Name: visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis
Uploaded: 2019-03-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par les instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), Sciences naturelles et Conseil de recherches en génie (CRSNG), Alberta Innovates Technology Futures et les femmes et Health Research Institute (WCHRI enfants).

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’Université de l’Alberta animalier et Comité d’urbanisme.
1. le protocole 1 : Visualisation de SOS à l’aide de stéréomicroscopie et imagerie (DIC) de contraste interférentiel différentiel
<ol><li>Collecte des embryons<ol>
<li>Dans un réservoir d’eau déchlorée, préparer des croisements de gdf6a+/- zebrafish le soir en couplant un poisson-zèbre mâle avec une femelle poisson-zèbre. N’oub...

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development.">In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li><li>Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+choreography+of+cell+movements+shapes+the+vertebrate+eye.">A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye.</a> Development. 139, 359-372 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Craniofacial+Development+in+the+sox10:+kaede+Transgenic+Zebrafish+Line+Using+Time-lapse+Confocal+Microscopy.">Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).</li><li>Percival, S. M., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+Mitotic+Division+and+Dynamics+in+a+Live+Zebrafish+Embryo.">Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo.</a> J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).</li></ol>

Nous présentons ici une série standardisée des protocoles d’observer les SOS dans l’embryon de poisson zèbre en développement. Pour déterminer les phénotypes de retard fermeture, nos protocoles ont mis l’accent sur la capacité de distinguer la séparation de deux lobes distincts des côtés dorsal-nasal et dorsale-temporal de le œil, semblable aux techniques permettant de visualiser le retard de fermeture de fissure choroïde phénotypes dans l’oeil ventral.
Ces techniques de ...

La formation de le œil de vertébrés est un processus hautement conservé dans lequel les voies de signalisation intercellulaires soigneusement orchestrées établissent les types de tissus et spécifient l’identité régionale1. Perturbations au début morphogenèse oeil entraîner des défauts profonds à l’architecture de le œil et sont fréquemment aveuglantes2. Une telle maladie résulte de l’omission de fermer la fissure choroïde oculaire dans la partie ventrale de la cupule optique3. Cette affection, appelée colobome oculaire, est estimée à se produire dans 1 sur 4-5000 naissances vivantes et cause 3 à 11 % de la cécité pédiatrique, communément se manifestant par une structure de type trou de serrure qui fait saillie inférieurement de l’élève au centre de l’oeil4, 5,6. La fonction de la fissure choroïde est de fournir un point d’entrée pour début vascularisation de plus en plus dans la cupule optique, après quoi les côtés de la fissure vont se fusionnent pour enfermer les vaisseaux7.
Alors que le colobome oculaire est connu depuis les temps anciens, nous avons récemment identifié un nouveau sous-ensemble de colobome patients avec perte de tissu qui affectent l’aspect supérieur/dorsale de le œil. Des travaux récents dans notre laboratoire a conduit à la découverte d’une structure oculaire dans le œil de poisson-zèbre dorsale, que nous appelons le sillon oculaire supérieur (SOS) ou fissure supérieure8. Il est important de noter que la structure présente des caractéristiques d’un sillon tant une fissure. Semblable à un sillon, c’est une couche de tissu continu qui s’étend de la nasale de la rétine temporale. En outre, la fermeture de la structure n’est pas véhiculée par une fusion des deux s’opposant à membrane basale, et il semble avoir besoin d’un processus morphogénétique par lequel la structure est remplie de cellules. Cependant, comme dans une fissure, il forme une structure qui sépare les parties nasales et temporelles de le œil dorsale avec la membrane basale. Par souci de cohérence, nous appellerons à elle comme SOS dans ce texte.
Le SOS est évolutivement conservée à travers des vertébrés, étant visible durant la morphogenèse oeil de poisson, poussin, Triton et souris8. Contrairement à la fissure choroïde, qui est présente de 20 à 60 heures après la fécondation (hpf) chez le poisson zèbre, le SOS est très transitoire, étant facilement visible de 20-23 hpf et absent par 26 hpf8. Des études récentes dans notre laboratoire ont révélé que, semblable à la fissure choroïde, le SOS joue un rôle dans une conduite vasculaire au cours de le œil la morphogenèse8. Bien que les facteurs qui contrôlent la formation et la fermeture du re ne sont pas encore totalement comprises, nos données mettent en évidence les rôles pour oeil dorsal-ventral patterning gènes8.
Poisson zèbre est un organisme d’excellent modèle pour étudier la SOS. Comme système modèle, il fournit un certain nombre d’avantages dans l’étude de développement de le œil : C’est un modèle de vertébrés ; chaque génération présente forte fécondité (~ 200 embryons) ; son génome a été entièrement séquencé, ce qui facilite la manipulation génétique ; et environ 70 % des gènes humains ont au moins un orthologue de poisson-zèbre, ce qui en fait un modèle idéal de base génétique des maladies humaines9,10. Plus important encore, son développement se déroule à l’extérieur à la mère, et ses larves sont transparentes, ce qui permet la visualisation de le œil en développement avec la facilité relative de11.
Dans cet ensemble de protocoles, les auteurs décrivent les techniques à travers lequel le SOS peuvent être visualisées dans des larves de poisson zèbre. La variété des techniques de visualisation utilisé dans le présent rapport permettra l’observation claire du re au cours du développement de l’oeil normal, ainsi que la capacité de détecter les défauts de fermeture de SOS. Nos protocoles d’exemple mettra en vedette des enquêtes de Gdf6, un BMP localisée à la partie dorsale oeil et régulateur connu de fermeture de SOS. En outre, ces techniques peuvent être associés à des manipulations expérimentales afin d’identifier les facteurs génétiques ou des agents pharmacologiques qui affectent la fermeture et la bonne formation de SOS. En outre, nous avons inclus un protocole par lequel l’imagerie fluorescente de toutes les membranes cellulaires est possible, permettant à l’expérimentateur d’observer les changements morphologiques pour les cellules qui entourent les SOS. Notre objectif est d’établir un ensemble de protocoles normalisés qui permet d’offrir de nouvelles perspectives sur cette nouvelle structure de l’oeil en développement dans l’ensemble de la communauté scientifique.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>AGA001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC/Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>MicroPublisher 5.0 RTV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image capture software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1752-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-laminin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low-melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15525017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis

