Name: electrophoretic delivery of &#x3b3;-aminobutyric acid (gaba) into epileptic focus prevents seizures in mice
Uploaded: 2019-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophoretic Delivery of Î³-aminobutyric Acid GABA into Epileptic Focus Prevents Seizures in Mice at JoVE.com

C.M.P. riconosce il finanziamento di una sovvenzione Whitaker International Scholar amministrata dall'Istituto per l'educazione internazionale. A.K. è stato sponsorizzato dall'IEF Marie Curie (n. 625372). Il programma di ricerca e innovazione dell'Unione europea Horizon 2020 (accordo di sovvenzione n. 716867) riconosce i finanziamenti del Consiglio europeo della ricerca (CER). Inoltre, l'iniziativa di eccellenza dell'Università di Aix-Marseille-A * MIDEX, un programma francese "investissements d'Avenir". Gli autori riconoscono il dottor Ilke Uguz, Dr. Sahika inal, Dr. Vincenzo Curto, Dr. Mary Donahue, Dr. Marc Ferro, e Zsófia Maglóczky per la loro partecipazione a proficue discussioni.

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite secondo le linee guida etiche dell'Institut de Neurosciences des Systèmes e approvate dai comitati etici locali e dagli uffici veterinari.
Nota: Diciassette topi maschi adulti OF1 sono stati utilizzati per gli esperimenti. I topi sono stati intrappolati in un ciclo di luce/buio di 12 ore con cibo e acqua disponibili ad libitum.
1. anestesia
<ol><li>Iniettare intraperitonealmente una mis...

<ol>
	<li>Kwan, P., Palmini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+switching+antiepileptic+drug+products+and+healthcare+utilization:+A+systematic+review.">Association between switching antiepileptic drug products and healthcare utilization: A systematic review.</a> Epilepsy &amp; Behavior. 73, 166-172 (2017).</li><li>Belleudi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+drug+switchability+showed+heterogeneity+in+methodological+approaches:+a+scoping+review.">Studies on drug switchability showed heterogeneity in methodological approaches: a scoping review.</a> Journal of Clinical Epidemiology. 101, 5-16 (2018).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychiatric+and+behavioral+side+effects+of+antiepileptic+drugs+in+adults+with+epilepsy.">Psychiatric and behavioral side effects of antiepileptic drugs in adults with epilepsy.</a> Epilepsy &amp; Behavior. 76, 24-31 (2017).</li><li>Brodie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy,+Antiepileptic+Drugs,+and+Aggression:+An+Evidence-Based+Review.">Epilepsy, Antiepileptic Drugs, and Aggression: An Evidence-Based Review.</a> Pharmacological Reviews. 68 (3), 563-602 (2016).</li><li>Hamed, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auditory+and+vestibular+toxicities+induced+by+antiepileptic+drugs.">The auditory and vestibular toxicities induced by antiepileptic drugs.</a> Expert Opinion on Drug Safety. 16 (11), 1281-1294 (2017).</li><li>Hamed, S. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+drug+delivery+for+seizure+control.">Electrophoretic drug delivery for seizure control.</a> Science Advances. 4 (8), eaau1291 (2018).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. 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Sviluppando un nuovo protocollo sperimentale in un modello acuto di topo di epilessia, le SLEs potrebbero essere controllate con successo con l'aiuto di un μFIP impiantato nel focus epilettico. Grazie alla sua capacità di fornire GABA con precisione temporale e spaziale, le SLEs indotta da 4AP sono state controllate all'inizio delle convulsioni. Il trattamento dell'epilessia è teoricamente possibile se il controllo delle scariche di rete neurale viene raggiunto nel luogo dell'inizio della crisi. Il protocollo presenta...

