Name: compartmentalization of human stem cell-derived neurons within pre-assembled plastic microfluidic chips
Uploaded: 2019-05-03T13:00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips at JoVE.com

Авторы признают поддержку со стороны Xona Microfluidics, LLC, Национального института психического здоровья (R42 MH097377) и Национального института неврологических расстройств и инсульта (R41 NS108895, P30 NS045892). Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения.

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1A,B показана схема предварительно собранного чипа COC, включая расположение основных каналов или отсеков, колодцев и микрогров. Разрозненный чип может установить различные жидкости микросреды в отсеке, как показано на изоляции пищевой краситель красителя(рисунок 1C). Протокол для подготовки предварительно собранного мульти-купе чипа дается в Nagendran и др., раздел 112.
1. Покрытие мульти-купе чипов для hSC-нейронов
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2A показан обзор процедур покрытия.
<ol><li>Растворите поли-L-орнитин в дистиллированной воде культуры клеток, чтобы сделать 600 л раствора на чип рабочего раствора 20 мкг/мл.</li>
	<li>Приготовьте оставшиеся PBS слева после подготовки чипсов из скважин. При успомении убедитесь, что кончик трубы находится вдали от открытия канала. ПРИМЕЧАНИЕ: Микрофлюидные каналы должны оставаться заполненными в течение всей этой процедуры. Не аспирируйте жидкость из каналов/отсеков, только колодцы.</li>
	<li>Нагрузка 150 Л поли-L-орнитинов рабочего раствора в верхнем правом колодце. Подождите 90 с или до тех пор, пока жидкость не начнет заполнять нижний правый хорошо. Добавьте 150 л носителей в нижний правый цвет и подождите 5 минут, чтобы жидкость прошла через микрогры.</li>
	<li>Добавьте 150 л носителей в левый верхний цвет. Подождите 90 с, а затем добавить 150 л в левом нижнем колодце хорошо. Оберните держатель чипа (ы) с parafilm и поместите на 4 кв на ночь. ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, поместите чип и держатель на 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч.</li>
	<li>Призадыхайтесь от носителей из скважин, гарантируя, что трубчатый наконечник находится вдали от открытия канала. Добавьте 150 л стерильной воды в верхний правый колодец. Подождите 90 с, а затем добавить 150 Л л в правом нижнем правом колодце. Подождите 5 минут, чтобы жидкость прошла через микрогры.</li>
	<li>Добавьте 150 л стерильной воды в левый верхний цвет, подождите 90 с, а затем добавьте еще 150 л в левый нижний.</li>
	<li>Повторите шаги 1.5-1.6.</li>
	<li>Оттаиваете ламинин медленно при 2-C до 8 градусов по Цельсию и подготовить 10 мкг /мл рабочего решения.</li>
	<li>Загрузите 150 л рабочего раствора ламинина в верхний правый укрядно. Подождите 90 с или до тех пор, пока жидкость не начнет заполнять нижний правый хорошо. Пипер 150 Л л в правом нижнем правом колодце. Подождите 5 минут, чтобы ламинин пройти через microgrooves.</li>
	<li>Добавьте 150 л ламинина в левый верхний цвет. Подождите 90 с, а затем добавить 150 л в левом нижнем колодце хорошо. Инкубировать чип в пределах его держателя в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия.</li>
	<li>Промыть чип с помощью PBS (без Ca2 и Mg2 "). Загрузите 150 Л ПБС в верхний правый колодец. Подождите 90 с или до тех пор, пока жидкость не начнет заполнять нижний правый хорошо. Добавьте 150 л PBS в нижний правый колодец и подождите 5 минут, чтобы PBS пройти через микрогры.</li>
	<li>Пиперт 150 Л PbS в верхний левый колодец. После 90 с пайптун 150 л в левом нижнем колодце.</li>
	<li>Аспирировать PBS от чипа, а затем промыть чип с NSC средств массовой информации (см. Таблица материалов). Загрузите 150 л носителей в верхний правый колодец. После 90 с или когда жидкость проходит через правый канал в нижний правый хорошо, добавить 150 Зл в правом нижнем правом хорошо. Подождите 5 минут, чтобы средства массовой информации течь через microgrooves.</li>
	<li>Добавьте 150 л носителей к верхнему левому колодцу и еще 150 кЛ в нижний левый колодец. Инкубировать чип в инкубаторе 37 градусов с 5% CO 2, чтобы предварительно кондиционировать чип до готовности к семени NSCs. ПРИМЕЧАНИЕ: Чипсы могут быть предварительно кондиционированы на ночь, если это необходимо.</li>
</ol>2. Посев NSCs в многокомпонентный чип
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол используется коммерчески приобретенных NSCs, в отличие от нашей предыдущей публикации, которая началась с человеческих эмбриональных стволовых клеток5. В этом протоколе нервные стволовые клетки покрыны непосредственно в пластиковые чипы, где они дифференцируются в нейроны. Клетки могут размножаться как НСК (без дифференциации) до 2 проходов и храниться во флаконах в жидкости N2 для дальнейшего использования. Этот протокол использует флаконы NSC, хранящиеся в жидкости N2 после прохождения 1 или 2. На рисунке 2B показан обзор процедур покрытия.