Colobome oculaire congénital est une maladie génétique qui est généralement observée comme une fissure dans l’aspect inférieur de le œil résultant de la fermeture incomplète fissure choroïde. Récemment, l’identification des individus avec colobome dans l’aspect supérieur de l’iris, rétine et lentille a conduit à la découverte d’une nouvelle structure, dénommée la fissure supérieure ou sillon oculaire supérieur (SOS), qui est transitoirement présent sur la partie dorsale aspect de la cupule optique au cours du développement de le œil de vertébrés. Bien que cette structure est conservée à travers la souris, poulet, poisson et newt, notre compréhension actuelle du re est limitée. Afin d’élucider les facteurs qui contribuent à sa formation et de la fermeture, il est impératif de pouvoir observer et identifier les anomalies, tels que le retard dans la fermeture du re. Ici, nous avons décidé de créer une série normalisée de protocoles qui permet de visualiser efficacement le SOS en combinant des techniques de microscopie largement disponibles avec des techniques de biologie moléculaire commun tels que la coloration par immunofluorescence et ARNm surexpression. Bien que cet ensemble de protocoles porte sur la possibilité d’observer le retard de fermeture de SOS, il s’adapte aux besoins de l’expérimentateur et peut être facilement modifié. Dans l’ensemble, nous espérons créer une méthode accessible à travers lequel notre compréhension du re peut être avancée afin d’élargir les connaissances actuelles du développement de le œil de vertébrés.

Le poisson-zèbre SOS apparaît à 20 hpf dans la rétine dorsale présomptive8. Par 23 hpf le SOS transitions de son architecture initiale étroit à une large échancrure et 26 hpf, il n’est donc plus visible8. Par conséquent, afin d’examiner le SOS au cours du développement d’oeil de poisson zèbre normal, les embryons doivent être observées entre hpf 20-23. Durant cette période, le SOS est observable par le microscope à disse...

