Name: measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

De auteurs wil erkennen van Dr. Kevin Bittman voor zijn leiding bij de vaststelling van de Seahorse XFp in het lab. National Institutes of Health verlenen dat gm088213 ondersteund dit werk.

Opmerking: Figuur 2 geeft een schematisch overzicht van het volledige protocol.
1. groei en synchronisatie van nematode bevolking9,10
<ol><li>Overdracht van L4 larven van gewenste genetische achtergronden (bijvoorbeeld N2 [wild type] en sel-12 dieren) op nematode groei media (NGM) platen (Zie tabel 1 voor recept) vers bezaaid met een gazon van Escherichia coli (OP50)<sup class="...

<ol>
	<li>Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+19.">Ch. 19.</a> Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).</li><li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+and+endoplasmic+reticulum+calcium+homeostasis+and+cell+death.">Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death.</a> Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).</li><li>Sarasija, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+mutations+deregulate+mitochondrial+Ca(2+)+homeostasis+and+metabolic+activity+causing+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Luz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Morphology+and+Fundamental+Parameters+of+the+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Are+Altered+in+Caenorhabditis+elegans+Strains+Deficient+in+Mitochondrial+Dynamics+and+Homeostasis+Processes.">Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes.</a> PLoS One. 10, e0130940 (2015).</li><li>Ryu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urolithin+A+induces+mitophagy+and+prolongs+lifespan+in+C.+elegans+and+increases+muscle+function+in+rodents.">Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents.</a> Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).</li><li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).</li><li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress.">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).</li><li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans.">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Structure+in+the+Body+Wall+Muscle+of+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ROS+in+Caenorhabditis+elegans+Using+a+Reduced+Form+of+Fluorescein.">Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).</li><li>Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes.">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).</li><li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones.">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li><li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12,+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer's+disease+gene.">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li><li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer's+disease.">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li><li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mitochondrial+Ca2++in+the+regulation+of+cellular+energetics.">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans.">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li></ol>

Mitochondriale ademhaling is een inzichtelijke indicator van mitochondriale functie; Daarom is het zeer waardevol kunnend meten de zuurstof verbruik in een biologisch systeem, of in vitro of in vivo. Respirometers zin zuurstofniveaus met behulp van porfyrine gebaseerde fosfordeeltjes die uitgeblust krijgen door zuurstof of via amperometrische zuurstofsensoren die afhankelijk zijn van de generatie van een elektrische huidige evenredige zuurstof onder druk. Clark-elektrode in de laatstgenoemde categorie valt en is uitgebre...