<ol><li>Оттепель NSCs в соответствии с инструкциями производителя. ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура применяется к NSCs h9-производное. Другие клеточные линии потребуют оптимизации плотности клеток.</li>
	<li>Подсчитайте концентрацию клеток с помощью гемоцитометра и отрегулируйте с помощью носителей NSC, чтобы получить концентрацию 7 х 106 ячеек на мл.</li>
	<li>Аспирные носители из каждой скважины чипа. Избегайте аспирации носителей с основных каналов.</li>
	<li>Пипет 5 зл клеточного раствора в правом верхнем углу скважины, а затем 5 Зл в нижней правой скважине (70000 клеток всего). Убедитесь, что ячейки пипетки к основным отверстиям канала. Используйте микроскоп, чтобы проверить, что клетки вошли в канал. Подождите 5 минут, пока клетки прилипут к нижней части чипа. ПРИМЕЧАНИЕ: Любой или оба отсека могут быть использованы для загрузки клеток.</li>
	<li>Пипом 150 л носителей NSC в правом верхнем углу, а затем 150 зл. Повторите на левой стороне. Инкубировать при 5% CO2,37 градусов по Цельсию в подходящем увлажненного контейнере.</li>
	<li>После 48 часов, аспирировать NSC средств из скважин и заменить нервной дифференциации средств, добавив 150 qL к каждой верхней скважины и каждого дна хорошо.</li>
	<li>Культурные нейроны впределах 5% CO 2, 37 C инкубатора в подходящем увлажненного контейнере. ПРИМЕЧАНИЕ: Средства массовой информации должны быть заменены каждые 2-3 дня. Из-за небольших объемов, используемых в чипе, испарение даже в увлажненный инкубатор может существенно повлиять на жизнеспособность клеток. Используйте подходящий вторичный контейнер для обеспечения дополнительной влажности для долгосрочной культуры клеток с чипом (см. Таблицаматериалов).</li>
</ol>3. Вирусная флуоресцентная маркировка hSC-нейронов внутри чипа
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько вирусов может быть использован для обозначения нейронов в чипе. Инструкции ниже описывают использование G-удаленных бешенства-mCherry или -eGFP вируса. Потенциально инфекционные материалы должны обрабатываться в соответствии с применимыми правилами и положениями и могут потребовать дополнительной подготовки и институционального утверждения.
<ol><li>Теплый 400 евро свежих нервных носителей дифференциации на чип до 37 градусов по Цельсию.</li>
	<li>Удалите 50 л носителей из одного колодца аксонового отсека в центрифужную трубку, а затем добавьте в трубку 100 000 вирусных единиц модифицированного вируса бешенства. ПРИМЕЧАНИЕ: Правильно распоряжаться отработанные кончики трубы и центрифуги труб, содержащих вирус.</li>
	<li>Удалите оставшиеся нервные дифференциации из аксонального отсека и поместите в центрифужную трубку. Хранить при 37 градусах По Цельсию. ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что каналы остаются заполненными жидкостью.</li>
	<li>Смешайте 50 л раствора вируса с 150 л разогретых носителей. Пипер 100 л к одной скважине аксона отсека и 100 Зл к другому отсеку аксона хорошо. Инкубировать в течение 2 ч в пределах инкубатора 37 градусов по Цельсию. ПРИМЕЧАНИЕ: Разница в объемах между аксональными и соматическими отсеками помогает обеспечить пребывание вируса в аксональном отсеке во время инфекции/инкубационного времени.</li>
	<li>Изъять и избавиться от вирусных носителей. ВНИМАНИЕ: Не удаляйте жидкость в закрытых микрофлюидных каналах.</li>
	<li>Аккуратно pipet 75 л свежих носителей в один аксон отсек хорошо и пусть средства массовой информации текут через канал в другой аксон хорошо.</li>
	<li>Удалить носители из аксона отсека и распоряжаться должным образом.</li>
	<li>Повторите шаги 3.6 и 3.7.</li>
	<li>Заполните отсек аксона сохраненными носителями. Pipet дополнительные 50 л свежих носителей, если это необходимо, а затем вернуть чип в инкубатор. Это дополнительные свежие средства массовой информации, чтобы рассчитывать на потерю средств массовой информации во время передачи жидкости и испарения во время процесса. ПРИМЕЧАНИЕ: Видимая флуоресцентная маркировка с использованием этих модифицированных вирусов бешенства происходит на 48 ч и до 8 дней, после чего клеточная смерть инфицированных нейронов обычно происходит из-за токсичности вируса. Нейронная визуализация может быть выполнена как с другими стандартными платформами культуры (например, стеклянные блюда на дне), но особое внимание необходимо для поддержания достаточной влажности, чтобы предотвратить испарительные потери.</li>
</ol>4. Флюидическая изоляция, акотомия и иммуностоина внутри чипа
