यह प्रोटोकॉल दोहराव ट्यूमर सेल चैलेंज के माध्यम से चिमरिक एंटीजन रिसेप्टर, या कार टी कोशिकाओं के मूल्यांकन के लिए एक दीर्घकालिक, इन विट्रो, कार्यात्मक विधि प्रदान करता है। इस तकनीक को कम समय लगता है, और कम श्रम वीवो कार टी सेल समारोह मूल्यांकन की तुलना में गहन है, जबकि अभी भी सच विरोधी ट्यूमर प्रभावकारिता का एक सटीक प्रतिनिधित्व प्राप्त करने । यह इन विट्रो तकनीक कार टी सेल एंटी-ट्यूमर शक्ति के उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग और भेदभाव को सक्षम बनाती है।
जिसमें कार टी सेल उत्पादों की नैदानिक प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए संभावित आवेदन है। ग्लियोब्लास्टोमा ट्यूमरस्फीयर संस्कृति से ग्लियोब्लास्टोमा ट्यूमरस्फीयर को अलग करके शुरू करें। ठंड एक्यूटास के एक मिलीलीटर के साथ, और 30 से 60 सेकंड की पिपटिंग।
जब ट्यूमर केमंडल बाधित हो गए हैं, तो पांच मिलीलीटर गर्म सह-संस्कृति माध्यम के साथ प्रतिक्रिया बंद करें। और ट्यूमर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र द्वारा गोली। फिर से ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं को एक १.६ बार 10 ताजा coculture मध्यम एकाग्रता के मिलीलीटर प्रति पांचवें ट्यूमर कोशिकाओं को निलंबित, और तनु टी कोशिकाओं को एक कार टी सेल संस्कृति से काटा सह संस्कृति मध्यम एकाग्रता के मिल्लीटर प्रति कार सकारात्मक टी कोशिकाओं के उचित प्रतिशत के लिए ।
इसके बाद, एक 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे ऊतक संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में पतला ट्यूमर कोशिकाओं के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। और कोमल मिश्रण के साथ ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं में कार टी कोशिकाओं के १०० माइक्रोलीटर । इसके बाद प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% कार्बन डाई ऑक्साइड इनक्यूबेटर में रखें।
दो, चार, और संस्कृति के छह दिनों में, ध्यान से ट्यूमर सेल के प्रत्येक कुएं से माध्यम के ५० माइक्रोलीटर को दूर, टी सेल सह संस्कृति मेज के अनुसार rechallenge के लिए निर्धारित थाली । फिर, ताजा ग्लियोब्लास्टोमा सेल निलंबन के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें, जैसा कि सिर्फ प्रदर्शन किया गया है, लेकिन प्रारंभिक सह-संस्कृति की सेल संख्या को कोमल मिश्रण के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से दो बार करें। और प्लेट को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस करें।
दिन एक, तीन, पांच, और सह संस्कृति के सात, प्रत्येक अच्छी तरह से सुपरनिटांट हस्तांतरण के लिए एक नया ९६ अच्छी तरह से गोल नीचे थाली में मेज के अनुसार काटा जा सकता है और प्रत्येक माध्यम में पूर्व गरम ०.५% Trypsin EDTA के ५० माइक्रोलीटर जोड़ें अच्छी तरह से समाप्त हो गया । ३७ डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के बाद, पुष्टि करें कि कोशिकाओं को प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे से अलग कर दिया है, और धीरे से प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे के आसपास एंजाइम समाधान पिपेट करने के लिए कोशिकाओं को फिर से खर्च । नए 96 कुओं की थाली के उचित संबंधित कुओं में अलग सेल निलंबन स्थानांतरित करने से पहले।
अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को गोली मार, और फ्लोरोसेंट के 200 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने सेल छंटाई स्थायी समाधान, या एक दूसरे अपकेंद्रित्र के साथ अच्छी तरह से एफएफएस सक्रिय। चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट की इनक्यूबेशन के लिए एसएसएस प्रति कुएं के १०० माइक्रोलीटर में ब्याज के एंटीबॉडी कॉकटेल के १०० माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से निलंबित करें । इनक्यूबेशन के अंत में अनुक्रमिक १०० और २०० माइक्रोलीटर FSS धोता द्वारा किसी भी अनबाउंड एंटीबॉडी को दूर करने और DAPI परमाणु दाग और FSS के १०० से २०० माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित ।
