Name: measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

الكتاب يود أن ينوه الدكتور كيفين Bittman لقيادته في إنشاء XFp فرس البحر في المختبر. المعاهد الوطنية "للصحة" منح GM088213 تؤيد هذا العمل.

ملاحظة: الرقم 2 لمحة تخطيطي للبروتوكول بالكامل.
1-النمو والمزامنة من السكان السلكية9،10
<ol><li>نقل اليرقات L4 من الخلفيات الوراثية المطلوبة (مثلاً، N2 [نوع البرية] والحيوانات sel-12) على لوحات وسائل الإعلام (NGM) نمو السلكية (انظر ال...

<ol>
	<li>Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+19.">Ch. 19.</a> Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).</li><li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+and+endoplasmic+reticulum+calcium+homeostasis+and+cell+death.">Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death.</a> Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).</li><li>Sarasija, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+mutations+deregulate+mitochondrial+Ca(2+)+homeostasis+and+metabolic+activity+causing+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Luz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Morphology+and+Fundamental+Parameters+of+the+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Are+Altered+in+Caenorhabditis+elegans+Strains+Deficient+in+Mitochondrial+Dynamics+and+Homeostasis+Processes.">Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes.</a> PLoS One. 10, e0130940 (2015).</li><li>Ryu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urolithin+A+induces+mitophagy+and+prolongs+lifespan+in+C.+elegans+and+increases+muscle+function+in+rodents.">Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents.</a> Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).</li><li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).</li><li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress.">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).</li><li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans.">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Structure+in+the+Body+Wall+Muscle+of+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ROS+in+Caenorhabditis+elegans+Using+a+Reduced+Form+of+Fluorescein.">Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).</li><li>Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes.">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).</li><li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones.">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li><li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12,+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer's+disease+gene.">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li><li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer's+disease.">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li><li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mitochondrial+Ca2++in+the+regulation+of+cellular+energetics.">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans.">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li></ol>

التنفس المتقدرية مؤشرا الثاقبة من الوظيفة المتقدرية؛ ولذلك، أن تكون قادرة على قياس معدلات استهلاك الأكسجين في نظام البيولوجي، سواء في المختبر أو في الحية قيمة للغاية. بمعنى ريسبيروميتيرس مستويات الأوكسجين باستخدام فوسفورات المستندة إلى البورفيرين التي تحصل على مروي بالأكسجين أو عن طري...

وتنتج الإنزيمات في سلسلة نقل الإلكترون (إلخ) الموجود في غشاء الميتوكوندريا الداخلية الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، المصدر الرئيسي للطاقة الخلوية، في الميتوكوندريا. بيروفات، المستقلب رئيسية المستخدمة لإنتاج ATP المتقدرية، يتم استيراده في المصفوفة الميتوكوندريا حيث أنها ديكاربوكسيلاتيد لإنتاج أسيتيل مرافق إنزيم أ (CoA). وبعد ذلك، يدخل أسيتيل CoA دورة حمض الستريك أدى إلى توليد نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NADH)، جزيء إلكترون رئيسية الناقل. كما يتم تمرير الإلكترونات من NADH إلى الأوكسجين عبر إلخ، والبروتونات بناء في الفضاء intermembrane الميتوكوندريا، مما يؤدي إلى توليد التدرج الكهروكيميائية عبر الغشاء. ثم ستتدفق هذه البروتونات من الفضاء intermembrane عبر هذا التدرج الكهروكيميائية العودة إلى المصفوفة المتقدرية عن طريق المسام بروتون من synthase ATP، القيادة التناوب وتركيب ATP1 (الشكل 1).
الوظيفة المتقدرية لا يقتصر على إنتاج الطاقة ولكن أيضا أمر حاسم لاستتباب الكالسيوم والأكسجين التفاعلية الأنواع (روس) المسح والمبرمج، حاسمة لتحديد المواقع وظيفتها في الصحة العضوي2. ويمكن تقييم الوظيفة المتقدرية باستخدام مجموعة متنوعة من الاختبارات، بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، التحليلات التي تقيس غشاء الميتوكوندريا المحتملة ومستويات ATP وروس، وتركيزات الكالسيوم المتقدرية. بيد أن هذه الاختبارات توفر لقطة واحدة من الوظيفة المتقدرية ولذلك قد لا يوفر نظرة شاملة لصحة المتقدرية. نظراً لاستهلاك الأوكسجين أثناء توليد ATP يعتمد على عدد وافر تفاعلات متسلسلة، هو بمثابة مؤشر متفوقة من الوظيفة المتقدرية. من المثير للاهتمام، وقد لوحظت اختلافات في معدلات استهلاك الأوكسجين نتيجة خلل mitochondrial3،،من45.
ويمكن قياس معدلات استهلاك الأوكسجين (OCR) للعينات الحية باستخدام التقنيات التي يمكن تقسيم إلى مجموعتين: أمبيروميتريك الأكسجين وأجهزة الاستشعار وفوسفورات المستندة إلى البورفيرين التي يمكن أن تطفئ بالأكسجين6. وقد استخدمت على نطاق واسع أمبيروميتريك الأكسجين وأجهزة الاستشعار لتدبير التعرف الضوئي على الحروف في استزراع الخلايا، الأنسجة، وفي نظم نموذجية، مثل C. ايليجانس. ومع ذلك، تمتلك فوسفورات المستندة إلى البورفيرين التي تحتوي على ريسبيروميتيرس بالمزايا التالية: (1) أنها تسمح بإجراء مقارنة جنبا إلى جنب من عينتين في ثلاث نسخ، (2) أنها تتطلب حجم عينة أصغر (مثل الديدان 20 كل بئر مقابل ~ 2، 000−5، 000 الديدان الدائرة)7، و (3) ريسبيروميتير يمكن برمجتها للقيام بأربع حقن مركبة مختلفة في المطلوب مرات في جميع أنحاء تشغيل تجريبي، مما يلغي الحاجة للتطبيق اليدوي.
في هذا البروتوكول، وهي الخطوات المتضمنة في استخدام ريسبيروميتير الاستشعار الأوكسجين البورفيرين المستندة إلى تدبير التعرف الضوئي على الحروف في العيش، سليمة C. ايليجانس وصف. بينما هناك بروتوكول مكتوب لاستخدام بشكل كبير، الإنتاجية العالية ريسبيروميتير8، تم تكييفها للاستخدام مع أداة ودية وسهلة المنال، وأصغر من حجم ميزانية أكثر هذا البروتوكول. هذا البروتوكول مفيدة بشكل خاص لتقييم الفرق بين السلالات اثنين، حيث الفرز الفائق غير مطلوب وسيكون استعماله المفرط في التعرف الضوئي على الحروف.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm, 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Kord-Valmark Labware Products</td>
			<td>2900, 2901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>6285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 &#215; 22 mm coverslip</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto yeast extract</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>212705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C314-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (dH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C987Y85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Krackeler Scientific</td>
			<td>6-72050-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4&#183;7H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans

الوظيفة المتقدرية الأمثل حاسم بالنسبة للنشاط الخلوي صحية، خاصة في الخلايا التي تحتوي على متطلبات الطاقة العالية مثل تلك الموجودة في الجهاز العصبي والعضلات. يتفق مع هذا، ارتبط خلل mitochondrial بعدد وافر من أمراض الأعصاب والشيخوخة بشكل عام. وقد ايليجانس كاينورهابديتيس نظام نموذجي قوية لتوضيح تعقيدات كثيرة للوظيفة المتقدرية. التنفس المتقدرية يعد مؤشرا قويا للوظيفة المتقدرية ووضعت مؤخرا ريسبيروميتيرس منهاجا الدولة للفنون لقياس التنفس في الخلايا. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم تقنية لتحليل سليمة، والعيش C. ايليجانس. هذا البروتوكول يمتد لفترة ~ 7 أيام ويتضمن خطوات لتنمو وتزامن C. ايليجانس، (2) إعداد المركبات بالحقن وترطيب المسابير، (3) المخدرات خرطوشة وتحميل الموازنة، (4) إعداد المقايسة دودة (1) لوحة والمقايسة تشغيل، وتحليل البيانات بعد التجربة (5).

استخدام البروتوكول الموضحة هنا، التعرف الضوئي على الحروف من الحيوانات البرية نوع وثلاثة مختلفة sel-12 المسخ تم تحديد سلالات. بترميز sel-12 أورثولوج C. ايليجانس presenilin17. الطفرات في بريسينيلين البشرية هي انحراف الوراثية الأكثر شيوعاً المقترنة بتطوير ...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

قياس معدلات استهلاك الأوكسجين في سليمة ايليجانس كاينورهابديتيس

التنفس المتقدرية أمر حاسم لبقاء العضوي؛ ولذلك، معدل استهلاك الأوكسجين مؤشرا ممتازا للصحة المتقدرية. في هذا البروتوكول، يمكننا وصف استخدام ريسبيروميتير المتاحة تجارياً لقياس القاعدية ومعدلات استهلاك الأوكسجين القصوى في العيش، سليمة، وبحرية متحركة ايليجانس كاينورهابديتيس.