<ol><li>Следуйте жидкостной изоляции, акотомии, и иммунонаблюдения с чипом, как описано в Nagendran и др.12.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+translation+of+beta-catenin+regulates+synaptic+vesicle+dynamics.">Axonal translation of beta-catenin regulates synaptic vesicle dynamics.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Virlogeux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+Corticostriatal+Network+on-a-Chip+Reveals+the+Contribution+of+the+Presynaptic+Compartment+to+Huntington&#8217;s+Disease.">Reconstituting Corticostriatal Network on-a-Chip Reveals the Contribution of the Presynaptic Compartment to Huntington&#8217;s Disease.</a> Cell Reports. 22 (1), 110-122 (2018).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+&#60;em&#62;In+Vitro&#60;/em&#62;+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of &#60;em&#62;In Vitro&#60;/em&#62; Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Pinto, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteasome+controls+presynaptic+differentiation+through+modulation+of+an+on-site+pool+of+polyubiquitinated+conjugates.">The proteasome controls presynaptic differentiation through modulation of an on-site pool of polyubiquitinated conjugates.</a> The Journal of Cell Biology. 212 (7), 789-801 (2016).</li><li>Bigler, R. L., Kamande, J. W., Dumitru, R., Niedringhaus, M., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNAs+localized+to+distal+projections+of+human+stem+cell+derived+neurons.">Messenger RNAs localized to distal projections of human stem cell derived neurons.</a> Scientific Reports. 7 (1), 611 (2017).</li><li>Nagendran, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distal+axotomy+enhances+retrograde+presynaptic+excitability+onto+injured+pyramidal+neurons+via+trans-synaptic+signaling.">Distal axotomy enhances retrograde presynaptic excitability onto injured pyramidal neurons via trans-synaptic signaling.</a> Nature Communications. 8 (1), 625 (2017).</li><li>Van Laar, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+compartmentalized+axonal+mitochondrial+biogenesis:+Mitochondrial+DNA+replication+increases+in+distal+axons+as+an+early+response+to+Parkinson&#39;s+disease-relevant+stress.">Evidence for compartmentalized axonal mitochondrial biogenesis: Mitochondrial DNA replication increases in distal axons as an early response to Parkinson&#39;s disease-relevant stress.</a> The Journal of Neuroscience. , (2018).</li><li>del R&#237;o, J. A., Ferrer, I., Gav&#237;n, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cellular+prion+protein+in+interneuronal+amyloid+transmission.">Role of cellular prion protein in interneuronal amyloid transmission.</a> Progress in Neurobiology. 165-167, 87-102 (2018).</li><li>Jia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+Regulates+Axonal+Growth+of+Dorsal+Root+Ganglia+Neurons+by+Targeting+FOXP2+and+VAT1+in+Postnatal+and+Adult+Mouse.">MiR-34a Regulates Axonal Growth of Dorsal Root Ganglia Neurons by Targeting FOXP2 and VAT1 in Postnatal and Adult Mouse.</a> Molecular Neurobiology. , (2018).</li><li>Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+local+perfusion+chambers+for+the+visualization+and+manipulation+of+synapses.">Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses.</a> Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).</li><li>Menon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3+Ubiquitin+Ligase+TRIM9+Is+a+Filopodia+Off+Switch+Required+for+Netrin-Dependent+Axon+Guidance.">The E3 Ubiquitin Ligase TRIM9 Is a Filopodia Off Switch Required for Netrin-Dependent Axon Guidance.</a> Developmental cell. 35 (6), 698-712 (2015).</li><li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons.">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (141), (2018).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li><li>Oh, J. H., Jung, C. R., Lee, M. O., Kim, J., Son, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Comparative+analysis+of+human+embryonic+stem+cellderived+neural+stem+cells+as+an+in+vitro+human+model."> Comparative analysis of human embryonic stem cellderived neural stem cells as an in vitro human model.</a> International Journal of Molecular Medicine. 41 (2), 783-790 (2018).</li><li>Lazar, M., Miles, L. M., Babb, J. S., Donaldson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+deficits+in+young+adults+with+High+Functioning+Autism+and+their+impact+on+processing+speed.">Axonal deficits in young adults with High Functioning Autism and their impact on processing speed.</a> Neuroimage Clinical. 4, 417-425 (2014).</li><li>DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatory+repair+strategy+to+promote+axon+regeneration+and+functional+recovery+after+chronic+spinal+cord+injury.">Combinatory repair strategy to promote axon regeneration and functional recovery after chronic spinal cord injury.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9018 (2017).</li></ol>

