Name: a galleria mellonella oral administration model to study commensal-induced innate immune responses
Uploaded: 2019-03-21T15:00:00
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Este trabajo fue financiado por el DFG (SPP1656), el grupo de entrenamiento de investigación DFG 1708, el Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) y el centro alemán de investigación de la infección (DZIF).

1. cría de g. mellonella y preparación de las larvas de los experimentos
Nota: El ciclo de huevo al último estadio la larva tarda aproximadamente 5-6 semanas.
<ol><li>La transferencia de los huevos de la polilla adulta a las cajas de 2 L que contiene sustrato de polilla de la cera (grits de maíz 22%, 22% harina de trigo, cera de 17,5%, 11% leche desnatada en polvo, miel de 11%, 11% glicerol, levadura secadas de 5,5%). Realizar toda la cría a 30 ° C en la oscuridad.</li>
	<li>T...

<ol>
	<li>Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+the+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD:+lessons+from+mouse+infection+models.">The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).</li><li>Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+antimicrobial+peptides+during+homeostasis,+infection,+and+disease.">Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease.</a> Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).</li><li>Ivanov, I. I., Honda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+commensal+microbes+as+immune+modulators.">Intestinal commensal microbes as immune modulators.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).</li><li>Ayres, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasome-microbiota+interplay+in+host+physiologies.">Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies.</a> Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).</li><li>Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+G.+mellonella+Larvae+to+Provide+Reliable+and+Reproducible+Results+in+the+Study+of+Fungal+Pathogens.">Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens.</a> Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).</li><li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella.">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Insect Science. , (2016).</li><li>Buchmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Innate+Immunity:+Clues+from+Invertebrates+via+Fish+to+Mammals.">Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals.</a> Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).</li><li>Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella:+A+Novel+Invertebrate+Model+to+Distinguish+Intestinal+Symbionts+From+Pathobionts.">Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts.</a> Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).</li><li>Tsai, C. 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Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+virulence+of+Candida+albicans+mutants+in+mice+and+Galleria+mellonella+larvae.">Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae.</a> FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).</li><li>Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. 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L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gut+Microbiotassay:+a+high-throughput+qPCR+approach+combinable+with+next+generation+sequencing+to+study+gut+microbial+diversity.">The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity.</a> BMC Genomics. 14, 788 (2013).</li><li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OmpA+variants+affecting+the+adherence+of+ulcerative+colitis-derived+Bacteroides+vulgatus.">OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus.</a> Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).</li><li>Freitak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal+transfer+of+bacteria+can+mediate+trans-generational+immune+priming+in+insects.">The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects.</a> Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).</li><li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li></ol>

El modelo de g. mellonella es un modelo frecuentemente utilizado para evaluar los factores de la virulencia bacteriana en una infección sistémica enfoque21. Puesto que muchos agentes patógenos y bacterias entran al host vía oral infección o colonización, nuevos conocimientos hay que encontrar para evaluar g. mellonella como un modelo de colonización oral y la infección.
La posibilidad de posterior g. mellonella entre 15 y 37 ° C es un...

