה מדגים כיצד להשתמש בשבב COC זה כדי להבדיל בין NSCs אנושיים לתוך הנוירונים, ולהפריד ולבודד את התחזיות הנוירואליות הארוכות שלהם. עבור הפגנה זו, נוירונים הובלו מאושר NIH תאי גזע H9. הליכים דומים ניתן להשתמש כדי להבדיל בין האדם המושרה pluripotent תאי גזע.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor hydrazide 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A10436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti_beta-tubulin III</td>
			<td>Aves</td>
			<td>TUJ</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-vGAT antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>131 003</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-vGlut1 antibody</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>75-066</td>
			<td>clone N28/9, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>complete neural stem cell media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;REC HU EGF 
			10 UG BIOSOURCE (TM)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td>20ng/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REC HU FGF BASIC 
			10 UG BIOSOURCE (TM)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td>20ng/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>2mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>12660012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Neural Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1050801</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence imaging system</td>
			<td>EVOS Fluorescence imaging system</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td>10x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorinated ethylene propylene film</td>
			<td>American Durafilm</td>
			<td>50A</td>
			<td>0.5 mil thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS without Calcium and Magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIBCO HUMAN NSC (H9) KIT 
			COMBO KIT 
			&#160; 
			&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>N7800200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Laminin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7095D5X SIGMA</td>
			<td>5.75 in length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9-DERIVED HU NEURAL STEM CELL 
			1E6 CELLS/VIAL; 1 ML&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>510088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hibernate-E Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1247601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 5% CO2 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000RS</td>
			<td>30x silicone oil objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modified rabies virus</td>
			<td>Salk Institute for Biological Studies</td>
			<td>G-deleted Rabies-eGFP</td>
			<td>Material Transfer Agreement required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural differentiation media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Per 100 mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240112</td>
			<td>1mL (100X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>200mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PHC7074</td>
			<td>40 ng/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco B27 Plus Supplement (50X)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td>2mL (50X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco CultureOne Supplement (100X)&#160;</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>A3320201</td>
			<td>1mL (100X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Neurobasal Plus Medium</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>A3582901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taylor Wharton Liquid N2 dewar</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>20HCB11M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XC pre-coat&#160;</td>
			<td>Xona Microfluidics, LLC</td>
			<td>XC Pre-Coat</td>
			<td>included with XonaChips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChip</td>
			<td>Xona Microfluidics, LLC</td>
			<td>XC450</td>
			<td>450 &#181;m length microgroove barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifier Tray</td>
			<td>Xona Microfluidics, LLC</td>
			<td>humidifier tray</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

compartmentalization of human stem cell-derived neurons within pre-assembled plastic microfluidic chips

שימוש במכשירים microflu, כדי למדר נוירונים מתורבתים הפכה לשיטה סטנדרטית במדעי המוח. פרוטוקול זה מראה כיצד להשתמש מראש התאספו שבב רב-ממדי שנעשו מחזורית אולפין (coc) כדי למדר נוירונים הבדיל מתאי גזע אנושיים. טביעת הרגל של שבבי COC אלה זהה לשקופית מיקרוסקופ רגיל והם תואמים באותה מידה למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. נוירונים מובלים מתאי גזע האדם העצבי (NSCs) לתוך הנוירונים glutamatergic בתוך השבב ומתוחזק במשך 5 שבועות, המאפשר זמן מספיק עבור נוירונים אלה כדי לפתח את הסינפסות ושעת הדנדריטים. יתרה מזאת, אנו מדגימים הליכים משותפים ניסיוניים מרובים באמצעות אלה שבבי multi-תא, כולל תיוג ויראלי, הקמת מיקרוסביבות, האקסון, ו אימונוטוקוכימיה.