С.П. и Т.Н. не заявляют о конкуренции в финансовых интересах. В.П. является сотрудником ООО «Ксона Микрофлюитикс». JH является членом Xona Microfluidics, LLC. A.M.T. является изобретателем микрофлюидной камеры/чипа (US 7419822 B2, EPO 2719756 B1) и является членом Xona Microfluidics, LLC.

Предварительно собранный многокомпонентный чип COC является простой в использовании разобщенной платформой для дифференцирования и поддержания нНК человека в нейроны в течение длительного времени (Nogt;4 недели). В этом протоколе мы демонстрируем дифференциацию нНК человека на глутаматергические нейроны, ретроградные метеорные нейроны, выполняем иммуноцитохимию, визуализируем дендритную морфологию позвоночника и выполняем акотомию. Эти микросхемы совместимы с изображением с высоким разрешением и не имеют автоматического флуоресценции с COC12.
CoC многокомпонентные чипы функционально эквивалентны силиконовой основе разрозненных устройств, и имеют преимущества и недостатки, как описано ранее12. Таблица 1 сравнивает многокомпонентные чипы COC и силиконовые устройства для культивирования hSC-нейронов. Отсеканные чипы COC обеспечивают лучшую гидрофиницу поверхности для крепления и поддержания стволовых клеток в течение длительного периода культуры. Устройства на основе PDMS должны быть собраны и прикреплены к стеклянным крышкам. Гидрофобный характер устройств PDMS вызывает агрегацию стволовых клеток5; это приводит как к проблемам в визуализации на клеточном уровне, так и к большей восприимчивости к физическому повреждению из-за движения клеточных агрегатов во время изменений в средствах массовой информации. Пластиковый чип преодолевает эти трудности. COC является газнепроницаемым, в отличие от PDMS, поэтому воздушные карманы, захваченные или сформированные в каналах, должны быть удалены пользователем. Предварительное покрытие решение уменьшает возможность для воздуха, чтобы стать в ловушке в каналах. Это решение состоит из этанола и других агентов. Ранее опубликованный протокол для культивирования нейронов мурин в этих пластиковых чипов предоставляет дополнительную информацию о трубачающих клеток и средств массовой информации в чипы12. NSCs являются более хрупкими, что нейроны, поэтому должны быть обработаны более мягко. Кроме того, важно, чтобы смешать стволовые клетки тщательно перед покрытием, мягко pipetting их вверх и вниз.
Использование нейронов, полученных из in vitro дифференцированных стволовых клеток человека становится все более популярным в медицине и исследованиях. Эти нейроны имеют важное значение для исследований и клинического применения для многих заболеваний ЦНС, в том числе нейродегенеративных заболеваний и черепно-мозговых травм. Эти нейроны очень напоминают человеческие нейроны плода15. В будущем, надлежащим образом в возрасте нейронов могут быть созданы из стволовых клеток, чтобы имитировать возрастных нейронных функций и использовать в сочетании с этими разрозненные устройства. Эти устройства будут способствовать исследованиям в области заболеваний, влияющих на здоровье аксона и функции, такие как дефицит аксона в нейронах пациентов с диагнозом расстройства аутистического спектра и аксональной регенерации после травмы16,17.