L'epilessia è il quarto disturbo neurologico più comune: circa l'1% della popolazione soffre di epilessia, e circa un terzo delle persone colpite ha convulsioni ricorrenti. Nella maggior parte dei casi, le convulsioni possono essere controllate con farmaci. Tuttavia, il trattamento farmacologico deve essere impostato per ogni paziente individualmente, dove il dosaggio corretto può richiedere anni per trovare1,2. Inoltre, la maggior parte del farmaco ha gravi effetti collaterali che riducono la qualità della vita3,4,5,6,7. Infine, nel 30% dei casi i pazienti sono resistenti ai farmaci, e nel caso di un singolo locus generatore di convulsioni costante, solo la neurochirurgia resettiva può attenuare il verificarsi di convulsioni8. Pertanto, una grande iniziativa nella ricerca moderna sull'epilessia è quella di scoprire nuove strategie che possono prevenire le convulsioni ricorrenti nei pazienti a rischio, riducendo al contempo la necessità di terapie farmacologiche forti e interventi chirurgici reinvettivi invasivi.
Crisi epilettiche si verificano quando c'è uno squilibrio all'interno di circuiti eccitatori e inibitorie sia in tutto il cervello (epilessia generalizzata) o in una parte localizzata del cervello (epilessia focale), tale che i neuroni scaricano in modo anormale9 , 10 il , 11. farmaci antiepilettici possono agire in due modi diversi nella prevenzione delle convulsioni: o diminuire l'eccitazione o migliorare l'inibizione12. In particolare, possono modificare l'attività elettrica delle cellule neuronali influenzando i canali ionici nella membrana cellulare13 o agiscono sulla trasmissione chimica tra i neuroni influenzando il neurotrasmettitore inibitorio GABA o il eccitatorio glutammato nelle sinapsi14,15. Per alcuni farmaci, la modalità di azione è sconosciuta18. Inoltre, i trattamenti farmacologici hanno un effetto continuo sui pazienti e non possono adattarsi alle dinamiche di prevalenza delle convulsioni. Idealmente, i farmaci con meccanismi di azione specifici agirebbero sui processi epilettici sottostanti. Un trattamento ottimale non toccherà il cervello Interictally ma avrebbe agito immediatamente quando un sequestro inizia a svilupparsi. A differenza di ciò, in tutti i casi di epilessia, il farmaco ora significa un trattamento sistematico, che colpisce tutto il cervello e tutto il corpo del paziente9.
Le convulsioni epilettiche possono comparire molti anni dopo l'insulto iniziale, come il trauma cerebrale. Il periodo tra l'insulto iniziale e il verificarsi delle prime convulsioni spontanee è caratterizzato da notevoli riorganizzazioni molecolari e cellulari, tra cui la morte neuronale con la scomparsa di connessioni di rete neuronale e assonale germogliare/neosinaptogenesi con la comparsa di nuove connessioni19,20,21. Una volta che le convulsioni diventano ricorrenti, la loro frequenza e gravità tendono ad aumentare, coinvolgendo più regioni cerebrali. È importante distinguere i siti di insorgenza convulsiva (regioni epilettogene) dalle reti di propagazione, poiché le regole della Genesi e della propagazione delle convulsioni possono differire. La ricerca condotta sul tessuto umano e i modelli sperimentali di epilessia hanno fornito dati importanti riguardanti la riorganizzazione dei circuiti e la loro capacità di generare convulsioni20,21,22, 23. Tuttavia, è difficile determinare se queste riorganizzazioni siano risposte adattive o se siano causalmente correlate all'epilettitesi o alla genesi del sequestro e alla propagazione12.
Pertanto, localizzare la messa a fuoco epilettica e l'applicazione di farmaci antiepilettici localmente sono una delle principali sfide nella ricerca dell'epilessia contemporanea. Diversi esperimenti che utilizzano modelli animali di epilessia e alcuni studi clinici miravano a trovare l'insorgenza degli eventi convulsivi e a definire i meccanismi di base nel cervello24,25,26,27. A tal fine, abbiamo sviluppato un nuovo protocollo sperimentale che utilizza l'epilessia indotta da 4AP modello28,29,30,31 in una preparazione acuta del topo, che permette l'inserimento preciso di tre dispositivi nella zona data dell'ippocampo, dove l'attività di rete in vivo è manipolata in modo altamente localizzato. L'iniezione localizzata di 4AP da parte di una micropipetta di vetro aiuta a indurre gli SLEs epilettici in un punto localizzato nell'ippocampo, mentre con l'aiuto della nuova sonda μFIP a base polimerica il controllo dell'attività convulsiva si ottiene simultaneamente registrando il neuronale l'attività elettrica con i siti di registrazione del dispositivo. L'attività del campo locale hippocampal è monitorata anche con una sonda in silicio multicanale in modo specifico strato nella corteccia e nell'ippocampo simultaneamente.
Le sonde μFIP recentemente inventate funzionano utilizzando un campo elettrico applicato per spingere i farmaci caricati immagazzinati in un canale microfluidico attraverso una membrana di scambio ionico (IEM) e verso il tessuto circostante (Figura 1). L'IEM trasporta selettivamente solo un tipo di ione (catione o anione) e, quindi, lavora per limitare la diffusione passiva nello stato "spento" e il trasporto di specie cariche opacemente dal tessuto circostante nel dispositivo. Il campo elettrico viene creato su richiesta applicando una piccola tensione (< 1 V) tra l'elettrodo sorgente che è interno al canale microfluidico e un elettrodo target che è esterno al dispositivo (in questo caso, la vite a testa sul modello animale). Il tasso di erogazione del farmaco è proporzionale alla tensione applicata e alla corrente misurata tra gli elettrodi di origine e di destinazione. La precisa accordabilità della somministrazione di farmaci è uno dei principali vantaggi del μFIP. Un altro vantaggio critico, rispetto ai sistemi di erogazione di farmaci fluidici o basati sulla pressione, è che nel μFIP c'è solo un aumento di pressione trascurabile all'uscita di erogazione del farmaco poiché i farmaci vengono consegnati attraverso l'IEM senza la loro soluzione Carrier.
C'è una piccola quantità di perdite passive di GABA quando il μFIP è "spento", ma questo è stato trovato non per effetto SLEs. I μFIP sono fatti su misura seguendo i metodi di microfabbricazione convenzionali che abbiamo riferito in precedenza31.