Adenosinetrifosfaat (ATP), de belangrijkste bron van cellulaire energie, wordt geproduceerd in de mitochondriën door enzymen in het elektronentransport keten (ETC) gelegen in het binnenste van de mitochondriale membraan. Pyruvaat, een belangrijke metaboliet gebruikt voor mitochondriale ATP productie, wordt geïmporteerd in de mitochondriale matrix waar er gedecarboxyleerd tot acetyl coenzym A (CoA). Vervolgens treedt acetyl CoA de citroenzuurcyclus resulterend in de generatie van nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), een belangrijke elektron vervoerder molecuul. Zoals elektronen uit NADH worden doorgegeven aan zuurstof via de enz, opbouwen protonen in de mitochondriale intermembrane ruimte, wat in het genereren van een elektrochemische gradiënt over het membraan resulteert. Deze protonen zal dan vloeien voort uit de intermembrane ruimte over deze elektrochemische gradiënt terug naar de mitochondriale matrix door middel van de proton porie van de ATP-synthase, rijden de rotatie en de synthese van ATP1 (Figuur 1).
Mitochondriale functie is niet beperkt tot de productie van energie, maar is ook van cruciaal belang voor de calcium-homeostase, reactieve zuurstof soorten (ROS) opruiming en apoptosis, kritisch positionering van hun functie in organisch gezondheid2. Mitochondriale functie kan worden beoordeeld met behulp van een verscheidenheid van tests, met inbegrip van maar niet beperkt tot analyses die meten van Mitochondriale membraanpotentiaal, ATP en ROS niveaus en concentraties van de mitochondriale calcium. Echter misschien deze testen bieden een enkele momentopname van mitochondriale functie en daarom niet een uitgebreid overzicht van mitochondriale gezondheid. Omdat zuurstofverbruik tijdens ATP generatie afhankelijk van een groot aantal opeenvolgende reacties is, dient het als een superieure indicator van mitochondriale functie. Interessant is dat verschillen in zuurstof verbruik geconstateerd als gevolg van mitochondriale dysfunctie3,4,5.
Zuurstof verbruik (OCR) levende monsters kan worden gemeten met behulp van technieken die kunnen grofweg worden verdeeld in twee groepen: amperometrische zuurstofsensoren en porfyrine gebaseerde fosfordeeltjes die kunnen worden gehard door zuurstof6. Amperometrische zuurstofsensoren zijn uitvoerig gebruikt om maatregel OCR in gekweekte cellen, weefsels, en in modelsystemen, zoals C. elegans. Echter porfyrine gebaseerde fosforen met respirometers bezitten de volgende voordelen: (1) zij voorzien in een side-by-side vergelijking van twee monsters in drievoud, (2) ze kleinere steekproefgrootte vereisen (bijvoorbeeld 20 wormen per putje versus ~ 2, 000−5, 000 wormen de kamer)7, en (3) de respirometer kan worden geprogrammeerd om te doen vier verschillende samengestelde injecties op gewenste tijden gedurende de experimentele, eliminerend de behoefte aan manuele toepassing.
In dit protocol zijn de stappen die betrokken zijn bij het gebruik van een porfyrine gebaseerde zuurstof detecterende respirometer maatregel OCR in live, intact C. elegans beschreven. Hoewel er een schriftelijke protocol voor het gebruik van het grote formaat, hoge doorvoer respirometer8, is dit protocol aangepast voor gebruik met een meer budget-vriendelijk, toegankelijk en kleinere schaal instrument geweest. Dit protocol is vooral handig voor het beoordelen van het verschil in OCR tussen twee stammen, waar high-throughput screening is niet nodig en het gebruik ervan overdreven hoog zouden uitvallen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm, 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Kord-Valmark Labware Products</td>
			<td>2900, 2901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>6285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 &#215; 22 mm coverslip</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto yeast extract</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>212705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C314-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (dH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C987Y85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Krackeler Scientific</td>
			<td>6-72050-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4&#183;7H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans

Optimale mitochondriale functie is essentieel voor gezonde cellulaire activiteit, met name in de cellen met hoge energie eisen zoals die in het zenuwstelsel en de spieren. Overeenstemming met dit, mitochondriale dysfunctie is in verband gebracht met een groot aantal neurodegeneratieve ziektes en veroudering in het algemeen. Caenorhabditis elegans geweest een krachtige modelsysteem voor het ophelderen van de vele fijne kneepjes van mitochondriale functie. Mitochondriale ademhaling is een sterke indicator van mitochondriale functie en onlangs ontwikkelde respirometers bieden een state-of-the-art platform voor het meten van de ademhaling in cellen. In dit protocol bieden wij een techniek voor het analyseren van de live, intact C. elegans. Dit protocol omvat een periode van ~ 7 dagen en bevat stappen voor het (1) groeien en synchronisatie van C. elegans, (2) voorbereiding van verbindingen worden geïnjecteerd en hydratatie van de sondes, (3) drug laden en cartridge evenwichtsinstelling, (4) voorbereiding van worm assay plaat en test uitvoeren, en (5) na experiment data-analyse.

Met behulp van het protocol die hierin worden beschreven, OCR van wild type dieren en drie verschillende sel-12 mutant stammen werden bepaald. Sel-12 codeert de C. elegans ortholog presenilin17. Mutaties in menselijke presenilin zijn de meest voorkomende genetische aberratie in verband met de ontwikkeling van familiale van Alzheimer18. Onze studies hebben aangetoond verhoogde mitochondrial calciumgehalte in sel...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Meting van zuurstof verbruik in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondriale ademhaling is van cruciaal belang voor de overleving van het organisch; Daarom is zuurstof verbruik tarief is een uitstekende indicator voor mitochondriale gezondheid. In dit protocol, beschrijven we het gebruik van een commercieel beschikbare respirometer voor het meten van basale en maximale zuurstof verbruik in leven, intact, en vrij-sporenvormende Caenorhabditis elegans.