לאחר שבוע אחד (7-10 ימים) בשבב עם בידול מדיה, NSCs להבדיל לנוירונים ותחזיות עצבי להיכנס לתוך תא סיבי (איור 3). בתוך השבב, נוירונים לצרף ולהפיץ באופן שווה בתוך התא הסומטית. בהשוואה, נוירונים בתוך התקנים PDMS הקמת/צבירה מוקדם ככל 5 ימים תוספת ההודעה של בידול מדיה, המוביל בריאות התא נפרץ כפי שניתן לראות באיור 3B (יום 13 התמונה המוגדל). נוירונים בצ נראים בריאים עם axons ארוזות. נוירונים בריאים ניתן לשמור בתוך האסימונים עבור 4-5 שבועות.
כדי להמחיש התבגרות העצב ופיתוח עמוד השדרה הדנדריטי, וירוס כלבת שונה נמסר לעבר תא סיבי ביום 29 כדי התוויות הנוירונים נסיגה, כולל שדרה הדנדריטים, עם חלבון פלורסנט mcherry. ארבעה ימים לאחר זיהום וירוס הכלבת, נוירונים הארכת אקסונים לתוך תא אקסונים הביע mcherry. הנוירונים ב33 היום הראו היווצרות של השדרה הדנדריטי (איור 4). ויזואליזציה של השדרה הדנדריטי מראה כי הנוירונים המועצה הבין לאומי נגזר הבדיל בתוך השבבים בוגרים טופס.
השבב הרב-ממדי מתאים גם ללוקליזציה של כימיה חיסונית כדי להמחיש את ההתאמה התאית של חלבונים. לאחר 26 ימים של שמירה על נוירונים בחומרי הבחנה, הנוירונים סומנו לסמן הסינפטית הvGlut1 (איור 5). תוצאות אלה מראים כי virally התווית הנוירונים שיתוף לוקליזציה עם vGlut1 (איור 5E) ו תא העצב סמן ספציפי, β-טובולין III (איור 5E-H).
היכולת ליצור מיקרוסביבות שונות מבודדים לאקסונים הפגינו גם באמצעות אלקסה Fluor 488 הידרזידה, צבע פלורסנט נמוך במשקל מולקולרי (איור 6).
מחקרי הפציעה axon מבוצעים בדרך כלל בתוך מכשירים מידור. הוכחה של ניסוי עקרוני בוצעה באופן סלקטיבי לפגוע אקסונים של נוירונים הבדיל עם שבב coc התאספו מראש (איור 7). התוצאות היו שוות ערך למכשירים מידור סיליקון6,13,14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig1.jpg"> איור 1: ה-COC התאספו מראש, שבב מיקרופלואידיג רב-ממדי. (א) ציור של השבב המזהה את הבארות העליונות והתחתונות. גודל השבב הוא 75 mm x 25 מ"מ, בגודל של שקופיות מיקרוסקופ רגיל. (ב) אזור מוגדלת המציג את הערוצים והמיקרוחריצים המפרידים בין הערוצים. פרטים נוספים מסופקים בנינדרדרן ואח '12. (ג) צילום זה ממחיש את היצירה של מיקרוסביבות מבודדות בתוך כל תא באמצעות צבע צביעה מזון. . כל הדמות הזו שושנה מ -12 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig2.jpg"> איור 2: ציפוי שבב ממדר פלסטיק והציפוי של תאים למועצה לבטחון לאומי. (א) שבבים מרובי פלסטיק היו מצופים בתמיסה טרום-ציפוי, ולאחר מכן פולי-אל-אורתך ולמינציה לפני התניה מראש עם מדיה של המועצה לבטחון לאומי. (ב) NSCs מצופים עם 7 x 104 תאים בתא הסומטיים של השבב. התאים גדלו בתקשורת של המועצה לבטחון לאומי במשך 24 שעות ואז התקשורת הוחלפה בתקשורת הבחנה עצבית. נוירונים הבדיל נצפו על ידי 7-10 ימים לאחר בידול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig3.jpg"> איור 3: השוואת הגדילה hSC-תא השוואה ב אסימונים ו-PDMS התקנים. (א) תמונת חדות פאזה של hsc-נוירונים גדל 13 ימים לאחר בידול שבב מרובה הפלסטיק. (ב) מוגדלת באזור של hsc-נוירונים תרבותי בתוך התיבה הלבנה (א) ואזור שווה ערך בתוך מכשיר pdms (מימין). hSC-נוירונים בתוך האסימונים לצרף היטב. הטופס מצטבר אשכולות בהתקנים מבוססי PDMS. נציג 2 ניסויים עצמאיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig4.jpg"> איור 4: הנוירונים לבטחון לאומי הנגזרים מראים מורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטים. רטרוגרדי בעלי תווית של תא עצב mCherry בבידול יום 33 גדל בתוך השבב. האזור המוגדל המתואר באדום, מדגיש את הנוכחות של הקוצים הדנדריטים, אשר מספקים ראיות התומכות בפיתוח של הסינפסות glutamatergic בוגרת. החיצים האדומים