Dal momento che un modo di prevenire le convulsioni ricorrenti è il blocco delle scariche di rete all'inizio o anche prima del primo evento convulsivo, il metodo presentato per la consegna del neurotrasmettitore inibitorio GABA nella messa a fuoco epilettica ha grande potenziale terapeutico per il controllo delle convulsioni in pazienti con epilessia focale. Dal momento che il GABA è un substrato endogeno, lascia proprietà neuronali intrinseche invariate in concentrazioni fisiologiche. L'applicazione locale di bassi livelli di GABA influenzerà solo le cellule naturalmente reattivo all'inibizione, e causerà solo effetti simili all'inibizione fisiologica, contrariamente alla stimolazione cerebrale profonda (DBS), che ha azioni non specifiche stimolando tutte le cellule della rete neuronale nel suo ambiente, causando una risposta mista che coinvolge sia l'eccitazione che l'inibizione. In conclusione, il metodo proposto fornisce un approccio più specifico al controllo delle convulsioni rispetto alla DBS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >4AP</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >275875</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amplifier</td>
			<td>Neuralynx, Montana, USA</td>
			<td >Digital Lynx 4SX</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amplifier</td>
			<td >Ampliplex</td>
			<td >KJE-1001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Atlas Stereotaxique&#160;</td>
			<td>Allen Atlas</td>
			<td>978-0470054086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Borosilica glass pipette</td>
			<td >Sutter</td>
			<td >BF120-69-15</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Matrix</td>
			<td >WPI&#160;</td>
			<td >RBMA-200C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bone trimmer</td>
			<td >FST</td>
			<td >16109-14</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Connector</td>
			<td>INSTECH</td>
			<td>SC20/15</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coton tige</td>
			<td>Monoprix</td>
			<td>EMD 6107OD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cover slip</td>
			<td >Menzel-Glass</td>
			<td >15747592</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DiI Stain&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher</td>
			<td >D282</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >11412-11</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Drill</td>
			<td>FOREDOM</td>
			<td>K1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td >F.S.T.</td>
			<td >11412-11</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GABA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GFAP Monoclonal Antibody</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>53-9892-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440167-100M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hamilton seringe&#160;</td>
			<td>Hamilton&#160;</td>
			<td>80330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Headscrew</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>TX00-2FH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating pad&#160;</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>341446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Injection Pump</td>
			<td>WPI&#160;</td>
			<td>UMP3-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Keithley</td>
			<td >Tektoronix</td>
			<td >216A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td>Renaudin</td>
			<td>5787419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnetic holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>612</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Motoric manipulator</td>
			<td>Scientifica, UK</td>
			<td >IVM</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Na2HPO4</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >255793</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaH2PO4</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >7558807</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NeuroTrace DiI&#160;</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>N22880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper towel</td>
			<td>KIMBERLY CLARK</td>
			<td>7552000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PB</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PEDOT:PSS</td>
			<td>CLEVIOS</td>
			<td>81076212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PFA</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rectal temperature probe</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>521591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ropivacaine&#160;</td>
			<td>KABI</td>
			<td>1260216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scalpel</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>AUST R195806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Seringue&#160;</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serrefine clamp</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>18050-28</td>
			<td>4 is recommended</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicon probe</td>
			<td>NeuroNexus, Michigan, USA</td>
			<td>A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereotoxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51733U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost Slide</td>
			<td >ThermoScientific</td>
			<td >J38000AMNZ</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubing</td>
			<td >INSTECH</td>
			<td >LS20</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vaseline&#160;</td>
			<td>Laboratoire Gilbert</td>
			<td>3518646126611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vectashield DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories, California, USA</td>
			<td>H-1200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibratome, Leica VT1200S</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine&#160;</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>4007221032311</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophoretic delivery of &#x3b3;-aminobutyric acid (gaba) into epileptic focus prevents seizures in mice