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Mitochondriale functie is van cruciaal belang voor cellulaire homeostase en zuurstofverbruik is een beslissende indicator van mitochondriale gezondheid. Dit protocol geeft gedetailleerde instructies voor het analyseren van het zuurstofverbruik in C.elegans. Dit protocol maakt gebruik van live, mobiele C.elegans die een wettelijke meting van mitochondriale functie.Het verhogen van de noodzaak om mitochondriën te isoleren, een stap die potentieel effect kan hebben op zijn integriteit. Om te beginnen, breng L4 larven van gewenste genetische achtergronden over op een vers ingezaaid gazon van Escherichia coli op nematode groeimedia of NGM-platen. Gebruik voor elke stam ten minste twee platen van 100 mm of drie platen van 60 mm.Broed de wormen drie tot vier dagen bij de juiste groeitemperatuur, of totdat de platen zijn geconcentreerd met een groot aantal eieren en gravidwormen. Was de eieren en wormen van de platen met ongeveer 6 milliliter M9 buffer per 100 millimeter plaat van aaltjes. Met behulp van glazen weide pipetten, breng de eieren en wormen in individuele 15 milliliter centrifuge buizen voor elke stam.Draai de buizen van de stellingen drie minuten naar beneden op 6, 180 g. Na centrifugatie, aspirate uit de M9 buffer behoud van alleen het dier en ei pellet. Voeg drie tot vier milliliter bleekmiddel oplossing aan elke buis en met tussenpozen vortex gedurende zes minuten.Voeg vervolgens M9-buffer toe om elke buis te vullen en draai gedurende een minuut op 6, 180 g. Aspirate de supernatant en herhaal deze was met de M9, drie keer. Verplaats na de was de eierpellet naar een verse buis van 15 milliliter met ongeveer negen milliliter M9-buffer.Synchroniseer de vers uitgebroede wormen door 16 tot 48 uur te nuteren bij 20 graden Celsius. Na het spinnen van deze buizen naar beneden op 6, 180 g gedurende 1,5 minuten, zet de gesynchroniseerde L-1 dieren neer op een vers ingezaaid gazon van OP50 op individuele NGM platen. Houd de platen op 20 graden Celsius totdat de dieren na ongeveer 42 uur het larvale stadium van L-4 bereiken.Gebruik op dit moment een platina pick om de L4 larven te verplaatsen naar OP50 gezaaide NGM-platen met 0,5 milligram per milliliter FUdR om te voorkomen dat het nageslacht produceert. Hydrateer de sensorcartridge door 200 microliter gedestilleerd water aan elke put op de plaat toe te voegen, zodat de sensorsondes onder water komen te staan. Bewaar de platen 's nachts op kamertemperatuur.Schakel het verwarmingselement in de respirometer-interface uit. Het opslaan van de machine in een 15 graden Celsius incubator verlaagt de kerntemperatuur in de machine en voorkomt dat de dieren oververhit raken tijdens de test. Na nachtelijke incubatie, pipet uit en gooi het gedestilleerde water gebruikt om de sensor sondes hydrateren, en vervang het door 200 microliters van de calibrant oplossing in elke put.Verdun de FCCP-voorraadoplossing tot 100 micromolar FCCP in gedestilleerd water. Voeg vervolgens 20 microliter van de verdunde oplossing toe aan injectiepoort A in de sensorcartridge. Voeg 22 microliter van 400 millimolar natriumanikides toe aan injectiepoort B van de sensorcartridge.Zet nu de respirometer aan. Selecteer start op het startscherm en de sjabloonpagina's worden weergegeven. Selecteer op de pagina sjablonen leeg of een eerder ontworpen sjabloon.De groepspagina wordt weergegeven. Selecteer op de groepspagina de putten A en H als achtergrondputten en wijs de resterende zes putten toe aan geschikte groepen volgens het experimentele plan. Toegang tot de protocolpagina door op de pijl rechtsonder te klikken en ervoor te zorgen dat de knop gelijk, basaal en injecties één en twee worden geselecteerd.Pas het aantal metingen van basale OCR aan, evenals maximale OCR en niet-mitochondriale OCR. Selecteer de pijl rechtsonder. Er verschijnt een prompt om de sensorcartridgeplaat te laden.Zorg ervoor dat de sensorcartridgeplaat in de