Дифференцированные нейроны стволовых клеток человека (hSC-нейроны) все чаще используются для биологических исследований. Эти нейроны, которые могут быть получены из исходного материала человека, представляют большой интерес для трансляционных исследований, в том числе изучение черепно-мозговых травм и нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера. Таким образом, востребованы инструменты для улучшения и облегчения изучения hSC-нейронов.
Для изучения уникальной поляризованной морфологии нейронов, многие исследователииспользуют многокомпонентные микрофлюидные устройства 1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,11. Эти устройства позволяют измерения и манипуляции длинных проекционных нейронов с уникальным субклелярным доступом. Мульти-компонентные микрофлюидные устройства состоят из двух параллельных микрофлюидных отсеков, разделенных микрогрувами, которые направляют аксональный рост. Нейроны или нервные стволовые клетки (НСК) покрываются в соматодендритном отсеке, а затем прилипают к нижней поверхности отсека через несколько минут. Дифференцированные нейроны растут и расширяют свои аксоны/проекции через область микрогроув в соседний и изолированный аксональный отсек. В прошлом, эти устройства были исключительно сделаны с использованием поли (dimethylsiloxane) (PDMS) реплики литья. Устройства PDMS имеют много недостатков, описанных ранее12,включая стойкость гидрофобности и необходимость сборки на стеклянную крышку непосредственно перед использованием. Предварительно собранные инъекционные формованные чипы преодолевают многие из этих недостатков и продаются на коммерческой основе (см. Таблица материалов)12. Отсеки этих чипов постоянно производятся гидрофильные и весь чип инъекций формованных в оптически прозрачный циклический олефин copolymer (COC).
Этот протокол демонстрирует, как использовать этот чип COC, чтобы дифференцировать человеческие НСК в возбуждающие нейроны, и отделить и жидкости изолировать их длинные нейронные проекции. Для этой демонстрации, нейроны были дифференцированы от NIH утвержденных H9 стволовых клеток. Аналогичные процедуры могут быть использованы для дифференциации человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor hydrazide 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A10436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti_beta-tubulin III</td>
			<td>Aves</td>
			<td>TUJ</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-vGAT antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>131 003</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-vGlut1 antibody</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>75-066</td>
			<td>clone N28/9, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>complete neural stem cell media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;REC HU EGF 
			10 UG BIOSOURCE (TM)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td>20ng/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REC HU FGF BASIC 
			10 UG BIOSOURCE (TM)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td>20ng/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>2mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>12660012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Neural Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1050801</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence imaging system</td>
			<td>EVOS Fluorescence imaging system</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td>10x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorinated ethylene propylene film</td>
			<td>American Durafilm</td>
			<td>50A</td>
			<td>0.5 mil thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS without Calcium and Magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIBCO HUMAN NSC (H9) KIT 
			COMBO KIT 
			&#160; 
			&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>N7800200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Laminin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7095D5X SIGMA</td>
			<td>5.75 in length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9-DERIVED HU NEURAL STEM CELL 
			1E6 CELLS/VIAL; 1 ML&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>510088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hibernate-E Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1247601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 5% CO2 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000RS</td>
			<td>30x silicone oil objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modified rabies virus</td>
			<td>Salk Institute for Biological Studies</td>
			<td>G-deleted Rabies-eGFP</td>
			<td>Material Transfer Agreement required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural differentiation media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Per 100 mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240112</td>
			<td>1mL (100X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>200mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PHC7074</td>
			<td>40 ng/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco B27 Plus Supplement (50X)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td>2mL (50X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco CultureOne Supplement (100X)&#160;</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>A3320201</td>
			<td>1mL (100X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Neurobasal Plus Medium</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>A3582901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taylor Wharton Liquid N2 dewar</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>20HCB11M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XC pre-coat&#160;</td>
			<td>Xona Microfluidics, LLC</td>
			<td>XC Pre-Coat</td>
			<td>included with XonaChips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChip</td>
			<td>Xona Microfluidics, LLC</td>
			<td>XC450</td>
			<td>450 &#181;m length microgroove barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifier Tray</td>
			<td>Xona Microfluidics, LLC</td>
			<td>humidifier tray</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

compartmentalization of human stem cell-derived neurons within pre-assembled plastic microfluidic chips

Использование микрофлюидных устройств для разобщенности культивированных нейронов стало стандартным методом в неврологии. Этот протокол показывает, как использовать предварительно собранный многокомпонентный чип, изготовленный в циклическом олефин-кополимере (COC), для разобщенность нейронов, отличающихся от стволовых клеток человека. След этих чипов COC такой же, как и стандартный слайд микроскопа и в равной степени совместим с микроскопией высокого разрешения. Нейроны дифференцированы от человеческих нервных стволовых клеток (NSCs) в глутаматергических нейронов в чипе и поддерживается в течение 5 недель, что позволяет достаточно времени для этих нейронов для разработки синапсов и дендритных шипов. Кроме того, мы демонстрируем несколько распространенных экспериментальных процедур с использованием этих многокомпонентных микросхем, включая вирусную маркировку, создание микросреды, акотомию и иммуноцитохимию.

