Name: measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Die Autoren möchten Dr. Kevin Bittman für seine Führung bei der Festlegung der Seepferdchen XFp im Labor zu bestätigen. National Institutes of Health zu gewähren, dass GM088213 diese Arbeit unterstützt.

Hinweis: Abbildung 2 bietet einen schematischen Überblick über das vollständige Protokoll.
1. Wachstum und Synchronisation von Nematoden Bevölkerung9,10
<ol><li>L4-Larven von gewünschten genetischen Hintergründen zu übertragen (z. B. N2 [Wildtyp] und Sel-12 Tiere) auf Nematoden Medien (NGM) Wachstumsfugen (Rezept siehe Tabelle 1 ) mit einem Rasen von Escherichia coli (OP5...

<ol>
	<li>Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+19.">Ch. 19.</a> Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).</li><li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+and+endoplasmic+reticulum+calcium+homeostasis+and+cell+death.">Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death.</a> Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).</li><li>Sarasija, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+mutations+deregulate+mitochondrial+Ca(2+)+homeostasis+and+metabolic+activity+causing+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Luz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Morphology+and+Fundamental+Parameters+of+the+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Are+Altered+in+Caenorhabditis+elegans+Strains+Deficient+in+Mitochondrial+Dynamics+and+Homeostasis+Processes.">Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes.</a> PLoS One. 10, e0130940 (2015).</li><li>Ryu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urolithin+A+induces+mitophagy+and+prolongs+lifespan+in+C.+elegans+and+increases+muscle+function+in+rodents.">Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents.</a> Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).</li><li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).</li><li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress.">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).</li><li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans.">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Structure+in+the+Body+Wall+Muscle+of+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ROS+in+Caenorhabditis+elegans+Using+a+Reduced+Form+of+Fluorescein.">Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).</li><li>Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes.">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).</li><li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones.">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li><li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12,+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer's+disease+gene.">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li><li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer's+disease.">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li><li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mitochondrial+Ca2++in+the+regulation+of+cellular+energetics.">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans.">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li></ol>

Mitochondriale Atmung ist eine aufschlussreiche Indikator für die Funktion der Mitochondrien; Daher ist es sehr wertvoll, in der Lage, den Sauerstoff-Verbrauch in einem biologischen System, ob in vitro oder in vivo zu messen. Respirometers spüren Sauerstoffgehalt mit Porphyrin-basierte Leuchtstoffe, die durch Sauerstoff oder über amperometrischen Sauerstoffsensoren, die auf die Erzeugung von einer elektrischen aktuelle Proportional zur Sauerstoffdruck gestillt bekommen. Clark-Elektrode fällt in diese Kategorie und wu...