מצביעים. לעבר השדרה הדנדריטית <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig5.jpg"> איור 5: האדם המועצה לבטחון לאומי הנגזרת מהנוירונים המתורחיים בתוך התצוגה הסינפסות. כתמים בוצע בבידול יום 26. הדמיה של תא העצב בוצעה בתוך תא הסומטיים. A) vGlut1 (ירוק) ו-(ב) dapi (כחול) האימונואולבלינג. (ג) משתמשים בנגיף הכלבת המסומן בווירוס שהשתנה. (ד) מיקרוגרף פלורסנט ממוזג של (A-C). (ה) השדרה הדנדריטית ו vGlut1 חיובי מקומי עם הדנדריטים mcherry-חיובי, המוצג באזור מוגדלת מ (ד). מיקרוגרפים מבוססי מיקרו-גרף (F) תא מיוחד סמן, β-טובולין III (מגנטה) ו (G) vGlut1 (ירוק). (ח) כיסוי של β-טובולין III ו-vGlut1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig6.jpg"> איור 6: התמרה וסתית ' מהנוירונים מרחיבים את התחזיות לתוך מיקרו-סביבה מקומית הוקמה בתוך שבב COC התאספו מראש. (A) מצ התווית תא העצב להאריך אקסונים דרך מיקרוחריצים של השבב לתוך האקסון מבודד תא. בידוד של תא אקסון הוא דמיינו באמצעות אלקסה fluor 488 הידרזידה. הדמיה של נוירונים התרחשה בבידול יום 26 ו 3 ימים לאחר הידבקות עם וירוס כלבת שונה. (ב) התמונה הפלואורסצנטית ב (א) ממוזגת עם תמונה DIC. שים לב למיקום המיקרו-חריצים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig7.jpg"> איור 7: האקפיום מבוצע בתוך שבב מרובת התאים של COC. (א) מצ'רי הנקראת נוירונים ב33 היום היתה התמונה לפני הפיום. שולחן המראה של ' אש ' בצבע. (ב) מיד לאחר הפיום, מראה שאקטונים נותקו לחלוטין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שבבים פלסטיים מרובי-תא</td>
			<td>התקנים מרובי-מחלקה של PDMS</td>
		</tr>
<tr>
<td>בידוד אקטונס</td>
			<td>בידוד אקטונס</td>
		</tr>
<tr>
<td>יצירת סביבות מיקרו</td>
			<td>יצירת סביבות מיקרו</td>
		</tr>
<tr>
<td>אקאוטומיזציה לנוירונים</td>
			<td>אקאוטומיזציה לנוירונים</td>
		</tr>
<tr>
<td>שקוף בצורה אופטית</td>
			<td>שקוף בצורה אופטית</td>
		</tr>
<tr>
<td>תואם לדימות ברזולוציה גבוהה</td>
			<td>תואם לדימות ברזולוציה גבוהה</td>
		</tr>
<tr>
<td>תואם למיקרוסקופיה פלואורסצנטית</td>
			<td>תואם למיקרוסקופיה פלואורסצנטית</td>
		</tr>
<tr>
<td>התאספו במלואו</td>
			<td>הרכבה למצע הדרוש</td>
		</tr>
<tr>
<td>אקסונים בריאים > 21 ימים</td>
			<td>אקסונים בריאים > 14 ימים</td>
		</tr>
<tr>
<td>משטח culturing הידרופילי</td>
			<td>ידרופוביות</td>
		</tr>
<tr>
<td>גז אטום</td>
			<td>ניתן לחדור לגז</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיקרוחריצים וערוצים מעוגלים</td>
			<td>מיקרוחריצים ישרים</td>
		</tr>
<tr>
<td>לא תואם אבלציה לייזר</td>
			<td>ניתן להשתמש עבור אבלציה לייזר כאשר התאים PDMS מורכבים על שקופיות תואם אבלציה לייזר מיוחד.</td>
		</tr>
<tr>
<td>אין אפשרות לשנות את ההתקן כדי להסיר את החלק העליון</td>
			<td>העליון הוא נשלף לצביעת בתוך מיקרו-חריצים</td>
		</tr>
<tr>
<td>לא תואם שמני טבילה מבוססי שמן מינרלים (שמנים מבוססי סיליקון הם בסדר)</td>
			<td>תואם שמני טבילה מבוססי שמן מינרלי</td>
		</tr>
<tr>
<td>בלתי מסוגל למולקולות קטנות וממיסים אורגניים</td>
			<td>ספיגת מולקולות קטנות & ממיסים אורגניים</td>
		</tr>
<tr>
<td>אין בעיות דליפה עם השבב</td>
			<td>ציפוי בעזרת פולי אל אורתך ולמינציה להפוך את המכשירים לדליפה</td>
		</tr>
<tr>
<td>נוירונים הבדיל להישאר מופץ באופן שווה (> 4 שבועות) בצפיפויות התא נבדק</td>
			<td>נוירונים הבדיל מתחילים לצבור אחרי 3-4 ימים בתרבות בצפיפויות התא נבדק</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: השוואת שבבי COC מרובי-תאים ומתקני סיליקון לנוירונים בתפירה

