Name: measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

저자 그의 실험실에서 해 마 XFp를 설정에 대 한 박사 케빈 Bittman 인정 하 고 싶습니다. 국립 보건원 부여 GM088213이이 작업을 지원 합니다.

참고: 그림 2 는 전체 프로토콜의 개요 개요를 제공합니다.
1. 성장과 선 충 인구9,10 의 동기화
<ol><li>원하는 유전 배경의 L4 애벌레를 전송 (예: N2 [야생 유형] 및 sel 12 동물) 갓 대장균 (OP50)11의 잔디와 시드 선 충 성장 미디어 (NGM) 접시 (제조 법에 대 한 표 1 참조)에. 두 개 ?...

<ol>
	<li>Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+19.">Ch. 19.</a> Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).</li><li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+and+endoplasmic+reticulum+calcium+homeostasis+and+cell+death.">Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death.</a> Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).</li><li>Sarasija, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+mutations+deregulate+mitochondrial+Ca(2+)+homeostasis+and+metabolic+activity+causing+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Luz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Morphology+and+Fundamental+Parameters+of+the+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Are+Altered+in+Caenorhabditis+elegans+Strains+Deficient+in+Mitochondrial+Dynamics+and+Homeostasis+Processes.">Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes.</a> PLoS One. 10, e0130940 (2015).</li><li>Ryu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urolithin+A+induces+mitophagy+and+prolongs+lifespan+in+C.+elegans+and+increases+muscle+function+in+rodents.">Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents.</a> Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).</li><li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).</li><li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress.">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).</li><li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans.">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Structure+in+the+Body+Wall+Muscle+of+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ROS+in+Caenorhabditis+elegans+Using+a+Reduced+Form+of+Fluorescein.">Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).</li><li>Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes.">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).</li><li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones.">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li><li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12,+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer's+disease+gene.">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li><li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer's+disease.">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li><li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mitochondrial+Ca2++in+the+regulation+of+cellular+energetics.">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans.">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li></ol>

미토 콘 드리 아 호흡은 통찰력 있는 미토 콘 드 리아 기능; 따라서, 생체 외에서 또는 vivo에서 생물 학적 시스템에 산소 소비 속도 측정할 수 있는 매우 귀중 한입니다. Respirometers 산소 또는 산소 압력 전기 전류 비례의 생성에 의존 하는 amperometric 산소 센서를 통해 침묵 얻을 포 르 피 린 기반 형광체를 사용 하 여 산소 레벨을 감지 한다. 클라크 전극 후자의 범주에 폭포와 C. 선 충에 호흡을 ...