Adenosintriphosphat (ATP), die Hauptquelle der Zellenergie, wird durch Enzyme in der Elektronentransport-Kette (etc.) befindet sich in der inneren mitochondrialen Membran in den Mitochondrien produziert. Pyruvat, eine wichtige Metaboliten genutzt für mitochondriale ATP-Produktion, wird in der mitochondrialen Matrix importiert es decarboxyliert ist, Acetyl Coenzym A (CoA) zu produzieren. Acetyl-CoA tritt anschließend der Zitronensäure-Zyklus, was bei der Erzeugung von Nicotinamid Adenin Dinucleotide (NADH), eine wichtige Elektron Trägermolekül. Da Elektronen von NADH zu Sauerstoff über die usw. übergeben werden, aufbauen Protonen in die mitochondriale Intermembran Raum, die Ergebnisse in der Generation eines elektrochemischen Gradienten durch die Membran. Diese Protonen fließt dann aus dem Intermembran Raum in diesem elektrochemischen Gradienten zurück in der mitochondrialen Matrix durch die Proton-Pore des ATP-Synthase, fahren die Rotation und die Synthese von ATP1 (Abbildung 1).
Mitochondriale Funktion beschränkt sich nicht nur zur Energiegewinnung sondern ist auch entscheidend für die Kalzium-Homöostase, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) aufräumen und Apoptose, kritisch Positionierung ihrer Funktion im organismal Gesundheit2. Mitochondriale Funktion kann mit einer Vielzahl von Tests, einschließlich aber nicht beschränkt auf Analysen, die mitochondriale Membranpotential messen, ATP und ROS Ebenen und mitochondriale Kalzium-Konzentrationen bewertet werden. Jedoch diese Assays zur Verfügung stellen einer Momentaufnahme der mitochondrialen Funktion und daher möglicherweise nicht bietet einen umfassenden Überblick der mitochondrialen Gesundheit. Da Sauerstoff-Verbrauch bei der ATP-Generierung auf eine Vielzahl von sequentiellen Reaktionen angewiesen ist, dient es als eine überlegene Indikator für die Funktion der Mitochondrien. Interessanterweise sind Variationen in Sauerstoff-Verbrauch durch mitochondriale Dysfunktion3,4,5beobachtet worden.
Sauerstoff-Verbrauch (OCR) von lebenden Proben gemessen werden, mit Techniken, die im großen und ganzen in zwei Gruppen eingeteilt werden können: amperometrischen Sauerstoffsensoren und Porphyrin-basierte Leuchtstoffe, die durch Sauerstoff6gestillt werden können. Amperometrischen Sauerstoffsensoren sind weitgehend nach Maß OCR in kultivierten Zellen, Geweben, und Modellsysteme, wie C. Elegansbenutzt worden. Porphyrin-basierte Phosphore mit Respirometers besitzen jedoch folgende Vorteile: (1) sie ermöglichen eine Gegenüberstellung zweier Proben in dreifacher Ausfertigung, (2) sie benötigen kleinere Stichprobengröße (z. B. 20 Würmer pro Bohrloch im Vergleich zu ~ 2, 000−5, 000 Würmern, in der Zeiten während der experimentellen ausführen, wodurch die Notwendigkeit für manuelle Anwendung gewünscht Kammer)7, und (3) der Respirometer kann programmiert werden, dazu vier verschiedene zusammengesetzte Injektionen an.
In diesem Protokoll sind Schritte im Umgang mit einem Porphyrin-basierte Sauerstoff-Sensor Respirometer Maßnahme OCR in live, intakte C. Elegans beschrieben. Zwar gibt es ein schriftliches Protokoll für die Verwendung von großformatigen, Hochdurchsatz Respirometer8, wurde dieses Protokoll für die Verwendung mit einem mehr Budget-freundlich, zugänglich und kleineren Maßstab-Instrument angepasst. Dieses Protokoll eignet sich besonders für die Beurteilung des Unterschied in OCR zwischen zwei Stämmen, wo Hochdurchsatz-Screening ist nicht erforderlich und seine Verwendung wäre übertrieben.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm, 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Kord-Valmark Labware Products</td>
			<td>2900, 2901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>6285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 &#215; 22 mm coverslip</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto yeast extract</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>212705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C314-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (dH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C987Y85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Krackeler Scientific</td>
			<td>6-72050-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4&#183;7H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans

Optimale Funktion der Mitochondrien ist wichtig für gesunde Zellaktivität, besonders in Zellen mit hohem Energiebedarf wie in das Nervensystem und Muskel. Einklang mit diesem, wurde mitochondriale Dysfunktion assoziiert mit einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen und Altern im Allgemeinen. Caenorhabditis Elegans wurden mächtige Modellsystem für die Aufklärung der vielen Feinheiten der mitochondrialen Funktion. Mitochondriale Atmung ist ein starker Indikator für die Funktion der Mitochondrien und neu entwickelte Respirometers bieten eine State-of-the-Art Plattform, um die Atmung in den Zellen zu messen. In diesem Protokoll bieten wir eine Technik, um live, intakte C. Eleganszu analysieren. Dieses Protokoll umfasst einen Zeitraum von ~ 7 Tage und umfasst Schritte für (1) wachsen und Synchronisation von C. Elegans (2) Vorbereitung von Verbindungen injiziert werden und Hydratation der Sonden, be- und Patrone Gleichgewichtherstellung Medikament (3), (4) Vorbereitung der Wurm assay Platte und Assay laufen und (5) nach dem Experiment Datenanalyse.

Mit dem Protokoll beschriebenen, OCR Wildtyp Tiere und drei verschiedenen Sel-12 mutierte Stämme wurden ermittelt. SEL-12 kodiert das C. Elegans Ortholog Presenilin17. Mutationen im menschlichen Presenilin sind die häufigste genetische Aberration, verbunden mit der Entwicklung der familiären Alzheimer-Krankheit18. Unsere Studien haben erhöhte mitochondriale Kalziumspiegel Sel / 12 mutierte Tieren im Ve...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Messung von Sauerstoff Verbrauchsmengen in intakten Caenorhabditis elegans

Mitochondriale Atmung ist entscheidend für das organismal überleben; Sauerstoff-Verbrauch ist daher ein hervorragender Indikator für mitochondriale Gesundheit. In diesem Protokoll wir beschreiben die Verwendung von handelsüblichen Respirometer basale messen und maximale Sauerstoff-Verbrauch im Leben, intakt und frei bewegliche Caenorhabditis Elegans.