El microbioma intestinal es un componente esencial para el mantenimiento de la homeostasis e involucra tanto las respuestas inmunes innata y adaptativa1,2. La comunidad de la microbiota comensal se caracteriza por diferentes componentes comensales: simbiontes que confieren efectos beneficiosos por funciones inmunomoduladoras importantes y pathobionts que puede tener efectos perjudiciales genéticamente predispuestos acoge y promover y provocar inflamación intestinal3,4. Muchos estudios de simbiontes y pathobionts y su influencia en el sistema de inmune del anfitrión han sido publicados principalmente estudio de respuestas inmunes adaptativas.
Puesto que estos estudios implican muchos animales para las investigaciones y la protección y reemplazo de los animales utilizados para experimentación es de creciente interés público, tratamos de encontrar un modelo de reemplazo para permitir la proyección de diferentes bacterias inmunogénica propiedades. Insectos, especialmente Galleria mellonella, son un modelo de reemplazo utilizados en la investigación de la infección. G. mellonella combina diversas ventajas como bajos costos y alto rendimiento; permite la administración oral de bacterias, que es la vía natural, y permite la infección sistémica5,6. G. mellonella más permite la incubación a 37 ° C, que es la temperatura fisiológica del cuerpo de los mamíferos y el óptimo para la virulencia bacteriana factor expresión5. La principal ventaja de g. mellonella es el conservado sistema inmune innato que permite la discriminación del yo del no yo y codifica una gran variedad de receptores de reconocimiento de patrón como apolipophorin o las opsoninas hemolin6, 7. a partir del reconocimiento del microbio, g. mellonella puede desencadenar diferentes inmunorespuestas humorales aguas abajo. Pueden inducir respuestas de estrés oxidativo y secretan especies reactivas de oxígeno (ROS) que implica la actividad de la NOS (sintasa de oxidasa nítrica) y NOX (NADPH oxidasa)6,8. Además, g. mellonella activa una respuesta potente péptido antimicrobianos (AMP), que se traduce en la secreción de una mezcla de diferentes amperios como gloverin, moricin, cecropina o la Defensina-como gallerimycin6, 8,9,10. En general, amperios tienen especificidad del hospedador bastante amplio contra las bacterias Gram-positivas y gram-negativas y hongos y dar una respuesta potente ya que los insectos carecen de cualquier respuesta adaptativa10. Gloverin es un amplificador activo contra bacterias y hongos e inhibe la formación de membrana externa6,11. Moricins exhiben su función antimicrobiana contra bacterias Gram positivas y gram negativas por penetrar en la membrana y la formación de un poro9,11. Cecropinas proporcionan actividad contra bacterias y hongos y permeabilizar la membrana semejantemente como moricins9,10. Gallerimycin es un péptido de Defensina-como con propiedades anti-hongos9. Curiosamente, se encontró que la combinación de la cecropina y gallerimycin tuvieron una actividad sinérgica contra e. coli10.
Debido a su carácter de fácil uso g. mellonella larvas son un modelo de infección utilizadas para evaluar la patogenicidad bacteriana. En particular, los estudios en que los datos obtenidos de g. mellonella correlacionaron con datos obtenidos de ratones soporte la fuerza de este modelo de host alternativo. Se encontró que los serotipos más patógenos de Listeria monocytogenes en un modelo murino de infección también conducen a mayores tasas de mortalidad en g. mellonella después de la infección sistémica. Además, menos serotipos virulentos resultaron para ser también menos virulenta en el modelo de g. mellonella 12. Observaciones similares se han hecho con los hongos patógenos humanos Candida albicans. Virulencia de C. albicans de diferentes cepas ha sido evaluado por la infección sistémica y posterior seguimiento de supervivencia larval. Cepas avirulentas de ratón fueron avirulentas o exhiben reducida virulencia en g. mellonella, mientras que las cepas virulentas de ratón conducen también a alta mortalidad larvaria13. El modelo de g. mellonella adicional podría utilizarse para identificar los factores de patogenicidad de sistema tipo 3 secreción de Pseudomonas aeruginosa14.
Puesto que la mayoría de las investigaciones que involucran g. mellonella se centraron en factores de virulencia utilizando el enfoque sistémico infección estábamos especialmente interesados en proporcionar un método adecuado para el análisis de los comensales intestinales en una alimentación oral forzada modelo en el que podemos aplicar una dosis distinta de las bacterias por las larvas y no sólo observar la tasa de mortalidad larval pero analizar diferentes características de inmunorespuestas naturales para mantener la homeostasis intestinal.
Nuestro método ayuda a aumentar el uso de g. mellonella como un modelo de reemplazo ya que combinamos la aplicación de bacterias y el análisis de expresión de RNA. No sólo es útil reforzar el significado de los estudios de la patogénesis bacteriana cuando se incluye el análisis de las respuestas inmunes después de la administración oral y no sólo la observación de las tasas de mortalidad después de la infección sistémica. Nuestros métodos permite el análisis de las propiedades inmunogénicas de bacterias no patógenas comensales puesto que es proporciona condiciones más complejas que el cultivo celular, ofreciendo una barrera intestinal en un organismo vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:701px;" width="702">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120086</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 bp DNA ladder&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15628019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-Bromo-3-Chloropropane (BCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B9673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2x Mangomix</td>
			<td style="width:200px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-25033</td>
			<td>Colony PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:200px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">210 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:200px;">Biozym</td>
			<td style="width:119px;">840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beeswax</td>
			<td style="width:200px;">Mixed-Store.de</td>
			<td style="width:119px;">&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brain heart infusion broth</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CM1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1232</td>
			<td>Cloning vector for 16S fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corn grits</td>
			<td style="width:200px;">Osterm&#252;hle Naturkost GmbH</td>
			<td style="width:119px;">306</td>
			<td>Organic cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">244610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA-free DNA Removal Kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">244510</td>
			<td>&#160;Dnase digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dried yeast</td>
			<td style="width:200px;">Rapunzel</td>
			<td style="width:119px;">&#160;-</td>
			<td>Organic cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20821.330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W252506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Honey</td>
			<td style="width:200px;">Osterm&#252;hle Naturkost GmbH</td>
			<td style="width:119px;">487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20842.330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lightcycler 480 Instrument II</td>
			<td style="width:200px;">Roche Molecular Systems</td>
			<td style="width:119px;">5015278001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td style="width:200px;">Roche Molecular Systems</td>
			<td style="width:119px;">4729692001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual Microsyringe Pump with Digital Display</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">DMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">324826</td>
			<td>Oral administration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mortar, unglazed</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td>410-9327&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-400-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease-free water&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10977035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid AnaeroGen sachets&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AN0025A</td>
			<td>Quality and quantity of RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR stripes</td>
			<td style="width:200px;">Biozym</td>
			<td style="width:119px;">710970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pestle, unglazed grinding surface</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td>410-9324&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phusion proof-reading enzyme&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:200px;">Biomers</td>
			<td style="width:119px;">&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PureYield Plasmid Miniprep System</td>
			<td style="width:200px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiFast SYBR Green PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">204056</td>
			<td>qPCR for bacterial copy number measurment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Qiagen</td>
			<td>204156</td>
			<td>qRT-PCR for gene expression measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiTect Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">205311</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit Assay Tubes</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit dsHS DNA kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q32851</td>
			<td>Quantification of plasmid and cDNA samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit fluorometer</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td>Quantification of plasmid and cDNA samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RNase-ExitusPlus</td>
			<td style="width:200px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A7153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td style="width:200px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Skimmed milk powder</td>
			<td>Sucofin</td>
			<td style="width:119px;">&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR safe DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRI reagent&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Weighing boat</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;">10803-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wheat meal</td>
			<td style="width:200px;">Osterm&#252;hle Naturkost GmbH</td>
			<td style="width:119px;">6462</td>
			<td>Organic cultivation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a galleria mellonella oral administration model to study commensal-induced innate immune responses

