Name: measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

המחברים רוצה להכיר את ד ר קווין Bittman להדרכה שלו בהקמת את XFp סוסון ים במעבדה. מכוני הבריאות הלאומיים הענק ש-gm088213 נתמך עבודה זו.

הערה: איור 2 מספק מבט סכמטי של פרוטוקול מלא.
1. צמיחה וסינכרון של האוכלוסייה נמטודות9,10
<ol><li>העברת L4 הזחלים של רקע גנטי הרצוי (למשל, N2 [wild type] ובעלי sel-12) על גבי נמטודות מדיה (NGM) לוחיות גדילה (ראה טבלה 1 למתכון) טרי נזרע עם מד...

<ol>
	<li>Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+19.">Ch. 19.</a> Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).</li><li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+and+endoplasmic+reticulum+calcium+homeostasis+and+cell+death.">Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death.</a> Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).</li><li>Sarasija, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+mutations+deregulate+mitochondrial+Ca(2+)+homeostasis+and+metabolic+activity+causing+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Luz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Morphology+and+Fundamental+Parameters+of+the+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Are+Altered+in+Caenorhabditis+elegans+Strains+Deficient+in+Mitochondrial+Dynamics+and+Homeostasis+Processes.">Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes.</a> PLoS One. 10, e0130940 (2015).</li><li>Ryu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urolithin+A+induces+mitophagy+and+prolongs+lifespan+in+C.+elegans+and+increases+muscle+function+in+rodents.">Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents.</a> Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).</li><li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).</li><li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress.">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).</li><li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans.">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Structure+in+the+Body+Wall+Muscle+of+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ROS+in+Caenorhabditis+elegans+Using+a+Reduced+Form+of+Fluorescein.">Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).</li><li>Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes.">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).</li><li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones.">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li><li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12,+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer's+disease+gene.">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li><li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer's+disease.">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li><li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mitochondrial+Ca2++in+the+regulation+of+cellular+energetics.">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans.">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li></ol>

נשימה מיטוכונדריאלי הוא מחוון תובנה של פונקציה מיטוכונדריאלי; לכן, היכולת למדוד את שיעור צריכת החמצן במערכת הביולוגית, בין אם במבחנה או ויוו הוא חשוב מאוד. Respirometers חש רמות החמצן באמצעות חומר זרחני מבוססי פורפירין זה לקבל מתרצה באמצעות חמצן או באמצעות חיישני חמצן amperometric המסתמכים על הדור של...