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Mitochondriale Funktion ist entscheidend für die zelluläre Homöostase und Sauerstoffverbrauch Rate ist ein entscheidender Indikator für mitochondriale Gesundheit. Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zur Analyse der Sauerstoffverbrauchsrate in C.elegans. Dieses Protokoll nutzt livee, mobile C.elegans, die eine rechtliche Messung der mitochondrialen Funktion bieten.Erhöhung der Notwendigkeit, Mitochondrien zu isolieren, ein Schritt, der potenziell seine Integrität beeinträchtigen könnte. Um zu beginnen, übertragen L4 Larven der gewünschten genetischen Hintergründe auf einen frisch gesäten Rasen von Escherichia coli auf Nematoden-Wachstumsmedien oder NGM-Platten. Verwenden Sie mindestens zwei 100 mm oder drei 60 mm Platten für jede Dehnung.Die Würmer drei bis vier Tage lang bei der entsprechenden Wachstumstemperatur bebrüten, oder bis die Platten mit einer großen Anzahl von Eiern und Gravidwürmern konzentriert sind. Waschen Sie die Eier und Würmer von den Tellern mit etwa 6 Milliliter M9 Puffer pro 100 Millimeter Platte Nematoden. Mit Glasweidenpipetten die Eier und Würmer in einzelne 15 Milliliter Zentrifugenröhrchen für jeden Stamm übertragen.Spin Thesen Röhren nach unten für drei Minuten bei 6, 180 g. Nach der Zentrifugation, aspirieren Sie den M9-Puffer, der nur das Tier und Eipellet behält. Fügen Sie drei bis vier Milliliter Bleichlösung zu jedem Rohr und intermittierend Wirbel für sechs Minuten.Fügen Sie dann den M9-Puffer hinzu, um jedes Rohr zu füllen, und drehen Sie es eine Minute lang bei 6, 180 g. Den Überstand ansaugen und diese Wäsche dreimal mit dem M9 wiederholen. Nach dem Waschen das Eipellet in ein frisches 15-Milliliter-Rohr mit etwa neun MilliliterM9-Puffer bewegen.Synchronisieren Sie die frisch geschlüpften Würmer, indem Sie 16 bis 48 Stunden bei 20 Grad Celsius nisieren. Nachdem Sie diese Rohre 1,5 Minuten lang bei 6, 180 g nach unten gesponnen haben, legen Sie die synchronisierten L-1-Tiere auf einen frisch gesäten Rasen von OP50 auf einzelnen NGM-Platten. Halten Sie die Platten bei 20 Grad Celsius, bis die Tiere nach ca. 42 Stunden das L-4 Larvenstadium erreichen.Zu diesem Zeitpunkt verwenden Sie einen Platin-Pick, um die L4-Larven auf OP50-gesäte NGM-Platten mit 0,5 Milligramm pro Milliliter FUdR zu bewegen, um die Produktion von Nachkommen zu verhindern. Hydratisieren Sie die Sensorpatrone, indem Sie jedem Brunnen auf der Platte 200 Mikroliter destilliertes Wasser hinzufügen, um sicherzustellen, dass die Sensorsonden untergetaucht sind. Lagern Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur.Schalten Sie das Heizelement innerhalb der Respirometer-Schnittstelle aus. Die Lagerung der Maschine in einem 15 Grad Celsius Inkubator senkt die Kerntemperatur innerhalb der Maschine und verhindert, dass die Tiere während des Assays überhitzen. Nach der nächtlichen Inkubation das destillierte Wasser, das zur Hydratisierung der Sensorsonden verwendet wird, ausderapipetten und entsorgen und in jedem Brunnen durch 200 Mikroliter der Kalibrantlösung ersetzen.Verdünnen Sie die FCCP-Lagerlösung auf 100 Mikromolar FCCP in destilliertem Wasser. Fügen Sie dann 20 Mikroliter der verdünnten Lösung in den Injektionsanschluss A in die Sensorpatrone ein. Fügen Sie 22 Mikroliter 400 Millimolar-Natriumaziden zum Injektionsanschluss B der Sensorpatrone hinzu.Schalten Sie nun das Respirometer ein. Wählen Sie auf dem Startbildschirm Start aus, und die Vorlagenseiten werden angezeigt. Wählen Sie auf der Vorlagenseite "blank" oder eine zuvor entworfene Vorlage aus.Die Gruppenseite wird angezeigt. Wählen Sie auf der Gruppenseite die Bohrungen A und H als Hintergrundbrunnen aus und ordnen die restlichen sechs Brunnen entsprechend dem Versuchsplan entsprechenden Gruppen zu. Greifen Sie auf die Protokollseite zu, indem Sie auf den Pfeil unten rechts klicken, und stellen Sie sicher, dass die Schaltflächen "Gleichgewicht", "Basal" und "Injektionen" eins und zwei ausgewählt sind.Passen Sie die Anzahl der Messwerte von Basal-OCR sowie maximale OCR und nicht-mitochondriale OCR an. Wählen Sie den Pfeil in der unteren rechten Ecke aus. Es wird eine Aufforderung zum Laden der Sensorpatronenplatte angezeigt.Stellen Sie sicher, dass die Sensorkassetteinplatte