Name: measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Kevin Bittman for hans vejledning i oprettelse af Seahorse XFp i laboratoriet. National Institutes of Health giver GM088213 støttet dette arbejde.

Bemærk: Figur 2 giver en skematisk oversigt over fuld-protokollen.
1. vækst og synkronisering af nematodeprøveudtagning befolkning9,10
<ol><li>Overføre L4 larver af ønskede genetiske baggrunde (fx N2 [vildtype] og sel-12 dyr) på ødelægge vækst medier (NGM) plader (Se tabel 1 for opskrift) frisk seedede med en græsplæne af Escherichia coli (OP50)11</s...

<ol>
	<li>Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+19.">Ch. 19.</a> Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).</li><li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+and+endoplasmic+reticulum+calcium+homeostasis+and+cell+death.">Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death.</a> Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).</li><li>Sarasija, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+mutations+deregulate+mitochondrial+Ca(2+)+homeostasis+and+metabolic+activity+causing+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Luz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Morphology+and+Fundamental+Parameters+of+the+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Are+Altered+in+Caenorhabditis+elegans+Strains+Deficient+in+Mitochondrial+Dynamics+and+Homeostasis+Processes.">Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes.</a> PLoS One. 10, e0130940 (2015).</li><li>Ryu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urolithin+A+induces+mitophagy+and+prolongs+lifespan+in+C.+elegans+and+increases+muscle+function+in+rodents.">Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents.</a> Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).</li><li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).</li><li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress.">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).</li><li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans.">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Structure+in+the+Body+Wall+Muscle+of+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ROS+in+Caenorhabditis+elegans+Using+a+Reduced+Form+of+Fluorescein.">Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).</li><li>Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes.">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).</li><li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones.">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li><li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12,+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer's+disease+gene.">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li><li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer's+disease.">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li><li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mitochondrial+Ca2++in+the+regulation+of+cellular+energetics.">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans.">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li></ol>

Mitokondrie respiration er en indsigtsfuld indikator af mitokondrie funktion; Derfor er at være i stand til at måle ilt forbrug satser i et biologisk system, om in vitro- eller in vivo meget værdifuld. Respirometers fornemmer ilt niveauer ved hjælp af porfyrin-baserede fosfor, at få slukket af ilt eller via amperometric ilt sensorer, der er baseret på generation af en elektrisk nuværende proportional med ilt pres. Clark elektrode falder ind under sidstnævnte kategori og er blevet brugt flittigt i litteratur, isæ...

Adenosin trifosfat (ATP), den vigtigste kilde til cellulære energi, er produceret i mitokondrier af enzymer i transportkæden, elektron (osv) placeret i den indre mitokondrielle membran. Pyruvat, en central metabolit udnyttet til mitokondrie ATP produktion, der importeres til den mitokondriets matrix, hvor det er decarboxylated til at producere acetyl coenzym A (CoA). Efterfølgende træder acetyl CoA citronsyrecyklus resulterer i generation af nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH), en nøgle elektron luftfartsselskab molekyle. Da elektroner fra NADH overføres til ilt via ETC, hober protoner sig op i den mitokondrielle intermembrane plads, hvilket resulterer i dannelsen af en elektrokemisk gradient på tværs af membranen. Disse protoner vil derefter strømme fra det intermembrane rum på tværs af denne elektrokemiske gradient tilbage ind i mitokondriets matrix gennem proton pore af ATPsyntase, køre sin rotation og syntese af ATP1 (figur 1).
Mitokondrie-funktion er ikke begrænset til energiproduktion, men er også afgørende for calcium homeostase, reaktive ilt arter (ROS) latrintømning og apoptose, kritisk positionering deres funktion i kropsligt sundhed2. Mitokondrie-funktion kan vurderes ved hjælp af en række assays, herunder men ikke begrænset til analyser, der måler mitokondrielle membran potentiale, ATP og ROS niveauer og mitokondriel calcium koncentrationer. Men disse assays giver et enkelt snapshot af mitokondrie funktion og derfor måske ikke giver en omfattende visning af mitokondrie sundhed. Da iltforbrug under ATP generation er afhængige af et utal af sekventielle reaktioner, tjener det som en overlegen indikator af mitokondrie-funktionen. Interessant, er blevet observeret variationer i ilt forbrug satser som følge af mitokondriel dysfunktion3,4,5.
Ilt forbrug satser (OCR) af levende prøver kan måles ved hjælp af teknikker, som kan groft inddeles i to grupper: amperometric ilt sensorer og porfyrin-baserede fosfor, der kan blive slukket af ilt6. Amperometric ilt sensorer har været udbredt foranstaltning OCR i kulturperler celler, væv, og i modelsystemer, som C. elegans. Dog porfyrin-baserede fosforer indeholdende respirometers besidder følgende fordele: (1) de tillader en side om side sammenligning af to stikprøver i tre eksemplarer, (2) de kræver mindre stikprøvestørrelse (f.eks. 20 orm pr. brønd versus ~ 2, 000−5, 000 orme den afdeling)7, og (3) respirometer kan programmeres til at gøre fire forskellige foderblandinger injektioner på ønskede gange hele den eksperimentelle run, eliminerer behovet for manuel påføring.
I denne protokol er trin involveret i at bruge en porfyrin-baserede ilt-sensing respirometer foranstaltning OCR i levende, intakt C. elegans beskrevet. Mens der er en skriftlig protokol for brugen af det store format, høj overførselshastighed respirometer8, er denne protokol blevet tilpasset til brug med en mere budget venligt, tilgængeligt og mindre skala instrument. Denne protokol er især nyttig for at vurdere forskellen i OCR mellem to stammer, hvor høj overførselshastighed screening er ikke påkrævet og dets anvendelse ville være overdrevet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm, 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Kord-Valmark Labware Products</td>
			<td>2900, 2901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>6285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 &#215; 22 mm coverslip</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto yeast extract</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>212705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C314-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (dH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C987Y85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Krackeler Scientific</td>
			<td>6-72050-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4&#183;7H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans

Optimal mitokondrie funktion er afgørende for sund cellulære aktivitet, især i celler, der har høj energi krav som i nervesystemet og muskel. Overensstemmelse med dette, mitokondriel dysfunktion har været forbundet med et utal af neurodegenerative sygdomme og aldring i almindelighed. Caenorhabditis elegans har været et kraftfuld model for belyse de mange snørklede af mitokondrie-funktionen. Mitokondrie respiration er en stærk indikator for mitokondrie funktion og nyligt udviklede respirometers tilbyder en state-of-the-art platform for at måle åndedræt i celler. I denne protokol giver vi en teknik til at analysere levende, intakt C. elegans. Denne protokol spænder over en periode på ~ 7 dage og omfatter trin for (1) vokser og synkronisering af C. elegans, (2) udarbejdelse af forbindelser skal injiceres og hydrering af sonder, (3) stoffet lastning og patron ækvilibrering, (4) udarbejdelsen af ormen assay plade og assay køre og (5) efter eksperiment dataanalyse.

Ved hjælp af protokollen beskrevet heri OCR vildtype dyr og tre forskellige sel-12 mutant stammer blev fastsat. SEL-12 koder C. elegans ortholog presenilin17. Mutationer i menneskelige presenilin er den mest almindelige genetiske aberration forbundet med udviklingen af familiær Alzheimers sygdom18. Vores undersøgelser har vist forhøjet mitokondrie calcium niveauer i sel-12 mutant dyr sammenlignet med v...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Måling af ilt forbrug satser i intakt Caenorhabditis elegans

Mitokondrie respiration er kritisk for kropsligt overlevelse; ilt forbrugssats er derfor en udmærket indikator for mitokondrie sundhed. I denne protokol, vi beskriver brugen af en kommercielt tilgængelig respirometer at måle basal og maksimal ilt forbrug satser i live, intakt og frit motile Caenorhabditis elegans.

