Name: measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Les auteurs tenons à remercier le Dr Kevin Bittman pour ses conseils dans l’établissement de l’hippocampe XFp dans le laboratoire. National Institutes of Health accorder que gm088213 prise en charge de ce travail.

NOTE : La Figure 2 donne un aperçu schématique du protocole complet.
1. la croissance et la synchronisation de la population des nématodes9,10
<ol><li>Transfert L4 larves d’origines génétiques souhaitées (par exemple, N2 [sauvage] et sel-12 animaux) sur des plaques de médias (NGM) croissance nématode (voir le tableau 1 pour la recette) fraîchement ensemencées avec une pelous...

<ol>
	<li>Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+19.">Ch. 19.</a> Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).</li><li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+and+endoplasmic+reticulum+calcium+homeostasis+and+cell+death.">Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death.</a> Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).</li><li>Sarasija, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+mutations+deregulate+mitochondrial+Ca(2+)+homeostasis+and+metabolic+activity+causing+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Luz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Morphology+and+Fundamental+Parameters+of+the+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Are+Altered+in+Caenorhabditis+elegans+Strains+Deficient+in+Mitochondrial+Dynamics+and+Homeostasis+Processes.">Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes.</a> PLoS One. 10, e0130940 (2015).</li><li>Ryu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urolithin+A+induces+mitophagy+and+prolongs+lifespan+in+C.+elegans+and+increases+muscle+function+in+rodents.">Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents.</a> Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).</li><li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).</li><li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress.">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).</li><li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans.">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Structure+in+the+Body+Wall+Muscle+of+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ROS+in+Caenorhabditis+elegans+Using+a+Reduced+Form+of+Fluorescein.">Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).</li><li>Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes.">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).</li><li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones.">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li><li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12,+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer's+disease+gene.">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li><li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer's+disease.">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li><li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mitochondrial+Ca2++in+the+regulation+of+cellular+energetics.">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans.">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li></ol>

La respiration mitochondriale est un indicateur perspicace de la fonction mitochondriale ; par conséquent, être capable de mesurer les taux de consommation d’oxygène dans un système biologique, si in vitro ou in vivo est extrêmement précieux. Respiromètres détecte les niveaux d’oxygène à l’aide de phosphores axée sur la porphyrine qui s’éteint par l’oxygène ou par l’intermédiaire de capteurs d’oxygène ampérométrique qui reposent sur la génération d’une proportionnelle de courant élect...