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Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Visualisation du sillon oculaire supérieure durant l’embryogenèse Danio rerio

Nous présentons ici une série standardisée des protocoles d’observer le sillon oculaire supérieur, une structure récemment identifiés, évolutivement conservée dans le œil de vertébrés. À l’aide de larves de poisson zèbre, nous démontrons techniques nécessaires pour identifier les facteurs qui contribuent à la formation et la fermeture du sillon oculaire supérieur.

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Cet ensemble de protocoles normalise peut être utilisé pour offrir un nouvel aperçu du sulcus oculaire supérieur, ou SOS, une structure récemment découverte de l’œil en développement. Ces protocoles permettront à n’importe quel expérimentateur à travers le monde de visualiser clairement le SOS pendant le développement oculaire du poisson zèbre. Commencez par placer le facteur de différenciation de la croissance hétérozygote six Un poisson zèbre mâle et femelle sur les côtés séparés d’un séparateur dans un réservoir d’eau déchlorée la veille de leur appariement.Le lendemain matin, retirez le séparateur et laissez le poisson se reproduire pendant au plus 30 minutes. À la fin de la période de reproduction, recueillir les embryons dans des boîtes de Pétri contenant e3 moyen pour leur incubation dans un incubateur de 28,5 degrés. À 20 heures après la fécondation, remplacer le supernatant par e3 moyen complété 0,004%1-Phenyl-2-thiourea pour prévenir la production de pigments et d’examiner les embryons par microscopie légère pour confirmer qu’ils sont tous au stade de développement approprié.Placer les échantillons sous un microscope disséquant. Jetez tous les embryons immatures sur le plan du développement et utilisez des forceps fins pour séparer doucement les chorions. Visualisez le SOS, qui peut apparaître comme une indentation ou une ligne à la marge dorsale de l’œil.Ensuite, trier les embryons qui montrent le retard de fermeture SOS de ceux qui ne le font pas. Pour photographier ces embryons à l’aide d’un microscope disséquant, préparez une boîte de Pétri contenant 1 % d’agarose dans le milieu E3 et piquez légèrement le centre de l’agarose pour créer un trou peu profond dans lequel le jaune de l’embryon peut être placé. Ensuite, placez un embryon anesthésié latéralement sur l’agarose.Pour imager les embryons à l’aide d’un microscope composé ou confocal, transférez un embryon dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant un petit bolus de point de fusion non gélifié de 1 % bas surgi dans le milieu E3 et utilisez une ligne de pêche fine pour positionner rapidement l’embryon en position latérale. Lorsque l’agarose a refroidi, versez suffisamment de milieu E3 dans le plat pour couvrir l’agarose et utilisez une lentille objectif d’immersion d’eau 20x pour visualiser le SOS. Après l’imagerie, tirez doucement l’agarose de l’embryon et fixez le tissu en paraformaldéhyde de 4% ou permettez au poisson zèbre de poursuivre son développement.Pour visualiser le SOS par expression fluorescente de l’ARNm, utilisez un appareil de microinjection pour injecter 300 picogrammes d’ARNm GFP-CAX amélioré dans des embryons au stade d’une cellule. Ensuite, utilisez un stéréoscope fluorescent pour dépister les embryons avec une expression GFP améliorée lumineuse et obtenir des images des embryons par l’une des méthodes d’imagerie comme démontré. Pour la coloration immunofluorescente de laminine embryonnaire de poisson zèbre, déchorionatez les embryons comme démontré et fixez les embryons dans un tube de microcentrifugeuse dans le paraformaldéhyde fraîchement préparé pendant deux heures sur un shaker de température ambiante.