in der richtigen Ausrichtung geladen ist, und folgen Sie den Anweisungen auf dem Mahnaufforderungsbildschirm. Das Respirameter gleicht nun die Patrone aus. Fügen Sie 200 Mikroliter M9-Puffer in jeden der acht Brunnen und umgebenden Reservoirs der Zellplatte hinzu.Wählen Sie etwa 100 Würmer von jeder Sorte auf ungesättigte NGM-Platten und lassen Sie sie für zwei bis drei Minuten ruhen. Dann das Ende des Platin-Pickmitals mit M9-Puffer nass machen und 20 alterssynchronisierte Tiere in Brunnen B bis G pflücken, wobei die Hintergrundbrunnen A und H leer bleiben. Klicken Sie nun auf OK in der Respirometer-Software, um die Platte mit dem Kalibrierpuffer auszuwerfen.Entfernen Sie die Platte aus dem Respirometer und lassen Sie die Sensorpatrone im Gerät zurück. Ersetzen Sie die Kalibrierplatte durch die Platte, die die Tiere enthält. Laden Sie Platten und schließen Sie die Tür durch Drücken weiter und lassen Sie den Test laufen.Sobald der Testlauf abgeschlossen ist, folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Zellplatte und die Sensorpatrone zu entfernen. Legen Sie ein Flash-Laufwerk in den USB-Anschluss ein, um das Run Data War-Format zu speichern. Entfernen Sie die Sensorpatrone und lassen Sie die Tiere für etwa zwei Minuten an der Unterseite der Brunnen absetzen.Legen Sie die Zellplatten unter ein Stereo-Sezieren-Mikroskop und zählen Sie die Anzahl der Tiere pro Brunnen. Öffnen Sie die Analysesoftware, gefolgt von der Registerkarte Normalisierung, um die Sauerstoffverbrauchsraten auf die Anzahl der Tiere zu normalisieren. Wenden Sie die entsprechenden Ebenen für die verschiedenen Gruppen unter der Registerkarte "Ändern" an, und exportieren Sie die Datei als Prismadatei zur weiteren Analyse.Der Durchschnitt der ersten fünf Messungen ist der basale OCR. Der Durchschnitt der fünf Messungen nach FCCP-Zugabe ist der maximale OCR. Schließlich ist der Durchschnitt der letzten fünf Messungen nach Natriumazidzugabe die nicht-mitochondriale Atmungsrate.Da die Kalziumdysregulation zu einer veränderten mitochondrialen Funktion führen kann, wurden OCR sowohl bei den Sel-12-Mutanten als auch bei Wildtieren gemessen, um die Wirkung von Sel-12-Mutationen auf die mitochondriale Funktion und Gesundheit zu untersuchen. Wildtiere zeigten durchweg basale OCR-Raten unter fünf Picomolen pro Minute und Wurm. Während alle drei Stämme von Sel-12-Mutanten signifikant erhöhte OCR zeigten, von etwa sieben Picomolen pro Minute, pro Wurm.Nach der Zugabe von FCCP gab es eine Zunahme der OCR von wildartigem Typ, sowie sel-12 Mutanten, wie erwartet. Wildtiere wiesen eine maximale OCR von etwa sieben Picomolen pro Minute und Wurm auf. Während sel-12 Mutanten OCR von etwa 10 Picomole pro Minute, pro Wurm hatten.Verwenden Sie lebende, gut gefütterte und synchronisierte Tiere in diesem Test, und vermeiden Sie die Übertragung von Eiern oder Kadaver nasiniert. Darüber hinaus sollte die Innentemperatur des Instruments 25 Grad Celsius nicht überschreiten. Bleichmittel, FCCP, FUdR und Natriumazid sind giftig.Daher sollte darauf geachtet werden, Schutzhandschuhe bei der Vorbereitung von Lagerlösungen und der Drogenbeladung zu tragen.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation und In-vitro- Aktivierung von Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Forschung

Biologie

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solide Plate-basierte diätetische Einschränkung in Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraktion und Analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Die Messung der mRNA-Abbau Preise in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Verwenden<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Die Stämme

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Nagetier Arbeits Herz Modell für die Untersuchung der myokardialen Leistung und Sauerstoffverbrauch

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

der Anbau von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In drei Dimensionen im Labor

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifizierung des gewebespezifischen proteostatischen Rückgangs bei Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Bewertung der de novo Proteinsyntheseraten bei Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...