Dieses Protokoll bietet eine langfristige, in vitro funktionelle Methode zur Bewertung von chimeric Antigen-Rezeptor, oder CAR-T-Zellen, durch sich wiederholende Tumorzell Herausforderung. Diese Technik ist weniger zeitaufwändig und weniger arbeitsintensiv als die Auswertung der in vivo CAR T-Zellfunktion, während sie dennoch eine genaue Darstellung der wahren Anti-Tumor-Wirksamkeit erreicht. Diese In-vitro-Technik ermöglicht das Hochdurchsatz-Screening und die Differenzierung der CAR-T-Zell-Antitumor-Potenz.
Welches hat die mögliche Anwendung für die Bewertung der klinischen Wirksamkeit von CAR T Zellprodukten. Beginnen Sie mit der Dissoziierung von Glioblastom-Tumorsphären aus einer Glioblastom-Tumorsphärenkultur. Mit einem Milliliter Kaltaccutase und 30 bis 60 Sekunden Pipettierung.
Wenn die Tumorsphären gestört sind, stoppen Sie die Reaktion mit fünf Milliliter warmes Co-Kulturmedium. Und pellet die Tumorzellsuspensionen durch Zentrifugation. Setzen Sie die Glioblastomzellen auf 1,6 mal 10 bis die fünfte Tumorzelle pro Milliliter frischer Cokulturmittelkonzentration aus und verdünnt T-Zellen, die aus einer CAR-T-Zellkultur geerntet werden, auf den entsprechenden Prozentsatz der CAR-positiven T-Zellen pro Milliliter Co-Kultur-Mittlerer Konzentration.
Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Tumorzellen zu jedem Brunnen einer 96 gut flachen Bodengewebekulturplatte hinzu. Und 100 Mikroliter CAR-T-Zellen in jeden Brunnen von Tumorzellen mit sanfter Mischung. Dann legen Sie die Platte in einem 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid-Inkubator.
An den Tagen zwei, vier und sechs der Kultur, sorgfältig entfernen 50 Mikroliter Medium aus jedem Brunnen der Tumorzelle, T-Zelle Co-Kultur-Platte für rechallenge nach der Tabelle geplant. Dann fügen Sie 50 Mikroliter frische Glioblastom-Zellsuspension, vorbereitet wie gerade gezeigt, aber mit der doppelten Zellzahl der ursprünglichen Co-Kultur zu jedem Brunnen mit sanften Mischen. Und kehren Sie die Platte an den Zellkultur-Inkubator zurück.
Tage eins, drei, fünf und sieben der Kokultur, übertragen Sie den Überstand von jedem Brunnen, um geerntet zu werden, in eine neue 96 gut runde Bodenplatte nach der Tabelle und fügen Sie 50 Mikroliter vorgewärmte 0,5%Trypsin EDTA in jedes Medium gut erschöpft. Bestätigen Sie nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius, dass sich die Zellen durch Lichtmikroskopie von der Unterseite jedes Brunnens gelöst haben, und pipetten Sie sanft die Enzymlösung um den Boden jedes Brunnens, um die Zellen wieder auszusetzen. Vor der Übertragung der abgetrennten Zellsuspension in die entsprechenden Brunnen der neuen 96 Brunnenplatte.
Pellet die Zellen durch Zentrifugation, und waschen Sie die Zellen mit 200 Mikroliter fluoreszierend aktiviert Zellsortierung stehende Lösung, oder FFS pro Brunnen mit einer zweiten Zentrifugation. Die Pellets in 100 Mikroliterdes Antikörpercocktail von Interesse in 100 Mikroliter SSS pro Brunnen für eine 30-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius wieder aussetzen. A das Ende der Inkubation entfernen alle ungebundenen Antikörper durch sequenzielle 100 und 200 Mikroliter FSS-Washes und suspendieren die Zellen in 100 bis 200 Mikroliter DAPI Kernfleck und FSS.
Analysieren Sie dann die Zellen nach standardmäßigen zytometrischen Analyseprotokollen. Für die funktionelle und phänotypische Analyse der CAR-T-Zellen nach Tumorzell-Kokultur, rufen Sie die Datendateien aus dem Durchflusszytometer ab und vereisten alle lebenden DAPI-Negativzellen. Um die Tumorzellen zu quantifizieren, gate die CD45 negative Population.
Zur Quantifizierung der CAR-T-Zellen wird die CD45-positive CAR-positive Population gemessen. Zeichnen Sie dann den Tumor und die CAR T-Zellzahlen über den Zeitverlauf des Experiments, indem Sie die T-Zellaktivierung durch die Co-Expression von 41BB und CD69 identifizieren. T-Zellerschöpfung durch die Expression von PD1, LAG3 und TIM3, den T-Zellspeicherstatus LAG3 und TIM3 sowie den T-Zellspeicherstatus durch CD45RO und CD62-Ligand-Expression.
cd45RO und CD62 Ligand-Expression. Sowohl CD4-positive als auch CD8-positive CAR-T-Zellen werden gleichermaßen gegen Glioblastomzellen aktiviert, die das Zielantigen entsprechend ihrer CD107a- und intrazellulären Zytokinexpression ausdrücken. Nach Einschätzung der repetitiven Tumorherausforderung SA, CD4-positiv, aber nicht CD8-positiv, sind CAR-T-Zellen jedoch in der Lage, mehrere runde Tötungen zu ermöglichen.
CD4-positive CAR-T-Zellen erzielen ebenfalls eine robustere Expansion. Wenn CD4-positive und CD8-positive CAR-T-Zellen im Verhältnis eins zu eins gemischt werden, führt diese Zellkombination CD8-positive, aber nicht CD4-positive CAR-T-Zellen in Bezug auf die langfristige Zytotoxizität aus. Darüber hinaus wird die Expansion von CD8-positiven CAR-T-Zellen durch die Zugabe von CD4-positiven T-Zellen induziert.
Während CD4 positive CAR T Zellexpansion in Gegenwart von CDa-positiven Zellen gehemmt wird. 24 Stunden nach der anfänglichen Co-Kultur werden sowohl CD4-positive als auch CD8-positive CAR-T-Zellen in ähnlicher Weise aktiviert. Während der sich wiederholenden Tumorherausforderung zeigen sowohl CD4-positive als auch CD8-positive CAR-T-Zellen einen Übergang von einem CD45RO-positiven Zentralspeicher-Phänotyp zu einem CD45RO-positiven CD62-positiven Effektor-Speicher-Phänotyp.
CD8-positive CAR-T-Zellen sind auch anfälliger für Erschöpfung im Vergleich zu CD4-positiven CAR-T-Zellen, die nach drei Tagen Co-Kultur nach ihrer PD1-, LAG3- und TIM3-Expression beurteilt werden. Weiterhin wurden keine Unterschiede bei der CDa-positiven Car-T-Zellerschöpfung in Gegenwart oder Abwesenheit von CD4-positiven T-Zellen beobachtet, was darauf hindeutet, dass CD4-induzierte CD8-positive CAR-T-Zellexpansion nicht mit einer besseren Effektorfunktion verbunden ist. Dieser Aufsatz kann auch mit der Sortierung der T-Zellen gekoppelt werden, die die Kokultur bilden, um weitere Analysen zu Transkriptomen, Proteomik und spezifischen Genen von Interesse durchzuführen.
Diese sich wiederholende Tumorherausforderung könnte auch als Plattform für die Untersuchung der biologischen Ereignisse nach der Erkennung von CAR T-Zelltumoren genutzt werden.