אדנוזין טריפוספט (ATP), המקור העיקרי של אנרגיה תאית, מיוצר בתוך המיטוכונדריה על ידי אנזימים בשרשרת האלקטרונים תחבורה (וכו ') הממוקם בתוך הקרומית מיטוכונדריאלי הפנימי. פירובט, מטבוליט מפתח מנוצל לייצור ATP מיטוכונדריאלי, מיובא לתוך מאטריקס מיטוכונדריאלי איפה decarboxylated לייצר אצטיל קואנזים A (CoA). לאחר מכן, אצטיל CoA מזין את מעגל קרבס וכתוצאה מכך הדור של nicotinamide אדנין dinucleotide (NADH), מולקולה נשא אלקטרונים מפתח. כמו אלקטרונים NADH מועברים למנהל חמצן דרך ועוד, פרוטונים לבנות בחלל intermembrane מיטוכונדריאלי, דבר המתבטא הדור הצבע אלקטרוכימי על פני הקרום. אלה פרוטונים יזרום אז מן המרחב intermembrane מעבר הדרגתי אלקטרוכימי הזה בחזרה לתוך המטריקס מיטוכונדריאלי דרך הנקבובית פרוטון של ATP סינתאז, נהיגה הסיבוב שלה, הסינתזה של ATP1 (איור 1).
הפונקציה מיטוכונדריאלי אינה מוגבלת ייצור אנרגיה, אבל הוא גם מכריע הומאוסטזיס סידן, מינים חמצן תגובתי (ROS) ניקוי של אפופטוזיס, אנושות מיצוב תפקידם בריאות organismal2. הפונקציה מיטוכונדריאלי יכול להיות מוערך באמצעות מגוון של מבחני, כולל אך לא מוגבל ניתוחים המודדים מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית רמות ATP ו- ROS, ריכוזי סידן מיטוכונדריאלי. עם זאת, אלה מבחני לספק תמונה אחת של פונקציה מיטוכונדריאלי, ולכן אולי לא מספקת תצוגה מקיפה של בריאות מיטוכונדריאלי. מאז צריכת חמצן בעת יצירת ATP הוא מסתמך על מספר עצום של תגובות רציפים, היא מגישה כסמן מעולה של פונקציה מיטוכונדריאלי. מעניין, וריאציות שיעורי צריכת חמצן נצפו כתוצאה בתפקוד מיטוכונדריאלי3,4,5.
שיעורי צריכת חמצן (OCR) של החיים דוגמאות ניתן למדוד באמצעות טכניקות ניתן לחלק לשתי קבוצות: amperometric חיישני חמצן, חומר זרחני מבוססי פורפירין זה יכול לכלותה חמצן6. חיישני חמצן Amperometric נעשה שימוש נרחב מודדים OCR ב בתרבית תאים, רקמות, וב -דגם מערכות, כגון C. elegans. עם זאת, חומר זרחני מבוססי פורפירין המכיל respirometers יש את היתרונות הבאים: (1) שהם מאפשרים השוואה לצד השני של שני מדגמים שהפקידים, (2) הם דורשים גודל מדגם קטן יותר (למשל, תולעים 20 לכל טוב לעומת ~ 2, 000−5, 000 תולעים קאמרית)7, ו- (3) ניתן לתכנת את respirometer לעשות ארבע זריקות מורכבים שונים-רצוי פעמים לאורך כל רץ ניסיוני, ומבטל את הצורך עבור יישום ידני.
פרוטוקול זה, הם שלבים המעורבים בשימוש של פורפירין מבוססות חיישן חמצן respirometer מודדים OCR ב- חיים, שלמים C. elegans מתואר. אמנם יש פרוטוקול בכתב לשימוש בפורמט גדול, תפוקה גבוהה respirometer8, פרוטוקול זה כבר מותאם לשימוש עם מכשיר ידידותי, נגיש וקטן בהיקף תקציב נוסף. פרוטוקול זה שימושי במיוחד להערכת ההבדל ב- OCR בין שני זנים, שבו לא נדרש ההקרנה תפוקה גבוהה, השימוש בו יהיה מוגזם.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm, 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Kord-Valmark Labware Products</td>
			<td>2900, 2901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>6285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 &#215; 22 mm coverslip</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto yeast extract</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>212705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C314-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (dH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C987Y85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Krackeler Scientific</td>
			<td>6-72050-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4&#183;7H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans

הפונקציה מיטוכונדריאלי האופטימלי הוא קריטי עבור פעילות תאית בריאה, במיוחד בתאי בעלי אנרגיה גבוהה דרישות כמו אלה במערכת העצבים, שרירים. בקנה אחד עם זה, תפקוד מיטוכונדריאלי היה קשור עם מספר עצום של מחלות ניווניות והתיישנות באופן כללי. Caenorhabditis elegans כבר מערכת מודל רב עוצמה עבור שחקרתי המורכבות הרבה של הפונקציה מיטוכונדריאלי. נשימה מיטוכונדריאלי הוא סימן חזק של פונקציה מיטוכונדריאלי, respirometers פיתחה לאחרונה מציעים פלטפורמה המדינה-of-the-art כדי למדוד את הנשימה בתאים. ב פרוטוקול זה, אנו מספקים שיטה לנתח חיים, שלמים C. elegans. פרוטוקול זה משתרע על פני תקופה של ~ 7 ימים, כולל שלבי (1) גדל וסינכרון של C. elegans, (2) הכנת תרכובות כדי להיות מוזרק, הידרציה של הגששים, equilibration וטעינה של מחסנית סמים (3), (4) הכנת assay תולעת צלחת assay לרוץ ו ניתוח נתונים לאחר הניסוי (5).

באמצעות הפרוטוקול כפי שיתואר בהמשך, OCR של חיות פראי סוג ו מוטנטים שונים sel-12 שלושה זנים היו נחושים. sel-12 מקודד את ortholog C. elegans presenilin17. מוטציות בגן presenilin האנושי הם המפגע גנטי הנפוצים ביותר הקשורים להתפתחות מחלת אלצהיימר משפחתית18. המחקר?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

נשימה מיטוכונדריאלי חיוני להישרדות organismal; לכן, קצב צריכת החמצן היא מדד מצוין של בריאות מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש respirometer זמינים מסחרית כדי למדוד הבזליים, שיעורי צריכת חמצן מירבית חיים, שלמים, ולא תאי בחופשיות Caenorhabditis elegans.