juiste richting wordt geladen en volg de instructies op het herinneringspromptscherm. De respirameter zal nu de cartridge in evenwicht brengen. Voeg 200 microliter M9 buffer in elk van de acht putten en de omliggende reservoirs van de celplaat.Kies ongeveer 100 wormen van elke stam op ongeplaatste NGM-platen en laat twee tot drie minuten rusten. Maak vervolgens het einde van de platina pick met M9-buffer nat en kies 20 leeftijdsgesynchroniseerde dieren in putten B tot en met G, waardoor de achtergrondputten A en H leeg blijven. Klik nu op OK op de respirometersoftware om de plaat met kalibratiebuffer uit te werpen.Haal de plaat uit de respirometer, waardoor de sensorcartridge in het instrument blijft zitten. Vervang de remklauwplaat door de plaat met de dieren. Laad platen en sluit de deur door te raken blijven en laat de test te lopen.Zodra de test is voltooid, volg de aanwijzingen op het scherm om de celplaat en sensorcartridge te verwijderen. Plaats een flashdrive in de USB-poort om de run data war-indeling op te slaan. Verwijder de sensorcartridge en laat de dieren zich ongeveer twee minuten tot de bodem van de putten nestelen.Plaats de celplaten onder een stereoontledenmicroscoop en tel het aantal dieren per put. Open de analysesoftware, gevolgd door het normalisatietabblad, om het zuurstofverbruik te normaliseren tot het aantal dieren. Pas de juiste niveaus toe voor de verschillende groepen onder het tabblad Wijzigen en exporteer het bestand als prismabestand voor verdere analyse.Het gemiddelde van de eerste vijf metingen is de basale OCR. Het gemiddelde van de vijf metingen na FCCP toevoeging is de maximale OCR. Ten slotte is het gemiddelde van de laatste vijf metingen na natriumadetoevoeving de niet-mitochondriale ademhalingssnelheid.Aangezien calciumontregeling kan leiden tot een veranderde mitochondriale functie, werd OCR bij zowel de sel-12 mutanten als wilde diersoorten gemeten om het effect van sel-12 mutaties op mitochondriale functie en gezondheid te onderzoeken. Wilde diersoorten vertoonden consequent basale OCR-tarieven van minder dan vijf picomoles per minuut, per worm. Terwijl alle drie stammen van sel-12 mutanten significant verhoogde OCR, van ongeveer zeven picomoles per minuut, per worm toonden.Na de toevoeging van FCCP, was er een toename van de OCR van wilde type, evenals sel-12 mutanten, zoals verwacht. Wilde diersoorten toonden een maximale OCR van ongeveer zeven picomoles per minuut, per worm. Terwijl sel-12 mutanten OCR van ongeveer 10 picomoles per minuut hadden, per worm.Gebruik levende, goed gevoede en asynchroniseerde dieren in deze test, en vermijd de overdracht van eieren of karkassen in assay putten. Bovendien mag de interne temperatuur van het instrument niet hoger zijn dan 25 graden Celsius. Bleekmiddel, FCCP, FUdR en natriumadium zijn giftig.Daarom moet ervoor worden gezorgd dat beschermende handschoenen worden gedragen tijdens de voorbereiding van voorraadoplossingen en het laden van drugs.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolatie en In vitro Activering van Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based dieetbeperking in Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse microscopie van de vroege embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandine-extractie en analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Meting van mRNA Decay tarieven in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Het gebruik van<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Stammen

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Knaagdier Werken Heart Model voor de Studie van hartspierprestatie en Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

teelt van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In drie dimensies in het Laboratorium

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Beoordeling van de novo Eiwit synthese tarieven in Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...