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Mitokondriel funktion er afgørende for cellulære homøostase og iltforbrug sats er en afgørende indikator for mitokondrielle sundhed. Denne protokol indeholder detaljerede instruktioner til analyse af iltforbrug i C.elegans. Denne protokol gør brug af levende, mobile C.elegans giver en juridisk måling af mitokondrielle funktion.Opløftende behovet for at isolere mitokondrier, et skridt, der potentielt kan påvirke det integritet. Til at begynde, overføre L4 larver af ønskede genetiske baggrunde på en friskfrøet græsplæne af Escherichia coli på nematode vækstmedier eller NGM plader. Brug mindst to 100 mm eller tre 60 mm plader til hver stamme.Inkuber ormene ved den rette væksttemperatur i tre til fire dage, eller indtil pladerne er koncentreret med et stort antal æg og gravid orme. Vask æg og orme af pladerne med ca. 6 milliliter M9-buffer pr. 100 millimeter plade af nematoder. Brug glas græs pipetter, overføre æg og orme i individuelle 15 milliliter centrifuge rør for hver stamme.Drej disse rør ned i tre minutter ved 6, 180 g. Efter centrifugering, aspirere ud M9 buffer bevarer netop dyr og æg pellet. Tilføj tre til fire milliliter blegemiddel opløsning til hvert rør og intermitterende vortex i seks minutter.Derefter tilsættes M9 buffer til at fylde hvert rør og spin på 6, 180 g i et minut. Inspirer supernatanten og gentag denne vask med M9, tre gange. Efter vask, flyttes ægpellet til en frisk 15 milliliter rør, der indeholder ca. ni milliliter M9 buffer.Synkroniser de nyudklækkede orme ved at duppe ved 20 grader Celsius i 16 til 48 timer. Efter spinding disse rør ned på 6, 180 g i 1,5 minutter, sætte synkroniserede L-1 dyr ned på en frisk seedet græsplæne af OP50 på de enkelte NGM plader. Hold pladerne ved 20 grader Celsius, indtil dyrene når L-4 larve fase efter ca 42 timer.På dette tidspunkt, bruge en platin pick til at flytte L4 larver til OP50 seedede NGM plader, der indeholder 0,5 milligram pr. milliliter FUdR for at forhindre, at der produceres afkom. Hydrer sensorpatronen ved at tilsætte 200 mikroliter destilleret vand til hver brønd på pladen, så sensorsonderne er nedsænket. Opbevar pladerne natten over ved stuetemperatur.Sluk for varmeelementet i respirometergrænsefladen. Opbevaring af maskinen inde i en 15 grader Celsius inkubator sænker kernetemperaturen i maskinen og forhindrer dyrene i at overophede under analysen. Efter nattens inkubation pipettes det destilleret vand, der bruges til at fugte sensorsonderne, ud og udskifte det med 200 mikroliter af kalibreringsopløsningen i hver brønd.FCCP-stamopløsningen fortyndes til 100 mikromolar FCCP i destilleret vand. Tilsæt derefter 20 mikroliter af den fortyndede opløsning til injektionsport A i sensorpatronen. Der tilsættes 22 mikroliter på 400 millimolarnatriumazider til sensorpatronens injektionsport B.Tænd for respirometeret. Vælg start på startskærmen, og skabelonsiderne vises. Vælg tom" eller en skabelon, der er designet tidligere på skabelonsiden.Gruppesiden vises. På gruppesiden skal du vælge brønde A og H som baggrundstinge og tildele de resterende seks brønde i passende grupper i henhold til forsøgsplanen. Få adgang til protokolsiden ved at klikke på pilen nederst til højre, og sørg for, at ligevægten, basal og injektioner en og to-knappen er valgt.Juster antallet af aflæsninger af basal OCR samt maksimal OCR og ikke-mitokondriel OCR. Vælg pilen i nederste højre hjørne. Der vises en meddelelse om at indlæse sensorpatronpladen.Sørg for, at sensorpatronens plade er placeret i den rigtige retning, ved at følge vejledningen på påmindelsesmeddelelsesskærmen. Respirameteret vil nu ligevægte patronen. Der tilsættes 200 mikroliter M9-buffer i hver af de otte brønde og de omkringliggende reservoirer på cellepladen.Pick ca 100 orme fra hver stamme på unseeded NGM plader, og lad det hvile i to til tre minutter. Derefter våd slutningen af platin pick med M9 buffer og pick 20 alder synkroniseret dyr i brønde B gennem G, forlader baggrunden brønde A og H tom. Klik nu på OK på respirometersoftwaren for at skubbe pladen, der indeholder kalibreringsbufferen ud.Fjern pladen fra respirometeret og lade sensorpatronen være inde i instrumentet. Sæt kalibrantpladen på med den plade, der indeholder dyrene. Læg plader og lukke døren ved at trykke fortsætte og lad analysen til at køre.Når analysen er fuldført, skal du følge anvisningerne på skærmen for at fjerne cellepladen og sensorpatronen. Indsæt et flashdrev i USB-porten for at gemme køredatakrigsformatet. Fjern sensorpatronen, og lad dyrene falde til bunds i bunden af brøndene i ca. to minutter.Placer cellepladerne under et stereodekermikroskop, og tæl antallet af dyr pr. brønd. Åbn analysesoftwaren, efterfulgt af fanen normalisering, for at normalisere iltforbruget til antallet af dyr. Anvend passende niveauer for de forskellige grupper under fanen rediger, og eksportér filen som en prismefil til yderligere analyse.Gennemsnittet af de første fem målinger er den basale OCR. Gennemsnittet af de fem målinger efter FCCP-tilføjelse er den maksimale OCR. Endelig er gennemsnittet af de sidste fem målinger efter natriumazidid-tilsætning den ikke-mitokondrielle respirationshastighed.Da calciumdysregulering kan resultere i ændret mitokondriel funktion, blev OCR hos både sel-12 mutanter og vilde dyr målt for at undersøge virkningen af sel-12 mutationer på mitokondriel funktion og sundhed. Vilde type dyr konsekvent viste basal OCR satser under fem picomoles per minut, per orm. Mens alle tre stammer af sel-12 mutanter viste signifikant forhøjet OCR, på cirka syv picomoler per minut, per orm.Ved tilsætning af FCCP, der var en stigning i OCR af vilde type, samt sel-12 mutanter, som forventet. Vilde type dyr viste maksimal OCR på cirka syv picomoler per minut, per orm. Mens sel-12 mutanter havde OCR på ca. 10 picomoler pr. minut, pr. orm.Brug levende, godt fodret, og asynkroniserede dyr i denne analyse, og undgå overførsel af æg eller slagtekroppe i assay brønde. Desuden bør instrumentets indre temperatur ikke overstige 25 grader Celsius. Bleach, FCCP, FUdR, og natrium azide er giftige.Derfor bør man passe på med beskyttelseshandsker under klargøring af lageropløsninger og lægemiddelbelastning.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grundlæggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Udvinding og Analyse i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Måling af mRNA henfaldskurver i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Brug<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Stammer

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Rodent Working Heart Model for Studiet af Myokardie Ydelse og iltforbrug

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

dyrkning af<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I tre dimensioner i laboratoriet

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Kvantificering af vævsspecifik proteostatisk tilbagegang i caenorhabditis eleganer

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Vurdering af de novo proteinsyntese i Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...