아데노신 3 인산 염 (ATP), 세포 에너지의 주요 소스는 미토 콘 드리 아에 안 미토 콘 드리 아 막에 위치한 전자 전송 체인 (등)에서 효소에 의해 생산 됩니다. 어디 그것 decarboxylated 아 세 틸 보 효소 A (CoA)를 생산 하는 미토 콘 드리 아 모체로 pyruvate, 미토 콘 드리 아의 ATP 생산을 위해 활용 하는 주요 대사 산물 가져옵니다. 그 후, 아 세 틸 CoA 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH)는 주요 전자 캐리어 분자의 세대의 결과로 구 연산 산 성 주기를 입력 합니다. NADH에서 전자는 등을 통해 산소에 전달 됩니다, 양성자 전기 화학 기온 변화도의 세대에서 막에 걸쳐 결과 미토 콘 드 리아 intermembrane 공간에 구축. 이러한 양성자 것입니다 다음 회전 그리고 ATP1 (그림 1)의 합성 ATP synthase의 양성자 기 공 통해 미토 콘 드리 아 모체로 다시이 전기 화학 기온 변화도 걸쳐 intermembrane 공간에서 흐른다.
미토 콘 드 리아 기능 에너지 생산에 국한 되지 않습니다 하지만 칼슘 항상성, 반응성 산소 종 (선생님), 청소 및 apoptosis, organismal 건강2에 그들의 기능을 비판적으로 위치에 대 한 중요 한 또한 이다. 미토 콘 드 리아 기능 분석 실험를 포함 하 여 그 미토 콘 드리 아 막 잠재력 측정 분석, ATP 및 선생님 수준, 그리고 미토 콘 드리 아 칼슘 농도에 국한 되지 않는 다양 한을 사용 하 여 평가 될 수 있다. 그러나, 이러한 분석 미토 콘 드 리아 기능의 단일 스냅숏으로 제공 하 고 따라서 미토 콘 드리 아 건강에 대 한 포괄적인 보기를 제공 하지 않을 수 있습니다. ATP 생성 하는 동안 산소 소비 순차적 반응의 무수 한 의존 때문에, 그것은 미토 콘 드리 아 기능의 우수한 지표 역할. 흥미롭게도, 산소 소비 속도 있는 변이 결과로 미토 콘 드 리아 기능 장애3,,45관찰 되었습니다.
생활 샘플의 산소 소비 속도 (OCR) 기술을 광범위 하 게 두 그룹으로 분할 될 수 있다 사용 하 여 측정 될 수 있다: amperometric 산소 센서와 포 르 피 린 기반 형광체 산소6침묵 될 수 있습니다. Amperometric 산소 센서 측정 OCR 배양된 세포, 조직, 그리고 모델 시스템, C. 선 충등을 광범위 하 게 사용 되었습니다. 그러나, respirometers를 포함 하는 포 르 피 린 기반 형광체 다음과 같은 이점을: (1) 그들은 허용 3 중, 2 개의 샘플을 나란히 비교 (2) 그들은 작은 샘플 크기를 요구 (예를 들어, 잘 ~ 2, 000−5, 대 당 20 벌레 000 벌레는 상공 회의소)7, 그리고 (3)는 respirometer에서 4 개의 다른 복합 주사 할 프로그래밍 될 수 있다 수동 응용 프로그램에 대 한 필요성을 제거 실험 실행에 걸쳐 시간을 원하는.
이 프로토콜에는 포 르 피 린 기반 산소 감지 respirometer 라이브, 그대로 C. 선 충 에서 측정 OCR 사용 하 여 관련 된 단계는 설명된. 그러나 거기에 대형, 높은 처리량 respirometer8의 사용에 대 한 서 면된 프로토콜이이 프로토콜을 더 많은 예산 친절 하 고, 작은 규모 장비 사용에 대 한 적응 되었습니다. 이 프로토콜은 특히 OCR 두 긴장, 높은 처리량 검사는 필요 하지 않습니다와 그것의 사용은 과도 한 것 간의 차이 평가 하기 위한 유용 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm, 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Kord-Valmark Labware Products</td>
			<td>2900, 2901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>6285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 &#215; 22 mm coverslip</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto yeast extract</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>212705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C314-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (dH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C987Y85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Krackeler Scientific</td>
			<td>6-72050-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4&#183;7H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans

미토 콘 드리 아 기능을 최적의 건강 한 세포 활동, 특히 높은 에너지 요구 같은 신 경계와 근육에 있는 셀에에서 대 한 중요 하다. 일관 된,이 미토 콘 드 리아 기능 장애 신경 퇴행 성 질환 및 일반적으로 노화의 무수와 연결 되었습니다. 꼬마 선 충 elucidating 미토 콘 드 리아 기능의 많은 복잡 한에 대 한 강력한 모델 시스템 되었습니다. 미토 콘 드리 아 호흡 미토 콘 드리 아 기능의 강한 지시자 이다 고 최근에 개발 된 respirometers 세포에서 호흡을 측정 하는 최신의 플랫폼을 제공 합니다. 이 프로토콜, 라이브, 그대로 C. 선 충을 분석 하는 기술을 제공 합니다. 이 프로토콜 ~ 7 일의 기간에 걸쳐 (1) 성장 하 고 주입 하는 화합물의 C. 선 충, (2) 준비 및 프로브, (3) 약물 로드 및 카트리지 평형, 웜 분석 결과의 준비 (4) 수 분의 동기화에 대 한 단계를 포함 하 고 플레이트 및 실행, 분석 결과 (5) 후 실험 데이터 분석.

프로토콜을 사용 하 여 여기, OCR 야생 유형 동물 및 3 명의 다른 sel 12 돌연변이 종자 결정의 설명. sel-12 presenilin17의 선 충 C. ortholog을 인코딩합니다. 인간의 presenilin에 돌연변이 가족 Alzheimer의 질병18의 개발과 관련 된 가장 일반적인 유전 착오. 우리의 연구는 야생 타입 동물3에 비해 돌연변이 동물 <e...