После одной недели (7-10 дней) в чипе с дифференциацией носителей, NSCs дифференцировать в нейроны и нейронных проекций ввести аксонального отсека (Рисунок 3). Внутри чипа нейроны прикрепляются и распределяются равномерно внутри соматического отсека. Для сравнения, нейроны в устройствах PDMS слипаются/агрегируются уже через 5 дней после добавления дифференциации носителей, что приводит к скомпрометированному здоровью клеток, как это видно на рисунке 3B (день 13 увеличенное изображение). Нейроны в чипах выглядят здоровыми с комплектом аксонов. Здоровые нейроны могут поддерживаться в пределах чипов в течение 4-5 недель.
Для визуализации созревания нейронов и развития дендритного позвоночника, модифицированный вирус бешенства был доставлен в аксональный отсек в 29 день для ретроградной этикетки нейронов, в том числе дендритных шипов, с флуоресцентным белком mCherry. Через четыре дня после заражения вирусом заражения, нейроны, расширяющие аксоны в аксональный отсек, выражали mCherry. Нейроны на дифференциации день 33 показали образование дендритных шипов(рисунок 4). Визуализация дендритных шипов показывает, что НСК производных нейронов дифференцированных в чипах форме зрелых синапсов.
Мульти-купе чип также совместим с иммуноцитохимии для визуализации клеточной локализации белка. После 26 дней поддержания нейронов в дифференциации средств массовой информации, нейроны были помечены для возбуждающий синаптический маркер, vGlut1 (Рисунок 5). Эти результаты показывают, что вирусно помеченные нейроны совместно локализуются с vGlut1(Рисунок 5E) и нейроном специфический маркер, К-тубулин III (Рисунок 5F-H).
Способность создавать различные микросреды, изолированные аксонов, также была продемонстрирована с помощью гидратзида Alexa Fluor 488, флуоресцентного красителя с низким молекулярным весом(рисунок 6).
Аксон травмы исследования обычно выполняются в разрозненных устройств. Доказательство принципа эксперимент был выполнен, чтобы выборочно травмировать аксоны дифференцированных нейронов с предварительно собранным чипом COC(рисунок 7). Результаты были эквивалентны силиконовымразрозненных устройствах 6,13,14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig1.jpg"> Рисунок 1: предварительно собранный COC, многокомпонентный микрофлюидный чип. (A) Рисунок чипа, определяющего верхнюю и нижнюю скважины. Размер чипа 75 мм х 25 мм, размер стандартных слайдов микроскопа. (B) Увеличенный в регионе, показывающий каналы и микрогровы, разделяющие каналы. Дополнительная информация приведена в Nagendran et al.12. (C) Эта фотография иллюстрирует создание изолированных микросред ы в каждом отсеке с помощью пищевой краситель красителя. Вся эта цифра была воспроизведена из 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig2.jpg"> Рисунок 2: Пластиковое разрозненные чиповые покрытия и сроки покрытия ячейки НСК. (A) Пластиковые многокомпонентные чипы были покрыты предпокрытием раствором, а затем поли-L-орнитин омичи и ламинин перед предварительным кондиционированием с NSC media. (B) NSCs были покрыты 7 х 104 ячейки в соматический отсек чипа. Клетки были выращены в nSC сми в течение 24 ч, а затем средства массовой информации был заменен на нервной дифференциации средств массовой информации. Дифференцированные нейроны наблюдались 7-10 дней после дифференциации. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig3.jpg"> Рисунок 3: сравнение роста hSC-нейронов в чипах и устройствах PDMS. (A) Фазовое контрастное изображение hSC-нейронов, выращенных в 13 дней после дифференциации в пластиковом мультикомпонентном чипе. (B) Увеличенный в области hSC-нейронов, культивируется в белом поле в (A) и эквивалентной области в устройстве PDMS (справа). hSC-нейроны внутри чипов хорошо прикрепляются. Агрегированные нейронные кластеры образуются в устройствах на основе PDMS. Представитель 2 независимых экспериментов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig4.jpg"> Рисунок 4: Человеческий НСК производные нейроны показывают дендритной морфологии позвоночника. Ретроградный помеченный нейрон mCherry при дифференциации 33- вырос в чипе. Увеличенный регион, изложенный красным цветом, подчеркивает наличие дендритных шипов, которые дают доказательства, подтверждающие