L’adénosine triphosphate (ATP), la principale source d’énergie cellulaire, est produit dans les mitochondries par les enzymes de la chaîne de transport d’électrons (etc.) situés dans la membrane mitochondriale interne. Un métabolite clé utilisé pour la production d’ATP mitochondriale, le pyruvate est importé dans la matrice mitochondriale où elle est décarboxylée pour produire du coenzyme A (CoA). Par la suite, acétyl-CoA pénètre dans le cycle de Krebs ayant pour résultat la génération de nicotinamide adénine dinucléotide (NADH), une molécule porteuse de clé électronique. Comme les électrons de NADH sont passés à l’oxygène par le CTE, protons s’accumuler dans l’espace intermembranaire mitochondrial, qui se traduit par la génération d’un gradient électrochimique à travers la membrane. Ces protons ensuite découleront de l’espace intermembranaire à travers ce gradient électrochimique dans la matrice mitochondriale par le pore de proton de l’ATP synthase, conduire sa rotation et la synthèse de l’ATP1 (Figure 1).
La fonction mitochondriale n’est pas limitée à la production d’énergie, mais est également cruciale pour l’homéostasie du calcium, espèces réactives de l’oxygène (ROS) nettoyage et apoptose, positionnement critique leur fonction organismique santé2. La fonction mitochondriale peut être évaluée en utilisant une variété de tests, y compris mais sans s’y limiter à des analyses qui mesurent le potentiel de membrane mitochondrial, les niveaux d’ATP et ROS et concentrations de calcium mitochondrique. Toutefois, ces analyses donnent un aperçu unique de la fonction mitochondriale et donc ne pourraient pas fournir une vision globale de la santé mitochondriale. Étant donné que la consommation d’oxygène pendant la génération d’ATP est tributaire d’une myriade de réactions séquentielles, il sert un indicateur supérieur de la fonction mitochondriale. Fait intéressant, les variations dans les taux de consommation d’oxygène ont été observées à la suite de dysfonctionnement mitochondrial3,4,5.
Taux de consommation d’oxygène (OCR) des échantillons vivants peuvent être mesurées à l’aide de techniques qui peuvent être largement divisés en deux groupes : ampérométrique sondes d’oxygène et phosphores axée sur la porphyrine qui peuvent être éteint par l’oxygène6. Sondes d’oxygène ampérométrique ont été largement utilisés à mesure OCR en cellules, tissus et dans les systèmes de modèle, comme c. elegans. Cependant, les phosphores axée sur les porphyrines contenant respiromètres possèdent les avantages suivants : (1) elles permettent une comparaison côte à côte de deux échantillons en trois exemplaires, (2) ils ont besoin de plus petite taille de l’échantillon (par exemple, 20 vers / puits contre ~ 2, 000−5, 000 vers chez le 7de la chambre) et (3) le respiromètre peut être programmé pour faire quatre injections de composés différentes à désiré fois tout au long de la course expérimentale, éliminant le besoin d’application manuelle.
Dans ce protocole, les étapes à suivre pour utiliser un respiromètre de détection oxygène porphyrine-basé à mesure OCR en live, intact c. elegans sont décrit. Bien qu’il y a un protocole écrit pour l’utilisation du format grand, haut débit respiromètre8, ce protocole a été adapté pour une utilisation avec un instrument plus d’échelle sympathique, accessible et plus petit budget. Ce protocole est particulièrement utile pour évaluer la différence de l’OCR entre deux souches, où criblage à haut débit n’est pas nécessaire et son utilisation serait excessive.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm, 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Kord-Valmark Labware Products</td>
			<td>2900, 2901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>6285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 &#215; 22 mm coverslip</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto yeast extract</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>212705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C314-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (dH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C987Y85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Krackeler Scientific</td>
			<td>6-72050-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4&#183;7H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans

La fonction mitochondriale optimale est critique pour l’activité cellulaire en bonne santé, en particulier dans les cellules qui ont des exigences de haute énergie comme ceux du système nerveux et musculaire. Compatible avec cela, dysfonctionnement mitochondrial a été associé à une multitude de maladies neurodégénératives et vieillissement en général. Caenorhabditis elegans ont été un système puissant modèle pour élucider les nombreuses subtilités de la fonction mitochondriale. La respiration mitochondriale est un bon indicateur de la fonction mitochondriale et respiromètres récemment développés offrent une plate-forme d’état-of-the-art pour mesurer la respiration dans les cellules. Dans ce protocole, nous fournissons une technique pour analyser live, intact c. elegans. Ce protocole s’étend sur une période d’environ 7 jours et inclut des étapes de croissance (1) et la synchronisation c. elegans, (2) préparation de composés à doser et l’hydratation des sondes, chargement et cartouche l’équilibration du médicament (3), (4) préparation du test de ver plaque et épreuve et analyse des données de test post (5).

En utilisant le protocole décrit dans les présentes, OCR des animaux de type sauvage et trois différents sel-12 mutant souches ont été déterminés. sel-12 encode les orthologues de c. elegans de préséniline17. Mutations humaine préséniline sont l’aberration génétique plus commune associée au développement de la maladie d’Alzheimer familiale18. Nos études ont montré des niveaux élevés de calciu...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mesure des taux de consommation d’oxygène intactes de Caenorhabditis elegans

La respiration mitochondriale est critique pour la survie de l’organisme ; par conséquent, le taux de consommation d’oxygène est un excellent indicateur de la santé mitochondriale. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation d’un respiromètre commercialement disponible pour mesurer basale et taux de consommation maximale d’oxygène en vivent, intact et librement mobiles Caenorhabditis elegans.

