Ce protocole fournit une méthode fonctionnelle à long terme, in vitro, pour l’évaluation du récepteur chimérique d’antigène, ou cellules de T de CAR, par le défi répétitif de cellules de tumeur. Cette technique prend moins de temps, et moins laborieuse que l’évaluation in vivo de fonction de cellule T de CAR tout en réalisant toujours une représentation précise de l’efficacité vraie d’anti-tumeur. Cette technique in vitro permet le criblage et la différenciation à haut débit de la puissance anti-tumorale des cellules T de la RCA.
Qui a l’application potentielle pour évaluer l’efficacité clinique des produits de cellule T de CAR. Commencez par dissocier les tumeurs du glioblastome d’une culture tumorale du glioblastome. Avec un millilitre d’accutase froide, et 30 à 60 secondes de pipetage.
Quand les tumorspheres ont été perturbés, arrêtez la réaction avec cinq millilitres de milieu chaud de co-culture. Et pelleter les suspensions des cellules tumorales par centrifugation. Suspendre à nouveau les cellules du glioblastome à 1,6 fois 10 à la cinquième cellule tumorale par millilitre de concentration moyenne de coculture fraîche, et diluer les lymphocytes T récoltés à partir d’une culture des lymphocytes T car au pourcentage approprié de lymphocytes T positifs en RCA par millilitre de concentration moyenne de coculture.
Ensuite, ajoutez 100 microlitres des cellules tumorales diluées à chaque puits d’une plaque de culture de tissu de fond bien plate de 96 puits. Et 100 microlitres de cellules T CAR dans chaque puits de cellules tumorales avec mélange doux. Placez ensuite la plaque dans un incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius et de 5 %.
Les jours deux, quatre et six de la culture, soigneusement enlever 50 microlitres de milieu de chaque puits de la cellule tumorale, T cellule plaque de co-culture prévue pour rechallenge selon le tableau. Ensuite, ajouter 50 microlitres de suspension cellulaire glioblastome frais, préparé comme il vient de le démontrer, mais avec deux fois le nombre de cellules de la co-culture initiale à chaque puits avec un mélange doux. Et rendre la plaque à l’incubateur de culture cellulaire.
Les jours un, trois, cinq et sept de la co-culture, transfèrent le surnatant de chaque puits pour être récolté dans une nouvelle plaque inférieure ronde de 96 bien selon le tableau et ajoutent 50 microlitres de 0,5% préchauffé Trypsin EDTA dans chaque milieu bien épuisé. Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, confirmer que les cellules se sont détachées du fond de chaque puits par microscopie légère, et pipette doucement la solution enzymatique autour du fond de chaque puits pour résuspendre les cellules. Avant de transférer la suspension cellulaire détachée dans les puits correspondants appropriés de la nouvelle plaque de 96 puits.
Pelleter les cellules par centrifugation, et laver les cellules avec 200 microlitres de fluorescents activé solution debout de tri cellulaire, ou FFS par puits avec une deuxième centrifugation. Suspendre à nouveau les granulés dans 100 microlitres du cocktail d’anticorps d’intérêt pour 100 microlitres de SSS par puits pendant une incubation de 30 minutes à quatre degrés Celsius. A la fin de l’incubation enlever tout anticorps non lié par séquentiel 100 et 200 microlitres FSS lave et re-suspendre les cellules dans 100 à 200 microlitres de tache nucléaire DAPI et FSS.
Ensuite, analyser les cellules selon les protocoles standard d’analyse cytométrique de flux. Pour l’analyse fonctionnelle et phénotypique des cellules T de CAR après co-culture de cellules de tumeur, récupérez les fichiers de données du cytomètre d’écoulement, et portez toutes les cellules négatives réelles de DAPI. Pour quantifier les cellules tumorales, portez la population négative de CD45.
Pour quantifier la barrière de cellules T de la RCA, la population positive de CD45 en RCA. Puis tracer les nombres de tumeurs et de cellules T CAR au cours de l’expérience, en identifiant l’activation des lymphocytes T par la co-expression de 41BB, et CD69. Épuisement des lymphocytes T par l’expression de PD1, LAG3 et TIM3, et le statut de mémoire des lymphocytes T LAG3, et TIM3, et le statut de mémoire des cellules T par CD45RO, et cd62 ligand expression.
par CD45RO, et CD62 ligand expression. Les lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs en RCA sont également activés contre les cellules du glioblastome qui expriment l’antigène cible tel qu’indiqué par leur expression CD107a et cytokine intracellulaire. Cependant, comme évalué par le défi répétitif de tumeur SA, CD4 positif, mais pas CD8 positif, cellules de T de CAR sont capables de tuer rond multiple.
Les lymphocytes T CD4 positifs en RCA réalisent également une expansion plus robuste. Lorsque les lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs en RCA sont mélangés à un rapport d’un à un, cette combinaison cellulaire permet d’obtenir des lymphocytes T CD8 positifs, mais non positifs au CD4 en termes de cytotoxicité à long terme. En outre, l’expansion des lymphocytes T CD8 positifs car est induite par l’ajout de lymphocytes T CD4 positifs.
Tandis que l’expansion positive de cellule T de CAR cd4 est inhibée en présence des cellules positives de CDa. 24 heures après la co-culture initiale, les lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs car sont activés de la même manière. Pendant le défi répétitif de tumeur, les cellules positives de CD4 et de CD8 positives de CAR T démontrent une transition d’un phénotype positif de mémoire centrale positif de CD45RO, de CD62 ligan, à un phénotype positif de mémoire d’effecteur de CD45RO de CD62 ligan.
Les lymphocytes T CD8 positifs en RCA sont également plus sujets à l’épuisement que les lymphocytes T CD4 positifs en RCA évalués par leur expression PD1, LAG3 et TIM3 après trois jours de co-culture. De plus, aucune différence observée dans l’épuisement positif des lymphocytes T du CDa en présence ou en l’absence de lymphocytes T cd4 positifs, ce qui indique que l’expansion positive des lymphocytes T CD8 induits par CD4 n’est pas associée à une meilleure fonction effectrice. Cet essai peut également être couplé avec le tri des cellules T forment la co-culture pour effectuer une analyse plus approfondie sur les transcriptomes, la protéomique, et des gènes spécifiques d’intérêt.
Ce défi répétitif de tumeur pourrait également être employé comme plate-forme pour étudier les événements biologiques après reconnaissance de tumeur de cellule T de CAR.