развитие зрелых глутаматергических синапсов. Красные стрелки указывают на дендритные шипы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig5.jpg"> Рисунок 5: Человек NSC производных нейронов, культивируемых в чипах экспонат возбуждают синапсы. Иммуностоинг был проведен в день дифференциации 26. Нейронная визуализация была выполнена в соматическом отсеке. A) vGlut1 (зеленый) и (B)DAPI (синий) иммуномаркировки. (C) mCherry-помеченные нейроны (красные) ретроградные помечены с использованием модифицированного вируса бешенства. (D) Слитый флуоресцентный микрограф(A-C). (E) Дендритические шипы и vGlut1 положительные puncta colocalized с mCherry-положительные дендриты, показанные в увеличенном в зоне от (D). Иммунофлуоресцентные микрографы (F) нейронный специфический маркер, К-тубулин III (магента) и (G) vGlut1 (зеленый). (H) Наложение з-тубулин III, и vGlut1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig6.jpg"> Рисунок 6: Вирусно транскорпорированные нейроны mCherry расширяют проекции в локализованную микросреду аксона, созданную в предварительно собранном чипе COC. (A) mCherry помечены нейронов продлить аксоны через microgrooves чипа и в изолированном отсеке аксона. Изоляция отсека аксона визуализирована с помощью гидразида Alexa Fluor 488. Изображение нейронов произошло в день дифференциации 26 и 3 дня после заражения модифицированным вирусом бешенства. (B) Флуоресценция изображение в (A) сливается с изображением DIC. Обратите внимание на расположение микрогров. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59250/59250fig7.jpg"> Рисунок 7: Аксотомия, выполненная в рамках многокомпонентного чипа COC. (A) mCherry помечены нейроны на дифференциации день 33 были изображены до акотомии. Таблица цветного поиска 'Fire'. (B) Сразу после акотомии, показывая, что аксоны полностью разорваны. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59250/59250fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Пластиковые многокомпонентные чипы</td>
			<td>Многокомпонентные устройства PDMS</td>
		</tr>
<tr>
<td>изолировать аксоны</td>
			<td>изолировать аксоны</td>
		</tr>
<tr>
<td>создание микросреды</td>
			<td>создание микросреды</td>
		</tr>
<tr>
<td>акотомизируют нейроны</td>
			<td>акотомизируют нейроны</td>
		</tr>
<tr>
<td>оптически прозрачный</td>
			<td>оптически прозрачный</td>
		</tr>
<tr>
<td>совместима с изображением с высоким разрешением</td>
			<td>совместима с изображением с высоким разрешением</td>
		</tr>
<tr>
<td>совместима с флуоресценционной микроскопией</td>
			<td>совместима с флуоресценционной микроскопией</td>
		</tr>
<tr>
<td>полностью собраны</td>
			<td>сборка для субстрата требуется</td>
		</tr>
<tr>
<td>здоровые аксоны</td>
			<td>здоровые аксоны</td>
		</tr>
<tr>
<td>гидрофильной культивирования поверхности</td>
			<td>Гидрофобные</td>
		</tr>
<tr>
<td>газ непроницаемый</td>
			<td>газ проницаемый</td>
		</tr>
<tr>
<td>округлые микрогры и каналы</td>
			<td>прямые микрогры</td>
		</tr>
<tr>
<td>не совместим с лазерной абляцией</td>
			<td>Может быть использован для лазерной абляции, когда PDMS камеры собираются на специальных лазерной абляции совместимых слайдов.</td>
		</tr>
<tr>
<td>устройство не может быть изменено для удаления верхней</td>
			<td>сверху является съемным для окрашивания в microgrooves</td>
		</tr>
<tr>
<td>не совместим с маслами погружения на основе минерального масла (масла на основе силиконовой основе в порядке)</td>
			<td>совместим с маслами погружения на основе минерального масла</td>
		</tr>
<tr>
<td>непроницаемый для малых молекул и органических растворителей</td>
			<td>поглощение малых молекул и органических растворителей</td>
		</tr>
<tr>
<td>Отсутствие проблем утечки с обломочкой</td>
			<td>покрытие поли-L-орнитин омича и ламинин делают устройства негерметичная</td>
		</tr>
<tr>
<td>дифференцированные нейроны остаются равномерно распределенными (Nogt; 4 недели) при испытанной плотности клеток</td>
			<td>дифференцированные нейроны начинают агрегировать после 3-4 дней в культуре при испытанной плотности клеток</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Сравнение многокомпонентных чипов COC и силиконовых устройств для культивирования нейронов