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

תפקוד המיטוכונדריאלי הוא קריטי הונוסטזיס הסלולר קצב צריכת החמצן הוא אינדיקטור מכריע של בריאות המיטוכונדריה. פרוטוקול זה מספק הוראות מפורטות לניתוח קצב צריכת החמצן ב- C.elegans. פרוטוקול זה עושה שימוש חי, C.elegans נייד מתן מדידה משפטית של פונקציה המיטוכונדרית.לרומם את הצורך לבודד מיטוכונדריה, צעד שעלול להשפיע על שלמותה. כדי להתחיל, להעביר זחלים L4 של רקעים גנטיים הרצויים על מדשאה זרע טרי של Escherichia coli על מדיה צמיחה nematode או צלחות NGM. השתמש לפחות שתי צלחות 100 מ"מ או שלוש 60 מ"מ עבור כל זן.הדגירה את התולעים בטמפרטורת הצמיחה המתאימה במשך שלושה עד ארבעה ימים, או עד צלחות מרוכזים עם מספר רב של ביצים ותולעים gravid. לשטוף את הביצים והתולעים את הצלחות באמצעות כ 6 מיליליטר של חיץ M9 לכל צלחת 100 מילימטר של nematodes. באמצעות פיפטות מרעה זכוכית, להעביר את הביצים והתולעים לתוך צינורות צנטריפוגה בודדים 15 מיליליטר עבור כל זן.לסובב צינורות תזות למטה במשך שלוש דקות ב 6, 180 גרם. לאחר צנטריפוגה, שאף את חיץ M9 שמירה רק את החיה ואת גלולת הביצה. מוסיפים שלושה עד ארבעה מיליליטר של תותב אקונומיקה לכל צינור ומערבולת לסירוגין במשך שש דקות.לאחר מכן, להוסיף מאגר M9 כדי למלא כל צינור ולסובב ב 6, 180 גרם לדקה אחת. שאפו את העל-טבעי וחזרו על שטיפה זו עם ה-M9, שלוש פעמים. לאחר הכביסה, להעביר את גלולת הביצה לצינור טרי 15 מיליליטר המכיל כתשעה מיליליטר של חיץ M9.סנכרנו את התולעים הטריות על ידי אגוזים ב-20 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 48 שעות. לאחר סיבוב צינורות אלה למטה ב 6, 180 גרם במשך 1.5 דקות, לשים את בעלי החיים מסונכרנים L-1 למטה על מדשאה זרע טרי של OP50 על לוחות NGM בודדים. שמור את הצלחות ב 20 מעלות צלזיוס עד החיות להגיע לשלב הזחל L-4 לאחר כ 42 שעות.בשלב זה, השתמש בבחירה פלטינה כדי להעביר את הזחלים L4 ל- OP50 צלחות NGM זרעים המכילים 0.5 מיליגרם למיליליטר של FUdR כדי למנוע את ייצור צאצאים. לחות מחסנית החיישן על ידי הוספת 200 microliters של מים מזוקקים לכל באר על הצלחת, להבטיח כי בדיקות החיישן שקועים. אחסן את הצלחות לילה בטמפרטורת החדר.כבה את גוף החימום בממשק מד הנשימה. אחסון המכונה בתוך חממה של 15 מעלות צלזיוס מוריד את טמפרטורת הליבה בתוך המכונה ומונע מבעלי החיים התחממות יתר במהלך ההקפאה. לאחר הדגירה הלילית, פיפטה החוצה להשליך את המים מזוקקים המשמשים לחות בדיקות החיישן, ולהחליף אותו עם 200 microliters של הפתרון כיול בכל באר.לדלל את פתרון המניות FCCP ל 100 FCCP מיקרומולר במים מזוקקים. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטרים של הפתרון המדולל ליציאת הזרקה A במחסנית החיישן. הוסף 22 מיקרוליטר של 400 מילימולאר נתרן אזידים ליציאת הזרקה B של מחסנית החיישן.עכשיו, תדליק את מד הנשימה. במסך הבית, בחר התחל ודפי התבנית יופיעו. בדף התבניות, בחר ריק" או תבנית שעוצבה בעבר.דף הקבוצות יופיע. בדף הקבוצות, בחר בארות A ו- H כ בארות הרקע, והקצה את שש הבארות הנותרות לקבוצות מתאימות בהתאם לתוכנית הניסוי. גש לדף הפרוטוקול על-ידי לחיצה על החץ בפינה השמאלית התחתונה, וודא שהלחצן 'שיווי משקל', 'בזל' ו'זריקות 1 ו-2' נבחר.התאימו את מספר הקריאות של זיהוי תווים אופטי (OCR) הבסיסי, כמו גם את מספר זיהוי התווים האופטי (OCR) המרבי ואת זיהוי התווים האופטי (OCR) שאינו מיטוכונדריאלי. בחר את החץ בפינה השמאלית התחתונה. תופיע בקשה לטעינת לוחית מחסנית החיישן.