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Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

그대로 꼬마 선 충 에 산소 소비 속도의 측정

미토 콘 드리 아 호흡은 중요 organismal 생존; 따라서, 산소 소비 속도 미토 콘 드리 아 건강의 훌륭한 지표 이다. 이 프로토콜에 기저 측정 하는 상업적으로 사용할 수 있는 respirometer 사용 하 여 설명 하 고 최대 산소 소비 속도에 라이브, 그대로, 그리고 자유롭게 운동 꼬마 선 충.

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

미토콘드리아 기능은 세포 항상성에 중요하며 산소 소비율은 미토콘드리아 건강의 결정적인 지표입니다. 이 프로토콜은 C.elegans의 산소 소비속도를 분석하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 미토콘드리아 기능의 법적 측정을 제공하는 라이브, 모바일 C.elegans를 사용합니다.미토콘드리아를 분리할 필요성을 높이는 것은 무결성에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 단계입니다. 시작하려면, 선충 성장 매체 또는 NGM 플레이트에 에샤리치아 대장균의 갓 씨를 뿌린 잔디밭에 원하는 유전 배경의 L4 애벌레를 전송합니다. 각 변형에 대해 적어도 두 개의 100mm 또는 3 개의 60mm 플레이트를 사용하십시오.3~4일 동안 적절한 성장 온도에서 벌레를 배양하거나, 판이 많은 수의 계란과 중력 벌레로 농축될 때까지 배양합니다. 선충의 100밀리미터 플레이트 당 약 6 밀리리터의 M9 버퍼를 사용하여 계란과 벌레를 접시에서 씻어냅니다. 유리 목초지 파이펫을 사용하여 계란과 벌레를 각 변형에 대해 개별 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기습니다.6, 180g에서 3 분 동안 체튜브를 아래로 회전시하십시오. 원심 분리에 따라, M9 버퍼만 동물과 계란 펠릿을 유지 밖으로 흡인. 각 튜브에 3~4밀리리터의 표백제 용액을 넣고 간헐적으로 소용돌이를 6분간 추가합니다.그런 다음 M9 버퍼를 추가하여 각 튜브를 채우고 1 분 동안 6, 180g에서 회전합니다. 슈퍼 나티퍼를 흡인하고 M9로 이 세척을 세 번 반복합니다. 세척 후, 계란 펠릿을 M9 버퍼의 약 9 밀리리터를 포함하는 신선한 15 밀리리터 튜브로 이동합니다.16~48시간 동안 섭씨 20도에 누디징하여 갓 부화한 벌레를 동기화합니다. 이 튜브를 6, 180g에서 1.5분 동안 아래로 회전한 후 동기화된 L-1 동물을 개별 NGM 플레이트에 OP50의 갓 시드잔디에 놓습니다. 동물이 약 42 시간 후에 L-4 애벌레 단계에 도달 할 때까지 접시를 섭씨 20도에서 유지하십시오.이때, 플래티넘 픽을 사용하여 L4 애벌레를 OP50 시드 NGM 플레이트로 이동하여 FUdR의 밀리리터당 0.5 밀리그램을 함유하여 자손 생성을 방지합니다. 플레이트의 각 우물에 증류수 200 마이크로리터를 추가하여 센서 카트리지에 수분을 공급하여 센서 프로브가 침수되도록 합니다. 접시를 실온에서 하룻밤 동안 보관하십시오.호흡로메터 인터페이스 내에서 가열 요소를 끕니다. 기계를 섭씨 15도 안에 보관하면 기계 내의 핵심 온도가 낮아지고 분석 중에 동물이 과열되는 것을 방지합니다. 하룻밤 동안 배양 한 후, 파이프 아웃 및 센서 프로브를 수화하는 데 사용되는 증류수를 폐기하고 각 우물에서 교정 용액의 200 마이크로 리터로 교체하십시오.FCCP 스톡 솔루션을 증류수에 100 마이크로몰러 FCCP로 희석합니다. 그런 다음 센서 카트리지에 주입 포트 A에 희석 된 용액의 20 마이크로 리터를 추가합니다. 