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

وظيفة الميتوكوندريا أمر بالغ الأهمية للوسوستاسيس الخلوي ومعدل استهلاك الأكسجين هو مؤشر حاسم على صحة الميتوكوندريا. يوفر هذا البروتوكول تعليمات مفصلة نحو تحليل معدل استهلاك الأكسجين في C.elegans. هذا البروتوكول يجعل من استخدام الحية، المحمول C.elegans توفير قياس قانوني لوظيفة الميتوكوندريا.رفع الحاجة إلى عزل الميتوكوندريا، وهي خطوة يمكن أن تؤثر على النزاهة. للبدء، نقل يرقات L4 من الخلفيات الوراثية المطلوبة على حديقة بذر حديثا من القولونية Escherichia على وسائط نمو الديدان الخيطية أو لوحات NGM. استخدام ما لا يقل عن اثنين من 100 ملم أو ثلاثة 60 ملم لوحات لكل سلالة.احتضان الديدان في درجة حرارة النمو المناسبة لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام، أو حتى تتركز لوحات مع عدد كبير من البيض والديدان جرافيد. اغسل البيض والديدان من الصفائح باستخدام حوالي 6 ملليلترات من M9 العازلة لكل 100 ملليمتر من النيماتودا. باستخدام المواصات المراعي الزجاجية، نقل البيض والديدان إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الفردية 15 ملليلتر لكل سلالة.تدور اٍلُنَايات أسفل لمدة ثلاث دقائق في 6, 180 غ. بعد الطرد المركزي، التعرق خارج العازلة M9 الاحتفاظ فقط الحيوان والبيض بيليه. إضافة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من محلول التبييض لكل أنبوب ودوامة متقطعة لمدة ست دقائق.ثم، إضافة M9 العازلة لملء كل أنبوب وتدور في 6، 180 غرام لمدة دقيقة واحدة. استلهمي المناط وكرري هذا الغسل مع M9، ثلاث مرات. بعد غسل, نقل بيليه البيض إلى أنبوب 15 ملليلتر الطازجة التي تحتوي على ما يقرب من تسعة ملليلتر من M9 العازلة.مزامنة الديدان الطازجة عن طريق nutating في 20 درجة مئوية لمدة 16 إلى 48 ساعة. بعد الغزل هذه الأنابيب إلى أسفل في 6, 180 ز لمدة 1.5 دقيقة, وضع الحيوانات متزامنة L-1 أسفل على العشب بذرة جديدة من OP50 على لوحات NGM الفردية. حافظ على الأطباق عند درجة 20 درجة مئوية حتى تصل الحيوانات إلى مرحلة اليرقات L-4 بعد حوالي 42 ساعة.في هذا الوقت، استخدم اختيار البلاتين لنقل يرقات L4 إلى لوحات NGM المصنفة OP50 التي تحتوي على 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر من FUdR لمنع من إنتاج ذرية. ابرّم خرطوشة المستشعر عن طريق إضافة 200 ميكرولترات من الماء المقطر إلى كل بئر على اللوحة، مما يضمن غمر مسابير الاستشعار. تخزين لوحات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.إيقاف تشغيل عنصر التسخين داخل واجهة مقياس التنفس. تخزين الجهاز داخل حاضنة درجة 15 درجة مئوية يخفض درجة الحرارة الأساسية داخل الجهاز ويمنع الحيوانات من ارتفاع درجة الحرارة أثناء الفحص. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، والماصات من والتخلص من المياه المقطرة المستخدمة لترطيب مسابير الاستشعار، واستبدالها مع 200 ميكرولترات من محلول الكاليبرانت في كل بئر.تخفيف حل FCCP مخزون ل100 FCCP micromolar في الماء المقطر. ثم، إضافة 20 ميكرولترات من محلول مخفف لحقن ميناء A في خرطوشة الاستشعار. إضافة 22 ميكرولتردات من 400 ميليمولار الصوديوم azides لحقن ميناء B من خرطوشة الاستشعار.الآن، قم بتشغيل مقياس التنفس. على الشاشة الرئيسية، حدد بدء وستظهر صفحات القالب. في صفحة القوالب، حدد فارغًا" أو قالب تم تصميمه مسبقًا.ستظهر صفحة المجموعات. في صفحة المجموعات، حدد الآبار A وH كآبار خلفية، وقم بتعيين الآبار الستة المتبقية في مجموعات مناسبة وفقًا للخطة التجريبية. الوصول إلى صفحة البروتوكول بالنقر فوق السهم على اليمين السفلي، وتأكد من أن يتم تحديد رز واحد واثنين من الإكسالات، القاعدية، والحقن.اضبط عدد قراءات OCR القاعدية وكذلك الحد الأقصى OCR وغير الميتوكوندريا OCR. حدد السهم في الزاوية السفلية اليسرى. ستظهر مطالبة لتحميل لوحة خرطوشة المستشعر.تأكد من أن لوحة خرطوشة الاستشعار يتم تحميلها في الاتجاه الصحيح، وذلك باتباع الإرشادات الموجودة على شاشة تذكير موجه. سوف يروّك مقياس التنفس الآن الخراطيش. إضافة 200 ميكروليتر من M9 العازلة في كل من الآبار الثمانية والخزانات المحيطة من لوحة الخلية.