Watch this Scientific Journal Video about Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips at JoVE.com

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Сравнение стволовых клеток человека, полученных нейронов в предварительно собранных пластиковых микрофлюидных чипов

Этот протокол демонстрирует использование разрозненных микрофлюидных чипов, инъекций, отлитых в циклическом олефин-кополимере, в культивированные нейроны, отличающиеся от стволовых клеток человека. Эти микросхемы предварительно собраны и проще в использовании, чем традиционные разрозненные поли (диметилсилоксановы) устройства. Здесь описаны несколько общих экспериментальных парадигм, включая вирусную маркировку, текучную изоляцию, акотомию и иммуностогирование.

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Разрозненные микрофлюидные устройства позволяют изучать нейроны в их сильно поляризованной форме. Эти устройства играют важную роль как для фундаментальных, так и для трансляционных исследований в области неврологии. Этот протокол описывает, как использовать циклические чипы олефин кополитера для разобщения нейронов, дифференцированных от стволовых клеток человека.Эти микросхемы COC производят более здоровую культуру дифференцированных нейронов по многокоммерьевым устройствам PDMS. В этом протоколе мы демонстрируем культуру нейронов, дифференцированных от одобренной NIH линии стволовых клеток H9. Аналогичные процедуры могут быть использованы для дифференцировать нейроны от mIPSCs.Многокоммекторные чипы должны быть помещены во вторичное сдерживание с дополнительной увлажнением. Каналы многокомипных чипов должны быть заполнены прекоутным раствором, а затем промыты PBS. Для начала растворите поли-L-орнитин в клеточной культуре сорта дистиллированной воды, чтобы сделать 600 микролитров раствора на чип.Аспирировать оставшиеся PBS из скважин, убедившись, что наконечник пипетки находится вдали от открытия канала. Загрузите 150 микролитров поли-L-орнитинового рабочего раствора в правом верхнем правом направлении. Подождите 90 секунд и добавьте 150 микролитров раствора в нижнюю правую колодец.Подождите пять минут и повторите процесс загрузки с раствором для левых скважин. Затем поместите лоток увлажнителя с чипом при четырех градусах по Цельсию на ночь. При использовании чашки Петри, оберните его с Parafilm и поместите его на четыре градуса по Цельсию на ночь.Далее, аспирировать раствор из скважин, гарантируя, что кончик пипетки помещается от открытия канала. И повторная загрузка правой и левой скважин по 150 микролитров каждая из стерильной воды в два раза. Приготовьте рабочий раствор ламинина.Загрузите правую и левую скважины 150 микролитров каждый из ламинина рабочего раствора. Инкубировать чип в лоток в течение двух часов при 37 градусов по Цельсию. Промыть чип с PBS без кальция и магния.Загрузите правую и левую скважины 150 микролитров каждый из PBS. Подожди пять минут. Аспирировать PBS из скважин и промыть чип с НСК СМИ.Загрузите правую и левую скважины 150 микролитров каждая из медиа-НСПК. Инкубировать чип в лоток на ночь в 37 градусов по Цельсию инкубатор с 5%CO2 для предварительного состояния чипа. Чтобы засеять нервные стволовые клетки человека в многокомбинный чип, сначала подсчитайте концентрацию клеток с помощью гемоцитометра.Затем, аспирировать средства массовой информации из скважин. Pipette пять микролитров клеточного раствора в правом верхнем правом хорошо, а затем пять микролитров в правом нижнем хорошо. Используйте микроскоп, чтобы проверить, что клетки вошли в канал.Подождите пять минут, пока клетки будут придерживаться нижней части чипа. Пипетт около 150 микролитров НСК СМИ вправо и влево скважин. Инкубационный при 5%CO2, 37 градусов по Цельсию в подходящем увлажненные контейнеры.После 48 часов, аспирировать НСК сми из скважин и заменить его нервной дифференциации средств массовой информации, добавив 150 микролитров для каждой верхней хорошо, и каждый нижний хорошо. Культурные нейроны в пределах 5%CO2, 37 градусов по Цельсию инкубатор в лоток увлажнителя. Удалите оставшиеся нейронные средства дифференциации из аксонального отсека и поместите его в центрифугу.Хранить при 37 градусах по Цельсию. Смешайте 50 микролитров раствора вируса со 150 микролитров разогретого мультимедиа. Пипетт 100 микролитров смеси к обеим скважинам аксонового отсека.Инкубировать в течение двух часов в пределах 37 градусов по Цельсию инкубатора. Изымать и избавляться от вирусосодержащих средств массовой информации. Аккуратно пипетки 75 микролитров свежих средств массовой информации в один аксон отсек хорошо, и пусть средства массовой информации течь через канал в другой аксон хорошо.Повторите этот процесс один раз. Наконец, заполните аксон отсек с сохраненных средств массовой информации, и передать чип в инкубатор. После одной недели в чипе с дифференциацией средств массовой информации, человеческие нервные стволовые клетки дифференцированы в нейроны, прилагается и равномерно распределены в соматический отсек.Для сравнения, нейроны в устройствах PDMS агрегированы уже через пять дней после добавления дифференциации средств массовой информации, что приводит к угрозе здоровья клеток. Визуализация помеченных нейронов и дендритных шипов с флуоресцентным белком mCherry показала, что нейроны, полученные из НСК, дифференцированные в пределах чипов, образуют зрелые синапсы. Нейроны были помечены для возбуждающей синаптический маркер, vGlut1.Иммуностимуляторные результаты показывают, что вирусно помеченные нейроны могут со-локализоваться с vGlut1, и нейрон-специфический маркер, Бета-тубулин три. Вирусно трансдицированные нейроны mCherry расширяют проекции в локализованную аксоном микроокниронию, установленную в заранее собранном чипе. Сравнение изображений mCherry помечены нейронов до и сразу после аксотомии показали полностью разорваны аксоны.Очень важно, чтобы убедиться, что каналы остаются заполнены жидкостью, за исключением при выполнении процедуры аксотомии. COC-разобщенные чипы просты в использовании и могут открыть дверь для многочисленных исследований, связанных с повреждением нейронов, синаптогенезом, синаптической пластичностью и патофизиологией болезни.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Спецификация конечного мозга глутаматергической нейронов из стволовых клеток человека плюрипотентных

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Функциональная оценка биологического нейротоксинов в сетевых культур стволовых клеток, полученных Центральная нервная система Нейроны

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Моделирования Зика вирус развивающегося мозга человека в пробирке с помощью стволовых клеток получены мозгового Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Простая генерация высокой урожайности культуры искусственных нейронов из фибробластов кожи взрослого человека

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Метод для высокой скорости стретч травмы человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток нейронов в формате 96-луночных

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons

Использование предварительно собранные пластиковые Microfluidic чипов для допускаться первичной мышиных нейронов

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Постдифференцирование Replating человека Плюрипотентные стволовые клетки полученных нейронов для высокого содержания скрининга неуритогенеза и синапсового созревания

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Миграция, химиотерапия, и совместно-культурные анализы для стволовых клеток человека, полученных эндотелиальных клеток и ГАМК нейронов

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Анализ митохондриального транспорта и морфологии в антропогенных плюрипотентных стволовых клеток, полученных нейронов в наследственной спастической параплегии

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Субретинальная трансплантация ткани сетчатки, полученной из эмбриональных стволовых клеток человека, на модели крупного крупного животного кошки

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...