Watch this Scientific Journal Video about Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips at JoVE.com

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

מידור של תאי גזע האדם הנגזרים בתוך שבבי מיקרופלואידיג פלסטיק מורכבים מראש

פרוטוקול זה מדגים את השימוש של שבבי microflu, ממדר מיקרופלואידים, הזרקה מחזורית אולפין קופולימר לנוירונים מתורבתים הבדיל מתאי גזע אנושיים. שבבים אלה מורכבים וקלים לשימוש מאשר התקנים ממוזגים פולי (diמתיל siloxane) מסורתיים. מספר תפיסות נסיוניות נפוצות מתוארות כאן, כולל תיוג נגיפי, בידוד פלואידיג, הוספת פיום וכתמים חיסוני.

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

מכשירים מיקרופלואידיים ממודרים מאפשרים לנוירונים להיחקר בצורתם המקוטבת ביותר. מכשירים אלה הם אינסטרומנטליים למחקר מדעי המוח בסיסי ותרגום. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בשבבי קופולימר אולפין מחזוריים כדי למדר נוירונים המובדלים מתאי גזע אנושיים.שבבי COC אלה מייצרים תרבויות בריאות יותר של נוירונים מובחנים על פני התקנים מרובי תאים של PDMS. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את תרבות הנוירונים המובדלים מקו תאי הגזע H9 שאושר על ידי NIH. הליכים דומים יכולים לשמש כדי להבדיל נוירונים מ mIPSCs.השבבים מרובי התאים חייבים להיות ממוקמים בלימה משנית עם לחות נוספת. יש למלא את הערוצים של השבבים מרובי התאים בתת פתרון מעיל מקדים ולאחר מכן לשטוף אותם עם PBS. כדי להתחיל, להמיס פולי-L-ornithine בתרבות התא כיתה מים מזוקקים כדי להפוך 600 microliters של פתרון לכל שבב.שאף את PBS הנותרים מן בארות, לוודא כי טיפ פיפטה הוא הרחק פתיחת הערוץ. טען 150 מיקרוליטרים של פתרון עבודה פולי-L-ornithine היטב הימנית העליונה. המתן 90 שניות והוסף 150 מיקרוליטרים של הפתרון לתחתון הימני היטב.המתן חמש דקות וחזור על תהליך הטעינה עם הפתרון ל בארות השמאליות. לאחר מכן, מניחים את מגש מכשיר האדים עם שבב בארבע מעלות צלזיוס לילה. אם משתמשים בצלחת פטרי, עוטפים אותה בפרפילם וממקמים אותה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.לאחר מכן, שאף את הפתרון מה בארות, להבטיח כי טיפ פיפטה ממוקם הרחק פתיחת הערוץ. וחזרה על טעינת בארות ימין ושמאל עם 150 מיקרוליטרים כל אחד מהמים הסטריליים פעמיים. הכן את פתרון העבודה של למינין.לטעון את בארות ימין ושמאל עם 150 microliters כל אחד פתרון העבודה למינין. דגירה השבב בתוך המגש במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס. שוטפים את השבב עם PBS ללא סידן ומגנזיום.טען את בארות ימין ושמאל עם 150 microliters כל אחד PBS. חכה חמש דקות. שאפו את ה-PBS מה בארות ושטוף את השבב עם התקשורת של המל"ל.טען את בארות ימין ושמאל עם 150 מיקרוליטרים כל אחד מהתקשורת של המל"ל. הדגירה את השבב במגש לילה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 כדי להתנות מראש את השבב. כדי לזרוע תאי גזע עצביים אנושיים לתוך השבב מרובה התאים, לספור תחילה את ריכוז התא באמצעות hemocytometer.לאחר מכן, שאף את התקשורת מה בארות. פיפטה חמישה מיקרוליטרים של פתרון התא ל הבאר הימנית העליונה, ואחריו חמישה מיקרוליטרים ל הבאר הימנית התחתונה. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק שתאים נכנסו לערוץ.המתן חמש דקות עד שתאים ידבקו לתחתית השבב. פיפטה כ-150 מיקרוליטרים של תקשורת המל"ל לאורך בארות ימין ושמאל. דגירה ב 5% CO2, 37 מעלות צלזיוס בתוך מיכל לח מתאים.