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

La fonction mitochondriale est essentielle à l’homéostasie cellulaire et le taux de consommation d’oxygène est un indicateur décisif de la santé mitochondriale. Ce protocole fournit des instructions détaillées pour analyser le taux de consommation d’oxygène dans C.elegans. Ce protocole utilise des C.elegans mobiles vivants fournissant une mesure légale de la fonction mitochondriale.Élever la nécessité d’isoler les mitochondries, une étape qui pourrait potentiellement avoir un effet sur son intégrité. Pour commencer, transférez les larves L4 des milieux génétiques désirés sur une pelouse fraîchement ensemencée d’Escherichia coli sur des supports de croissance de nématode ou des plaques de NGM. Utilisez au moins deux plaques de 100 mm ou trois plaques de 60 mm pour chaque souche.Incuber les vers à la température de croissance appropriée pendant trois à quatre jours, ou jusqu’à ce que les plaques soient concentrées avec un grand nombre d’œufs et de vers gravids. Lavez les œufs et les vers des plaques à l’aide d’environ 6 millilitres de tampon M9 par plaque de nématodes de 100 millimètres. À l’aide de pipettes de pâturage en verre, transférer les œufs et les vers dans des tubes de centrifugeuse individuels de 15 millilitres pour chaque souche.Faites tourner ces tubes vers le bas pendant trois minutes à 6, 180 g. Après centrifugation, aspirez le tampon M9 en conservant seulement l’animal et la pastille d’oeuf. Ajouter trois à quatre millilitres de solution d’eau de Javel à chaque tube et vortex par intermittence pendant six minutes.Ajouter ensuite le tampon M9 pour remplir chaque tube et tourner à 6 180 g pendant une minute. Aspirer le supernatant et répéter ce lavage avec le M9, trois fois. Après le lavage, déplacez la pastille d’œuf dans un tube frais de 15 millilitres contenant environ neuf millilitres de tampon M9.Synchronisez les vers fraîchement éclos en les nutant à 20 degrés Celsius pendant 16 à 48 heures. Après avoir fait tourner ces tubes à 6 180 g pendant 1,5 minute, ez les animaux synchronisés L-1 sur une pelouse fraîchement ensemencée d’OP50 sur des plaques NGM individuelles. Gardez les plaques à 20 degrés Celsius jusqu’à ce que les animaux atteignent le stade larvaire L-4 après environ 42 heures.À l’heure actuelle, utilisez une pioche au platine pour déplacer les larves de L4 vers des plaques de MNM ensemencées OP50 contenant 0,5 milligramme par millilitre de FUdR pour empêcher la progéniture de produire. Hydratez la cartouche du capteur en ajoutant 200 microlitres d’eau distillée à chaque puits de la plaque, en veillant à ce que les sondes du capteur soient submergées. Conserver les assiettes toute la nuit à température ambiante.Éteignez l’élément chauffant à l’intérieur de l’interface du respiromètre. Le stockage de la machine à l’intérieur d’un incubateur de 15 degrés Celsius abaisse la température centrale à l’intérieur de la machine et empêche les animaux de surchauffer pendant l’essai. Après l’incubation pendant la nuit, pipette et jeter l’eau distillée utilisée pour hydrater les sondes capteur, et le remplacer par 200 microlitres de la solution calibrant dans chaque puits.Diluer la solution de stock FCCP à 100 micromolar FCCP dans de l’eau distillée. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de la solution diluée au port d’injection A dans la cartouche du capteur. Ajouter 22 microlitres d’azides de sodium de 400 millimlaires au port d’injection B de la cartouche du capteur.Maintenant, allumez le respiromètre. Sur l’écran d’accueil, sélectionnez démarrer et les pages de modèle s’afficheront. Sur la page des modèles, sélectionnez blank » ou un modèle précédemment conçu.La page groupes s’affiche. Sur la page groupes, sélectionnez les puits A et H comme puits d’arrière-plan et assignez les six puits restants en groupes appropriés selon le plan expérimental. Accédez à la page du protocole en cliquant sur la flèche en bas à droite, et assurez-vous que l’équilibre, basal et injections un et deux boutons sont sélectionnés.Ajustez le nombre de lectures de l’OCR basal ainsi que l’OCR maximum et l’OCR non mitochondrial. Sélectionnez la flèche dans le coin inférieur droit. Une invite à charger la plaque de cartouche du capteur apparaîtra.Assurez-vous que la plaque de cartouche du capteur est chargée dans la bonne orientation, en suivant les instructions sur l’écran d’invite de rappel. Le respirameter va maintenant équilibrer la cartouche. Ajouter 200 microlitres de tampon M9 dans chacun des huit puits et