La investigación del potencial inmunogénico de bacterias comensales en el sistema inmune de host es un componente esencial al estudiar las interacciones huésped-microbio intestinal. Está bien establecido que diversos comensales exhiben un potencial diferente para estimular el sistema inmune intestinal del host. Estas investigaciones involucran animales vertebrados, especialmente roedores. Puesto que cada vez más preocupaciones éticas están relacionadas con experimentos con vertebrados, hay una alta demanda para los modelos invertebrados reemplazos.
Aquí, ofrecemos un modelo de la administración oral de Galleria mellonella con bacterias no patógenas comensales y la posible evaluación del potencial inmunogénico de comensales en el sistema inmunológico de g. mellonella . Demostrar que g. mellonella es un modelo de reemplazo invertebrados alternativa útil que permite el análisis de comensales con diferente potencial inmunogénico como Bacteroides vulgatus y Escherichia coli. Curiosamente, las bacterias no exhiben ningún efecto de matar a las larvas, que es similar a los mamíferos. Las respuestas inmunes de g. mellonella eran comparables con vertebrados la respuesta inmune innata e implican el reconocimiento de las bacterias y la producción de moléculas antimicrobianas. Proponemos que g. mellonella fue capaz de restablecer el anterior equilibrio de la microbiota, que es bien conocido de individuos mamíferos sanos. Aunque proporcionando comparable respuesta inmune innata en g. mellonella y vertebrados, g. mellonella no albergan un sistema inmune adaptante. Puesto que los componentes investigados del sistema inmune innato son evolutivos conservado, el modelo permite un preselección y primer análisis de propiedades inmunogénicas bacterianas.

El modelo de infección de g. mellonella hemolinfa en ampliamente utilizado para analizar los factores de virulencia de una gran variedad de patógenos. La mayoría las medidas incluyen el análisis de la mortalidad de las larvas, que es un método muy fácil. Sin embargo, este método no permite conclusiones sobre las respuestas inmunes en general y vincular los resultados de las respuestas inmunitarias de g. mellonella con mecanismos inmunes vertebrados. El modelo de l...

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A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para un modelo de administración oral con larvas de Galleria mellonella y cómo caracterizar inducido la respuesta inmune innata. Mediante este protocolo, investigadores sin experiencia práctica será capaces de usar la g. mellonella forzada método.

Un modelo de administración Oral de Galleria mellonella para la respuesta inmune innata Study Commensal-Induced