L'epilessia è un gruppo di disturbi neurologici che colpisce milioni di persone in tutto il mondo. Anche se il trattamento con farmaci è utile nel 70% dei casi, gravi effetti collaterali influenzano la qualità della vita dei pazienti. Inoltre, un'alta percentuale di pazienti epilettici è resistente ai farmaci; nel loro caso, neurochirurgia o neurostimolazione sono necessari. Pertanto, l'obiettivo principale della ricerca sull'epilessia è quello di scoprire nuove terapie che sono in grado di curare l'epilessia senza effetti collaterali o prevenire le convulsioni ricorrenti in pazienti resistenti ai farmaci. NeuroEngineering fornisce nuovi approcci utilizzando nuove strategie e tecnologie per trovare soluzioni migliori per curare i pazienti epilettici a rischio.
Come dimostrazione di un nuovo protocollo sperimentale in un modello acuto di epilessia del topo, viene utilizzato un sistema di somministrazione di farmaci elettroforetici diretto in situ. Vale a dire, una sonda neurale che incorpora una pompa a ioni microfluidica (μFIP) per la somministrazione di farmaci on-demand e la registrazione simultanea dell'attività neurale locale è impiantata e dimostrata in grado di controllare la crisi indotta da 4-aminopiridina (indotta da 4AP) l'attività dell'evento (SLE). La concentrazione di acido γ-aminobutirrico (GABA) è mantenuta nella gamma fisiologica dal controllo preciso della consegna di GABA per raggiungere un effetto antiepilettico nella messa a fuoco convulsiva, ma non causare esplosioni di rimbalzo indotta da iperinibizione. Il metodo consente sia il rilevamento di attività patologica e l'intervento per fermare le convulsioni, fornendo neurotrasmettitori inibitorio direttamente al focus epilettico con preciso controllo spaziotemporale.
Come risultato degli sviluppi al metodo sperimentale, SLEs possono essere indotti in un modo altamente localizzato che consente il controllo delle convulsioni dalla consegna di GABA precisamente sintonizzati all'inizio della crisi.