réservoirs environnants de la plaque cellulaire.Cueillez environ 100 vers de chaque souche sur des plaques de NGM non enseillées et laissez reposer pendant deux à trois minutes. Ensuite, mouillez l’extrémité de la pioche platine avec le tampon M9 et choisissez des animaux synchronisés de 20 âges dans les puits B à G, laissant les puits de fond A et H vides. Maintenant, cliquez sur OK sur le logiciel de respiromètre pour éjecter la plaque contenant tampon d’étalonnage.Retirez la plaque du respiromètre en laissant la cartouche du capteur à l’intérieur de l’instrument. Remplacer la plaque calibrée par la plaque contenant les animaux. Chargez les plaques et fermez la porte en frappant continuer et permettre à l’essai de courir.Une fois l’analyse terminée, suivez les invites sur l’écran pour enlever la plaque cellulaire et la cartouche du capteur. Insérez un lecteur flash dans le port USB pour enregistrer le format de guerre des données en cours d’exécuter. Retirez la cartouche du capteur et laissez les animaux s’installer au fond des puits pendant environ deux minutes.Placez les plaques cellulaires sous un microscope à disséquer stéréo et comptez le nombre d’animaux par puits. Ouvrez le logiciel d’analyse, suivi de l’onglet normalisation, pour normaliser les taux de consommation d’oxygène au nombre d’animaux. Appliquez les niveaux appropriés pour les différents groupes sous l’onglet modifier et exportez le fichier sous forme de fichier prisme pour une analyse plus approfondie.La moyenne des cinq premières mesures est l’OCR basal. La moyenne des cinq mesures après l’ajout de FCCP est l’OCR maximal. Enfin, la moyenne des cinq dernières mesures après l’ajout d’azide de sodium est le taux de respiration non mitochondriale.Puisque la dysrégulation de calcium peut avoir comme conséquence la fonction mitochondrique altérée, ocr dans les mutants sel-12 et les animaux sauvages de type ont été mesurés pour examiner l’effet des mutations sel-12 sur la fonction mitochondrique et la santé. Les animaux de type sauvage présentaient constamment des taux basaux d’OCR inférieurs à cinq picomoles par minute, par ver. Tandis que les trois souches des mutants sel-12 ont montré l’OCR sensiblement élevé, d’approximativement sept picomoles par minute, par ver.Lors de l’ajout de FCCP, il y avait une augmentation de l’OCR de type sauvage, ainsi que sel-12 mutants, comme prévu. Les animaux de type sauvage présentaient un taux maximum d’OCR d’environ sept picomoles par minute, par ver. Tandis que les mutants sel-12 ont eu ocr d’approximativement 10 picomoles par minute, par ver.Utilisez des animaux vivants, bien nourris et asynchronisés dans cet essai, et évitez le transfert d’œufs ou de carcasses dans des puits d’analyse. De plus, la température interne de l’instrument ne doit pas dépasser 25 degrés Celsius. L’eau de Javel, le FCCP, le FUdR et l’azide de sodium sont toxiques.Par conséquent, il faut prendre soin de porter des gants de protection pendant la préparation des solutions de stock et le chargement des médicaments.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

L&#39;isolement et la In vitro Activation des Caenorhabditis elegans Sperme

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Recherche

Biologie

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solide plaque à base de restriction alimentaire Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse de microscopie du début de l&#39;embryogenèse dans les Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

De base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Méthodes: Synchronisation et d&#39;observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Extraction de prostaglandine et de l&#39;analyse en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Mesure de la dégradation de l&#39;ARNm Tarifs en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilisation<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Les souches

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Rongeur de travail Modèle de coeur pour l&#39;étude de la performance myocardique et la consommation d&#39;oxygène

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

la culture de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; En trois dimensions dans le laboratoire

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantification du déclin protéostatique spécifique aux tissus chez Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Évaluation des taux de synthèse des protéines de novo à Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...