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Nuestro protocolo amplía el uso de G.mellonella de un modelo de infección sistémica a un modelo que permite la administración bacteriana a través de la vía oral natural. G.mellonella es un modelo de reemplazo adecuado para roedores en el análisis de diferentes señas de identidad de interacciones de micro-post innatos, ya que las larvas se pueden utilizar para bacterias patógenas humanas. Comience por transferir los huevos puestos por polillas adultas a cajas de dos litros que contienen sustrato de polilla de cera, a 30 grados Celsius, en la oscuridad.Después de una a dos semanas, transfiera 25 gramos de larva que contenga sustrato a sustrato fresco, cuando la larva pequeña y diminuta se haga visible. Sincronizar las larvas después de dos semanas según su tamaño, en grupos de 30 a 40 larvas en nuevos recipientes de dos litros sobre sustrato de polilla de cera. Después de dos semanas, seleccione larvas para el experimento en peso.Usando sólo larvas pálidas y de movimiento rápido con una masa de 180 a 200 miligramos. Para forzar el alimentación de las larvas, cargue una jeringa de insulina con una aguja de punta contundente para aplicación oral, con una de 10 a la séptima bacteria por cada 10 microlitros de DPBS por larva. Cargue la jeringa en una bomba de microsyringe.Espere a que una larva abra las partes de la boca antes de insertar la jeringa cuidadosamente entre las mandíbulas y entregar las bacterias. Cuando todas las larvas hayan sido alimentadas, incubar los animales en la oscuridad a 37 grados centígrados, entre una y 24 horas. Para el procesamiento de larvas, limpie una capucha de seguridad con etanol y reactivo de pulverización para evitar la contaminación por RNase.Congela la larva viva en nitrógeno líquido. Homogeneizar cada larva congelada individual usando un mortero y pestillo y un pequeño volumen de nitrógeno líquido. Cuando se haya producido un homogeneato en polvo, transfiera el homogeneato a un bote de espera desechable y espere a que el nitrógeno líquido se evapore.Una vez homogeneizadas todas las larvas, mezcle los homogeneizados en polvo con un mililitro de TRIzol en un tubo de dos mililitros. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante una hora. Al final de la incubación, pele el homogeneización por centrifugación.Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Mezclar el sobrenadante con 200 microlitros de 1-Bromo-3-cloropropano, o BCP. Vórtice e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente, seguido de una incubación de 10 minutos sobre hielo.Al final de la segunda incubación, centrifuga la BCP agregó reacción y transfirió la capa transparente superior a un nuevo tubo de dos mililitros. Precipitar el ARN de la capa superior transferida con 500 microlitros de isopropanol mezclando e invirtiendo el tubo durante cinco minutos. A continuación, recoger el ARN precipitado por centrifugación.Lavar el pellet de ARN precipitado con 500 microlitros de 75% etanol y secar el ARN durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente. Cuando el etanol se haya evaporado, agregue 100 microlitros de inhibidor de la ribonucleasa en agua libre de nucleasas al pellet de ARN seco, y vórtice cuidadosamente el tubo hasta que el pellet se disuelva por completo. Mida la calidad y la cantidad del ARN por protocolos estándar, asegurando que la relación 260 a 280 sea aproximadamente dos, y la relación 260 a 230 esté en el rango de dos a 2.2.A continuación, utilice cinco microgramos del ARN aislado para la digestión de DNase y el análisis de expresión génica, de acuerdo con los protocolos estándar. G.mellonella es capaz de eliminar la carga bacteriana alimentada por la fuerza inicial hasta que no se detecten bacterias. Con el gen 16s, los números de copia genética de B.vulgatus y E.coli disminuyeron sustancialmente en 24 horas.Commensal administró una G.mellonella larvas induce la expresión génica de ARN de varios genes marcadores de inmunidad innata. Por ejemplo, las moléculas de reconocimiento de LPS, la apolipoforina y la hemolina se expresan generalmente más altamente en las larvas administradas por E.coli en comparación con las larvas administradas por B.vulgatus. Además, la producción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno están fuertemente reguladas sobre la alimentación por fuerza de E.coli en comparación con B.vulgatus, así como la expresión genética antioxidante del GST.Además, la expresión diferencial de péptido microbiano se induce con mayor fuerza después de la administración de E.coli que en respuesta a la alimentación por fuerza de B.vulgatus. Recuerde usar sólo larvas sanas, blancas y en movimiento rápido, para usar la paciencia durante la alimentación forzada para evitar el estrés de las larvas e incluir todos los controles necesarios. La activación de los marcadores inmunes de G.mellonella puede determinarse directamente mediante ensayos de actividad RUS o GST y la abundancia de ANP puede determinarse mediante ensayos de inhibición del crecimiento bacteriano.Esta técnica se puede utilizar como una herramienta de cribado para bacterias commensales y patógenas y para explorar simbiomas intestinales y patobiomas sin sacrificio de muchos vertebrados. Utilice siempre el equipo de protección personal adecuado cuando trabaje con nitrógeno líquido, BCP o sustancias TRIzol.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

El insecto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como un modelo de infección poderosa para investigar la patogénesis bacteriana

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Investigación

Inmunología e Infección

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

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Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

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El uso de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como organismo modelo para estudiar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infección

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Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

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Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

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Aislamiento de células mononucleares tonitarias para estudiar las respuestas inmunitarias innatas ex vivo en un tejido linfático mucoso humano

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