À la fin de la fixation, laver les embryons quatre fois en PBS plus Tween, ou PBST, pendant cinq minutes par lavage suivi d’une perméabilisation de 10 microgrammes par millilitre ou de Proteinase K à température ambiante pendant cinq minutes. Lavez les embryons permeabilisés quatre fois dans PBST comme démontré et bloquez les embryons dans le sérum de chèvre de 5% et deux milligrammes par millilitre d’albumine bovine de sérum dans PBST pendant une à deux heures sur un shaker de température ambiante. À la fin de l’incubation de blocage, incuber les embryons dans l’anticorps anti-laminine primaire d’intérêt à quatre degrés Celsius pendant la nuit sur un shaker.Le lendemain matin, lavez les embryons cinq fois en PBST pendant 15 minutes par lavage et étiquetez les tissus avec un anticorps secondaire approprié pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur le shaker protégé de la lumière. Le lendemain matin, lavez les embryons quatre fois en PBST pendant 15 minutes par lavage et placez les embryons dans une petite boîte de Pétri contenant du PBST frais. À l’aide de forceps fins, perturber délicatement les jaunes et retirer les cellules jaunes par un léger grattage des sacs jaunes.Transférer les embryons deyolked dans du glycérol fraîchement préparé à 30% dans PBS, en s’assurant de placer les embryons sur le dessus de la solution et en transférant le moins possible de la solution précédente et d’attendre que les embryons coulent au fond du tube. Lorsque les embryons ont atteint le fond du récipient, transférez-les à 50% séquentiel et 70% glycérol dans les solutions PBS, comme vient de le démontrer. Une fois que les embryons ont coulé au fond du récipient de 70% glycérol, transférez les échantillons dans un petit plat en plastique pour les dissections et séchez les embryons postérieur aux cerveaux postérieurs.À l’aide d’outils de dissection fine, déplacez une tête vers une glissade en verre avec le moins de glycérol possible et insérez doucement une fine goupille de minutien dans le ventricule du cerveau antérieur de l’intérieur, en poussant vers le bas pour séparer les moitiés droite et gauche de la tête les unes des autres. Lorsque la tête a été complètement filetée vers le bas de la ligne médiane, monter de chaque côté de la tête midline vers le bas, côté oeil vers le haut. Le SOS est observable par le microscope disséquant à 20 à 23 heures après fertilisation et par l’imagerie différentielle de contraste d’interférence comme ligne mince dans l’oeil dorsal qui sépare les moitiés nasales et temporelles de la rétine se développante.En outre, une indentation subtile peut être visible dans la limite dorsale de l’œil. Après la coloration immunofluorescente de la laminine, la mince ligne peut être confirmée comme membrane du sous-sol. Lorsque la fermeture sos est retardée, sa présence prolongée peut être observée comme une fente prononcée dans le côté dorsale de l’œil sous un microscope disséquant.Lorsqu’elle est observée sous un microscope composé à l’aide d’une imagerie différentielle de contraste d’interférence, cette caractéristique est encore plus importante avec les côtés nasaux et temporels de l’œil séparés par le SOS, qui est clairement visible comme une ligne dans l’œil dorsale. Par 28 heures après la fertilisation chez le poisson zèbre de type sauvage, la coloration de laminine démontre clairement que le SOS est complètement fermé, ce qui en fait l’étape idéale pour surveiller les retards dans la fermeture des fissures. L’injection d’ARNm GFP-CAX amélioré permet la visualisation des membranes cellulaires de l’embryon vivant ou fixe pour suivre les changements dans la morphologie des cellules qui conduisent à la fermeture de SOS.Visualiser le SOS peut être difficile, car il est étroit et transitoire. Toutefois, il est impératif que vous mainteniez une méthode de notation cohérente lors de l’évaluation des retards de fermeture à des moments ultérieurs. Ces techniques peuvent être combinées avec des manipulations expérimentales pour identifier les facteurs génétiques ou les agents pharmacologiques qui affectent la formation et la fermeture appropriées de SOS.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

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Recherche

Biologie du développement

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Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Évaluation des dommages oxydatifs dans les cellules de surface oculaires de la souris primaire/cellules souches en réponse aux dommages causés par les ultraviolets-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imagerie et analyse de l’orientation tissulaire et de la dynamique de croissance dans l’épithélie de drosophile en développement pendant les stades pupal