לאחר 48 שעות, שאף את התקשורת של המל"ל מה בארות והחלף אותה במדיה של התברואה עצבית על ידי הוספת 150 מיקרוליטרים לכל באר תחתית ולכל באר תחתונה. תאי עצב תרבותיים בתוך חממה של 5%CO2, 37 מעלות צלזיוס בתוך מגש אדים. מוציאים את אמצעי ההבחנה העצבית הנותרים מהמדור האקסונאלי וממקם אותו בצינור צנטריפוגה.יש לאחסן ב-37 מעלות צלזיוס. מערבבים 50 מיקרוליטרים של פתרון הנגיף עם 150 מיקרוליטרים של המדיה החמה. פיפטה 100 מיקרוליטרים של התערובת לשתי בארות תא האקסון.אינקובט למשך שעתיים בתוך חממה של 37 מעלות צלזיוס. לסגת ולהיפטר מדיה המכילה וירוסים. בעדינות pipette 75 microliters של המדיה הטרייה לתא אקסון אחד היטב ולתת התקשורת לזרום דרך הערוץ לתוך אקסון אחר היטב.חזור על תהליך זה פעם אחת. לבסוף, מלאו את תא האקסון במדיה השמורה והעברו את השבב לאנקובטור. לאחר שבוע בשבב עם אמצעי ההבחנה, תאי גזע עצביים אנושיים נבדלו לנוירונים, מחוברים ומופצים באופן שווה בתוך התא סומטי.לשם השוואה, נוירונים במכשירי PDMS מצטברים כבר חמישה ימים לאחר הוספת מדיה ההידול, המוביל לבריאות התא נפגע. הדמיה של נוירונים מסומנים וקוצים דנדריטיים עם חלבון פלואורסצנטי mCherry הראה כי נוירונים שמקורם ב- NSC מובחנים בתוך השבבים יוצרים סינפסות בוגרות. נוירונים תויגו עבור סמן סינפטי סינפטי סינפטי סינפסיה סינפטית, vGlut1.תוצאות immunostaining מראות כי נוירונים שכותרתו ויראלית יכול במשותף לוקליזציה עם vGlut1, ו סמן נוירון ספציפי, בטא-tubulin שלוש. נוירונים mCherry מתמר באופן ויראלי להרחיב את התחזיות לתוך microenvironment מקומי אקסון הוקמה בתוך השבב שהורכב מראש. השוואה בין התמונות של mCherry שכותרתו נוירונים לפני ומיד לאחר אקסוטומיה הראה אקסונים מנותקים לחלוטין.זה קריטי כדי לוודא כי הערוצים להישאר מלא נוזלים למעט בעת ביצוע הליך האקסוטומיה. שבבים ממודרים COC קלים לשימוש והוא יכול לפתוח את הדלת חקירות רבות הקשורות לפציעה עצבית, synaptogenesis, פלסטיות סינפטית, ופתופיזיולוגיה של המחלה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

הערכה תפקודית של ביולוגי עצבי בתרבויות ברשת של תאי גזע שמקורם בנוירונים במערכת עצבים מרכזי

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

דגמי Zika בנגיף של ה בפיתוח המוח האנושי במבחנה באמצעות תאי גזע נגזר Organoids מוחי

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

דור פשוטה של תרבות תשואה גבוהה של נוירונים המושרה מ Fibroblasts עור מבוגר

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

שיטת עבור מהירות גבוהה מתיחה פציעתו של האדם המושרה נוירונים נגזר תאי גזע Pluripotent בתבנית 96-ובכן

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons

שימוש של שבבי Microfluidic פלסטיק מראש ממדר נוירונים מאתר העיקרי

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

לאחר בידול מחדש של תא גזע האדם Pluriפוטנטי-הנוירונים הנגזרים עבור הקרנת תוכן גבוה של Neuritogenesis והתבגרות סינפסה

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

ניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה בתאי גזע בעלי השפעה של האדם המושרה בנוירונים

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

השתלה תת-רשתית של רקמת רשתית שמקורה בתאי גזע עובריים אנושיים במודל של בעלי חיים גדולים אצל חתולים

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...