Utilizzando la procedura presentata qui con un modello di epilessia 4AP in topi anestetizzati, il controllo delle crisi epilettiche può essere raggiunto nel focus epilettico. La localizzazione precisa degli impianti (Figura 2) ha contribuito a registrare potenziali di campo hippocampal locale (lfps, Figura 4), per indurre piccole convulsioni ippocampali e per fornire GABA all'inizio della crisi. La localizzazione degli impianti ...

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Electrophoretic Delivery of &#947;-aminobutyric Acid GABA into Epileptic Focus Prevents Seizures in Mice

La sfida della ricerca sull'epilessia è sviluppare nuovi trattamenti per i pazienti in cui la terapia classica è inadeguata. Utilizzando un nuovo protocollo — con l'aiuto di un sistema di somministrazione di farmaci impiantabili — siamo in grado di controllare le convulsioni in topi anestetizzati dalla consegna elettroforetica di GABA nella messa a fuoco epilettica.

La somministrazione elettroforetica di acido γ-aminobutirrico (GABA) nella messa a fuoco epilettica previene le convulsioni nei topi

Epilepsy is a group of neurological disorders which affects millions of people worldwide. Although treatment with medication is helpful in 70% of the ...

Il nostro protocollo sfrutta la somministrazione locale del neurotrasmettitore inibitorio naturale GABA utilizzando un dispositivo molto nuovo, che potrebbe proporre una nuova soluzione nel trattamento delle convulsioni epilettiche. La pompa ionica microaerofila ci permette di avere un controllo molto preciso su quando e dove consegniamo farmaci. Il parto elettroforetico filettato con precisione potrebbe essere modificato per colpire altre malattie neurologiche.Un altro vantaggio di questa tecnica di somministrazione dei farmaci è che c'è un aumento di pressione molto trascurabile all'uscita per la somministrazione di farmaci perché non c'è fluido che viene effettivamente consegnato. Piuttosto, sono solo le molecole di farmaci stesse. Poiché la localizzazione ravvicinata delle sonde porrà il problema maggiore, è molto adivisibile testare i loro angoli di allineamento e il posizionamento con sonde fittizie nel telaio stereotassico.Inizia fissando la testa di un mouse anestetizzato in un telaio stereotassico e usando un ago calibro 30 per iniettare un analgesico locale per via sottocutanea nel sito di incisione pianificato. Dopo cinque minuti, usa un bisturi per fare un'incisione della linea mediana nel cranio. E utilizzare forcep fini per ritrarre delicatamente la pelle.Bloccare la pelle con morsetti di serofine bulldog. E pulire la superficie del cranio esposta della fascia. Utilizzando un trapano dentale con una punta di perforazione fine e rotonda di 0,4 millimetri, praticare un foro nel cranio sopra il cervelletto fino a quando la dura non è visibile.Posizionare la vite di terra nel foro e utilizzare un cacciavite di precisione per ruotare la vite fino a raggiungere la parte superiore del cervelletto. Utilizzando il telaio stereotassico, misurare le coordinate stereotassiche per la regione cerebrale desiderata e utilizzare il trapano impostato a una velocità elevata per assottigliare un'area di diametro di circa uno o due millimetri del cranio, intorno alla regione bersaglio, fino a quando non rimane una membrana ossea trasparente sottile e ben lucidata. Quindi, utilizzare un ago a punta uniata su misura per rimuovere la dura e aggiungere una goccia di soluzione salina nel foro risultante.Per l'inserimento di sonde di silicio multicanale, posizionare la sonda sul braccio stereotassico collegato a un supporto magnetico e posizionare il braccio accanto al telaio stereotassico. Impostare i bracci stereotassi in un leggero angolo anteriore-posteriore di 20 gradi per lasciare ampio spazio al posizionamento degli altri due impianti. E collegare la sonda allo stadio di testa e alla vite di terra.Utilizzare il braccio stereotassico preciso per micron per abbassare lentamente la sonda di silicio nell'ippocampo e avviare il software di