ודא כי לוחית מחסנית החיישן נטענת בכיוון הנכון, בהתאם להוראות במסך שורת התזכורת. ההפוגה עכשיו לצייד את המחסנית. הוסף 200 microliters של מאגר M9 לתוך כל אחת משמונה בארות המאגרים שמסביב של לוח התא.בחרו כ-100 תולעים מכל זן על לוחות NGM לא חתוך, ואפשרו לנוח במשך שתיים עד שלוש דקות. לאחר מכן, הרטיבו את קצה פיק הפלטינה עם חיץ M9 ובחרו בעלי חיים מסונכרנים בני 20 שנה לתוך בארות B עד G, והשאירו את בארות הרקע A ו- H ריקות. עכשיו, לחץ על אישור על תוכנת מד ההנשמה כדי להוציא את הלוח המכיל מאגר כיול.הסר את הלוחית מלחץ הנשימה והשאיר את מחסנית החיישן בתוך המכשיר. החלף את הצלחת הכיול עם הצלחת המכילה את בעלי החיים. לטעון צלחות ולסגור את הדלת על ידי להכות להמשיך ולאפשר את ההטעיה לרוץ.לאחר השלמת ההקרנה, בצע את ההנחיות על המסך כדי להסיר את לוחית התא ומחסנית החיישן. הכנס כונן הבזק ליציאת ה- USB כדי לשמור את תבנית הפעלת המלחמה בנתונים. מוציאים את מחסנית החיישנים ומאפשרים לבעלי החיים להתיישב בתחתית הבאר למשך כשתי דקות.מניחים את לוחות התאים תחת מיקרוסקופ ניתוח סטריאו ולספור את מספר בעלי החיים ל הבאר. פתח את תוכנת הניתוח, ואחריה את לשונית הנורמליזציה, כדי לנרמל את שיעורי צריכת החמצן למספר בעלי חיים. החל את הרמות המתאימות עבור הקבוצות השונות תחת הכרטיסיה שינוי, וייצא את הקובץ כקובץ פריזמה לניתוח נוסף.הממוצע של חמש המדידות הראשונות הוא זיהוי תווים אופטי (OCR) הבסיסי. הממוצע של חמש המדידות לאחר הוספת FCCP הוא זיהוי תווים אופטי (OCR) המקסימלי. לבסוף, הממוצע של חמש המדידות האחרונות לאחר תוספת נתרן אזיד הוא שיעור הנשימה הלא מיטוכונדריאלי.מאז dysregulation סידן יכול לגרום לתפקוד המיטוכונדריאלי השתנה, OCR הן במוטנטים sel-12 ובעלי חיים מסוג בר נמדדו כדי לבחון את ההשפעה של מוטציות sel-12 על תפקוד המיטוכונדריאלי ובריאות. בעלי חיים מסוג בר הראו באופן עקבי שיעורי זיהוי תווים אופטי (OCR) הבסיסיים מתחת לחמישה פיקומולים לדקה, לכל תולעת. בעוד כל שלושת הזנים של מוטציות סל-12 הראו OCR מוגבה באופן משמעותי, של כ 7 picomoles לדקה, לכל תולעת.עם התוספת של FCCP, חלה עלייה OCR של סוג פראי, כמו גם מוטציות סל-12, כצפוי. חיות בר הראו זיהוי תווים אופטי (OCR) מרבי של כ-7 פיקמולים לדקה, לכל תולעת. בעוד שלמוטנטים מס' 12 היה זיהוי תווים אופטי (OCR) של כ-10 פיקומולים לדקה, לכל תולעת.השתמשו בבעלי חיים חיים, ניזונים היטב ואסינכרוניים בהקשה זו, והימנעו מהעברת ביצים או פקות לתוך בארות אסי. יתר על כן, הטמפרטורה הפנימית של המכשיר לא יעלה על 25 מעלות צלזיוס. אקונומיקה, FCCP, FUdR ונתרן אזיד הם רעילים.לכן, יש לדאוג ללבוש כפפות מגן במהלך הכנת פתרונות מלאי וטעינת סמים.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

תוספת תזונתית של חומצות שומן רב בלתי רוויות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

מכרסם עבודת לב דגם לחקר ביצועי שריר לב ואת צריכת חמצן

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

טיפוח<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; ב בשלושה ממדים במעבדה

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

דוגמנות גיל הקשורים מחלות ניווניות בתוך האלאים

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...