اختيار ما يقرب من 100 الديدان من كل سلالة على لوحات NGM غير المصنفة، والسماح للراحة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. ثم، الرطب نهاية اختيار البلاتين مع M9 العازلة واختيار الحيوانات متزامنة سن 20 في الآبار B من خلال G، وترك الآبار الخلفية A وH فارغة. الآن، انقر فوق موافق على برنامج مقياس التنفس لإخراج اللوحة التي تحتوي على مخزن معايرة.قم بإزالة اللوحة من مقياس التنفس تاركاً خرطوشة المستشعر داخل الجهاز. استبدال لوحة الكاليبانت مع لوحة تحتوي على الحيوانات. لوحات تحميل وإغلاق الباب عن طريق ضرب الاستمرار والسماح للمقايسة لتشغيل.بمجرد اكتمال تشغيل الفحص، اتبع المطالبات على الشاشة لإزالة لوحة الخلية وخراطيش الاستشعار. أدخل محرك أقراص محمول في منفذ USB لحفظ تنسيق حرب البيانات. إزالة خرطوشة الاستشعار والسماح للحيوانات لتسوية إلى أسفل الآبار لمدة دقيقتين تقريبا.ضع لوحات الخلايا تحت مجهر ستيريو تشريح وعدد من الحيوانات في البئر. افتح برنامج التحليل، متبوعاً بعلامة التبويب التطبيع، لتطبيع معدلات استهلاك الأكسجين إلى رقم الحيوان. تطبيق مستويات مناسبة للمجموعات المختلفة تحت "علامة التبويب تعديل" ثم تصدير الملف كملف المنشور لمزيد من التحليل.متوسط القياسات الخمسة الأولى هو التعرف الضوئي على الحروف القاعدي. متوسط القياسات الخمسة بعد إضافة FCCP هو أقصى OCR. وأخيراً، فإن متوسط القياسات الخمسة الأخيرة بعد إضافة أزيد الصوديوم هو معدل التنفس غير الميتوكوندريا.منذ dysregulation الكالسيوم يمكن أن يؤدي إلى وظيفة الميتوكوندريا غيرت، OCR في كل من المسوخ sel-12 والحيوانات من النوع البرية تم قياسها لدراسة تأثير الطفرات sel-12 على وظيفة الميتوكوندريا والصحة. أظهرت الحيوانات من النوع البري باستمرار معدلات OCR القاعدية أقل من خمسة picomoles في الدقيقة ، لكل دودة. في حين أن جميع السلالات الثلاث من المسوخ sel-12 أظهرت ارتفاعًا كبيرًا في OCR ، من حوالي سبعة picomoles في الدقيقة ، لكل دودة.عند إضافة FCCP، كانت هناك زيادة في التعرف الضوئي على الحروف من النوع البري، وكذلك المسوخ sel-12، كما هو متوقع. وأظهرت الحيوانات من النوع البرية التعرف الضوئي على الحروف كحد أقصى من حوالي سبعة picomoles في الدقيقة الواحدة، لكل دودة. في حين أن المسوخ sel-12 كان OCR من حوالي 10 picomoles في الدقيقة الواحدة ، لكل دودة.استخدام الحية، وتغذية جيدة، والحيوانات غير المتزامنة في هذا الفحص، وتجنب نقل البيض أو الذبائح في آبار الفحص. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن لا تتجاوز درجة الحرارة الداخلية للأداة 25 درجة مئوية. التبييض، FCCP، FUdR، وأزيد الصوديوم هي سامة.لذلك، ينبغي توخي الحذر لارتداء قفازات واقية أثناء إعداد حلول المخزون وتحميل المخدرات.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

والعزلة في المختبر تفعيل انواع معينة ايليجانس الحيوانات المنوية

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

اللوحة الصلبة المستندة إلى تقييد الغذائية في انواع معينة ايليجانس</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

استخراج البروستاجلاندين والتحليل في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

مكملات غذائية من الأحماض الدهنية غير المشبعة في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

القوارض العمل نموذج القلب لدراسة أداء عضلة القلب واستهلاك الأوكسجين

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

زراعة<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; في ثلاثة أبعاد في المختبر

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

قياس الانخفاض البروتيني البروتيوستيكي الخاص بالأنسجة في إليجانات Caenorhabditis

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

النمذجة العمر المرتبطة الأمراض العصبية في Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...