registrazione per registrare i segnali neuronali elettrici mentre si sposta la sonda di silicio multicanale dalla parte superiore della corteccia fino a raggiungere la posizione dorsoventrale mirata. Quindi, registra contemporaneamente il segnale potenziale di campo locale dagli strati della corteccia e dell'ippocampo durante la penetrazione sullo schermo del computer e usa l'attività dell'increspatura nello strato piramidale della formazione ippocampale nel potenziale di campo locale registrato come marcatore della zona bersaglio. Per il riempimento della pompa ionico microfluidico, collegare i tubi all'ingresso della pompa e riempire la sonda con soluzione GABA molare 0,05.Rimuovere i tubi e chiudere l'ingresso con l'avvolgimento della pellicola di paraffina e assicurarsi che la pompa ionica microfluidico sia fissata saldamente al supporto. Prestare attenzione quando si monta il supporto sul braccio del micromanipolatore prima di collegare i cavi elettrici all'unità di misurazione della sorgente. Con il braccio stereotassico ad un angolo medio-laterale di 20 gradi, abbassare lentamente la pompa con movimenti assiali il più vicino possibile alla sonda senza lasciare piegare la pompa, fino a quando la pompa raggiunge la coordinata dorsoventrale negativa a 1200 micrometri dalla superficie corticale.In preparazione per l'induzione del sequestro, rimuovere il mozzo dell'ago metallico di una siringa da 10 microliter e fissare una micropipetta borosilicata sulla punta della siringa. Posizionare il mozzo sulla punta della micropipetta e posizionare la siringa con un angolo mediale laterale di 20 gradi. Utilizzare una pompa di microiniezione automatizzata per caricare da 500 a 1000 nanolitri di aminopiridina completa da 50 millimolare nel liquido cerebrospinale artificiale nella siringa e abbassare la micropipetta di vetro nella posizione coordinata dorsoventrale.Iniettare 250 nanolitri della soluzione nel cervello e avviare la registrazione nel software. Quindi, guarda lo schermo e attendi che venga visualizzato il primo picco interictale prima di applicare un volt tra la sorgente e il bersaglio per 100 secondi e un secondo di riposo per 30 cicli per fornire la soluzione GABA. La localizzazione precisa degli impianti aiuta a registrare i potenziali di campo locali ippocampali, inducendo le piccole convulsioni ippocampali e fornendo GABA all'inizio della crisi epilettica.Inoltre, la localizzazione degli impianti può essere verificata dopo ogni esperimento mediante istologia post hoc. Qui, viene mostrato un esempio di quando eventi simili a crisi epilettiche potrebbero essere interrotti con la consegna di GABA dalla nuova sonda neuronale, incorporando la sonda microfluidico. Quando quattro amminopiridine sono state iniettate in un'area più ampia o sulla parte superiore della corteccia, le convulsioni epilettiche sono diventate generalizzate, quindi il GABA consegnato non è stato in grado di modificare l'estensione delle convulsioni epilettiche.In particolare, la consegna di ioni di sodio non ha avuto un effetto significativo sull'attività indotta da aminopiridina. Quindi questo protocollo può essere utile per qualsiasi chirurgia stereotassica che comporta l'impianto di più sonde fragili. Con l'aiuto della pompa ionica microfluidale, altre specie in molecole cariche potrebbero essere introdotte per trattare non solo l'epilessia, ma altre malattie neurologiche.L'erogazione elettroforetica nell'interfacciamento tissutale presenta un nuovo approccio in generale per fornire specie in qualsiasi tessuto molle. Prestare particolare attenzione quando si applica il 4AP, poiché è una tossina e induce l'epilessia.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophoretic Delivery of &#x3B3;-aminobutyric Acid (GABA) into Epileptic Focus Prevents Seizures in Mice

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

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The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, ...

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