센서 카트리지의 주입 포트 B에 400 밀리머 나트륨 아지드22 마이크로리터를 추가합니다.이제 호흡을 켜십시오. 홈 화면에서 시작 을 선택하고 템플릿 페이지가 나타납니다. 템플릿 페이지에서 빈"또는 이전에 디자인된 템플릿을 선택합니다.그룹 페이지가 나타납니다. 그룹 페이지에서 우물 A와 H를 배경 우물로 선택하고 실험 계획에 따라 나머지 6개의 우물을 적절한 그룹으로 할당합니다. 오른쪽 아래의 화살표를 클릭하여 프로토콜 페이지에 액세스하고 평형, 기초 및 주사 하나 및 두 개의 버튼이 선택되었는지 확인합니다.기초 OCR의 판독값 수와 최대 OCR 및 비 미토콘드리아 OCR의 판독 값을 조정합니다. 오른쪽 아래 모서리에 있는 화살표를 선택합니다. 센서 카트리지 플레이트를 로드하라는 메시지가 나타납니다.미리 알림 프롬프트 화면의 지침에 따라 센서 카트리지 플레이트가 올바른 방향으로 로드되었는지 확인합니다. 호흡보호계는 이제 카트리지를 평형화합니다. 200 마이크로리터의 M9 버퍼를 8개의 우물과 세포판 주변 저수지에 넣습니다.각 변형에서 약 100개의 웜을 시드되지 않은 NGM 플레이트에 선택하고 2~3분 동안 휴식을 취하십시오. 그런 다음, M9 버퍼로 백금 픽의 끝을 적시고 20 나이 동기화 된 동물을 G를 통해 우물 B로 선택하여 배경 우물 A와 H가 비어 있습니다. 이제 respirometer 소프트웨어에서 확인을 클릭하여 교정 버퍼가 포함된 플레이트를 배출합니다.센서 카트리지를 기기 내부에 두고 호흡로메터에서 플레이트를 제거합니다. 교정판을 동물을 포함하는 접시로 교체합니다. 플레이트를 적재하고 계속 타격하여 문을 닫고 분석이 실행되도록 합니다.분석 실행이 완료되면 화면의 프롬프트를 따라 셀 플레이트와 센서 카트리지를 제거합니다. 실행 데이터 전쟁 형식을 저장하려면 USB 포트에 플래시 드라이브를 삽입합니다. 센서 카트리지를 제거하고 동물이 약 2 분 동안 우물 바닥에 정착 할 수 있도록합니다.세포판을 스테레오 해부 현미경 아래에 놓고 우물당 동물의 수를 계산합니다. 분석 소프트웨어를 열고 정규화 탭을 통해 산소 소비율을 동물 수로 정상화합니다. 수정"탭 의 다양한 그룹에 적합한 수준을 적용하고 추가 분석을 위해 프리즘 파일로 파일을 내보냅니다.처음 다섯 측정의 평균은 기저 OCR입니다. FCCP 추가 후 5가지 측정값의 평균은 최대 OCR입니다. 마지막으로, 나트륨 아지드 첨가 후 마지막 5가지 측정의 평균은 미토콘드리아 호흡률이 아니다.칼슘 dysregulation변경된 미토콘드리아 기능을 초래할 수 있기 때문에, 셀-12 돌연변이및 야생형 동물 모두에서 OCR은 미토콘드리아 기능 및 건강에 대한 셀-12 돌연변이의 효과를 검사하기 위해 측정하였다. 야생 형 동물은 지속적으로 웜 당 분당 5 피코몰 보다 기저 OCR 비율을 보였다. 셀-12 돌연변이의 세 가지 변종은 모두 상당히 상승 된 OCR을 보였지만, 분당 약 7 개의 피코몰이 웜 당 나타났습니다.FCCP가 추가되면 예상대로 야생 유형의 OCR뿐만 아니라 셀-12 돌연변이가 증가했습니다. 야생 형 동물은 벌레 당 분당 약 7 개의 피코몰의 최대 OCR을 보였습니다. 셀-12 돌연변이는 분당 약 10 개의 피코몰을 가지고 있었지만 웜 당.이 분석에서 라이브, 잘 먹이고 비동기 동물을 사용하고 계란이나 시체를 분석 우물로 옮기는 것을 피하십시오. 또한, 기기의 내부 온도는 섭씨 25도를 초과해서는 안됩니다. 표백제, FCCP, FUdR 및 아지드 나트륨은 독성이 있습니다.따라서 재고 솔루션 및 약물 적재 를 준비하는 동안 보호 장갑을 착용해야합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

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생물학

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