फिर, मानक प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण प्रोटोकॉल के अनुसार कोशिकाओं का विश्लेषण करें। ट्यूमर सेल सह-संस्कृति के बाद कार टी कोशिकाओं के कार्यात्मक और फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए, प्रवाह साइटोमीटर से डेटा फ़ाइलों को पुनः प्राप्त करें, और सभी लाइव डीएपीआई नकारात्मक कोशिकाओं को गेट करें। ट्यूमर कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए, सीडी 45 नकारात्मक आबादी को गेट करें।
कार टी कोशिकाओं गेट CD45 सकारात्मक कार सकारात्मक आबादी की मात्रा निर्धारित करने के लिए। फिर प्रयोग के समय पाठ्यक्रम पर ट्यूमर और कार टी सेल नंबर प्लॉट, सह द्वारा टी सेल सक्रियण की पहचान 41BB की अभिव्यक्ति, और सीडी 69 । पीडी 1, लैग3 और टिम 3 की अभिव्यक्ति और टी सेल मेमोरी स्थिति LAG3, और TIM3, और सीडी 45RO द्वारा टी सेल मेमोरी स्थिति, और सीडी 62 लिगांड अभिव्यक्ति द्वारा टी सेल थकावट।
CD45RO द्वारा, और सीडी 62 लिगामेंट अभिव्यक्ति। CD4 सकारात्मक, और सीडी 8 सकारात्मक कार टी कोशिकाएं दोनों ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के खिलाफ समान रूप से सक्रिय हो जाती हैं जो लक्ष्य एंटीजन को व्यक्त करती हैं जैसा कि उनके CD107a और इंट्रासेलुलर साइटोकिन अभिव्यक्ति द्वारा इंगित किया गया है। हालांकि, दोहराव ट्यूमर चैलेंज एसए, सीडी 4 सकारात्मक द्वारा मूल्यांकन के रूप में, लेकिन सीडी 8 सकारात्मक नहीं, कार टी कोशिकाओं को कई दौर की हत्या करने में सक्षम हैं ।
सीडी 4 पॉजिटिव कार टी सेल्स भी ज्यादा मजबूत विस्तार हासिल करते हैं। जब CD4 सकारात्मक, और सीडी 8 सकारात्मक कार टी कोशिकाओं को एक से एक अनुपात में मिलाया जाता है, तो यह सेल संयोजन सीडी 8 को सकारात्मक करता है, लेकिन लंबी अवधि के साइटोटॉक्सिकिटी के मामले में सीडी 4 सकारात्मक कार टी कोशिकाओं को नहीं करता है। इसके अलावा, सीडी 8 पॉजिटिव कार टी कोशिकाओं का विस्तार सीडी 4 पॉजिटिव टी कोशिकाओं के अलावा से प्रेरित है।
जबकि सीडी 4 पॉजिटिव कार टी सेल विस्तार सीडीए पॉजिटिव सेल की मौजूदगी में बाधित होता है। प्रारंभिक सह-संस्कृति के 24 घंटे बाद, सीडी 4 पॉजिटिव और सीडी 8 पॉजिटिव कार टी कोशिकाएं इसी तरह सक्रिय होती हैं। दोहराव ट्यूमर चुनौती के दौरान, दोनों CD4 सकारात्मक और सीडी 8 सकारात्मक कार टी कोशिकाओं एक CD45RO सकारात्मक, CD62 लिगन सकारात्मक केंद्रीय स्मृति फेनोटाइप से एक संक्रमण का प्रदर्शन, एक CD45RO सकारात्मक सीडी62 लिगन नकारात्मक प्रभावदाता स्मृति फेनोटाइप के लिए ।
CD8 सकारात्मक कार टी कोशिकाओं को भी अधिक CD4 सकारात्मक कार टी कोशिकाओं की तुलना में थकावट के लिए प्रवण के रूप में उनके PD1, LAG3, और TIM3 अभिव्यक्ति सह संस्कृति के तीन दिनों के बाद मूल्यांकन कर रहे हैं । इसके अलावा, सीडी 4 सकारात्मक टी कोशिकाओं की उपस्थिति या अनुपस्थिति में सीडीए पॉजिटिव कार टी सेल थकावट में कोई अंतर नहीं देखा गया, यह दर्शाता है कि सीडी 4 प्रेरित सीडी 8 सकारात्मक कार टी सेल विस्तार एक बेहतर प्रभावकार समारोह के साथ जुड़ा हुआ नहीं है। इस निबंध को टी कोशिकाओं को सॉर्ट करने के साथ भी युग्मित किया जा सकता है ताकि ट्रांसक्रिप्टोम, प्रोटेओम्स और रुचि के विशिष्ट जीन पर आगे विश्लेषण करने के लिए सह-संस्कृति का निर्माण किया जा सके।
इस दोहराव ट्यूमर चुनौती भी जैविक घटनाओं के बाद कार टी सेल ट्यूमर मांयता की जांच के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।