Name: measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Forfatterne ønsker å erkjenne Dr. Kevin Bittman for hans veiledning i å etablere Seahorse XFp i laboratoriet. National Institutes of Health gir GM088213 støttet dette arbeidet.

Merk: Figur 2 gir en skjematisk oversikt over hele protokollen.
1. vekst og synkronisering av Rundormer befolkningen9,10
<ol><li>Overføre L4 larver av ønsket genetisk bakgrunn (f.eks N2 [wild type] og sel-12 dyr) på Rundormer vekst medier (NGM) plater (se tabell 1 for oppskriften) fersk plantet med en plen Escherichia coli (OP50)11. Bruk minst to 100 m...

<ol>
	<li>Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+19.">Ch. 19.</a> Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).</li><li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+and+endoplasmic+reticulum+calcium+homeostasis+and+cell+death.">Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death.</a> Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).</li><li>Sarasija, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+mutations+deregulate+mitochondrial+Ca(2+)+homeostasis+and+metabolic+activity+causing+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Luz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Morphology+and+Fundamental+Parameters+of+the+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Are+Altered+in+Caenorhabditis+elegans+Strains+Deficient+in+Mitochondrial+Dynamics+and+Homeostasis+Processes.">Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes.</a> PLoS One. 10, e0130940 (2015).</li><li>Ryu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urolithin+A+induces+mitophagy+and+prolongs+lifespan+in+C.+elegans+and+increases+muscle+function+in+rodents.">Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents.</a> Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).</li><li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).</li><li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress.">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).</li><li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans.">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Structure+in+the+Body+Wall+Muscle+of+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ROS+in+Caenorhabditis+elegans+Using+a+Reduced+Form+of+Fluorescein.">Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).</li><li>Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes.">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).</li><li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones.">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li><li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12,+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer's+disease+gene.">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li><li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer's+disease.">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li><li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mitochondrial+Ca2++in+the+regulation+of+cellular+energetics.">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans.">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li></ol>

Mitokondrielt åndedrett er en innsiktsfull indikator på mitokondrie funksjon; Derfor er å kunne måle oksygen forbruk priser i et biologisk system, enten i vitro eller i vivo svært verdifull. Respirometers forstand oksygen nivåer ved hjelp av porphyrin-baserte fosfor som får slukket av oksygen eller via amperometric oksygen sensorer som stoler på generering av en elektrisk gjeldende forhold til oksygen press. Clark elektrode faller sistnevnte kategori og har vært brukt mye i litteratur, spesielt mens analysere å...

Adenosin trifosfat (ATP), den viktigste kilden til celleenergien, produseres i mitokondrier av enzymer i elektronet transportkjeden (ETC) i indre mitokondrie membranen. Pyruvate, en nøkkel metabolitten benyttes for mitokondrie ATP produksjon, importeres inn i mitokondrie matrix hvor det er dekarboksyleres å produsere acetyl coenzyme A (CoA). Deretter inn acetyl CoA citric acid syklusen medføre generering av nikotinamid adenine dinucleotide (NADH), en nøkkel elektron carrier molekylet. Som elektroner fra NADH sendes til oksygen via osv, bygge protoner i mitokondrie intermembrane rom, som resulterer i genereringen av en elektrokjemisk forløpning over membranen. Disse protoner vil deretter flyte fra intermembrane plass over denne elektrokjemiske gradering tilbake i mitokondrie matrix gjennom proton pore av ATP syntase, roteringen og syntese av ATP1 (figur 1).
Mitokondrielt funksjon er ikke begrenset til energiproduksjon, men er også avgjørende for kalsium homeostase, reaktive oksygen arter (ROS) scavenging og apoptose, kritisk posisjonering deres funksjon i organismebiologi helse2. Mitokondrielt funksjonen kan vurderes ved hjelp av en rekke analyser, inkludert men ikke begrenset til analyser som måler mitokondrie membran potensial, ATP og ROS og mitokondrie kalsium konsentrasjoner. Men disse analyser gi ett bilde mitokondrie funksjon, og derfor kanskje ikke gir en omfattende oversikt over mitokondrie helse. Siden oksygenopptak ved ATP generasjon er avhengig av en rekke sekvensielle reaksjoner, fungerer det som en bedre indikator på mitokondrie funksjon. Interessant, er variasjoner i oksygen forbruk priser observert som følge av mitokondrie dysfunksjon3,4,5.
Oksygen forbruk priser (OCR) av levende prøver kan måles ved hjelp av teknikker som kan grovt inndeles i to grupper: amperometric oksygen sensorer og porphyrin-baserte fosfor som kan bli slukket av oksygen6. Amperometric oksygen sensorer har vært brukt mye å måle OCR i kulturperler celler, vev, og modellsystemer, slik som C. elegans. Men porphyrin-baserte fosfor som inneholder respirometers har følgende fordeler: (1) de tillater for en side ved side sammenligning av to prøvene i tre eksemplarer, (2) de krever mindre utvalgsstørrelsen (f.eks 20 ormer per brønn versus ~ 2, 000−5, 000 ormer i den kammer)7, og (3) i respirometer kan programmeres til å gjøre fire forskjellige sammensatte injeksjoner på ønsket ganger gjennom eksperimentell rensingen, eliminerer behovet for manuell program.
I denne protokollen er trinnene involvert i bruk en porphyrin-baserte oksygen-sensing respirometer å måle OCR i live, intakt C. elegans beskrevet. Mens det er en skriftlig protokoll for bruk av stort format, høy gjennomstrømning respirometer8, er denne protokollen tilpasset for bruk med en mer budsjett vennlig, tilgjengelig og mindre skala instrument. Denne protokollen er spesielt nyttig for å vurdere forskjellen i OCR mellom to stammer, hvor kreves ikke høy gjennomstrømming screening og bruk ville være overdreven.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm, 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Kord-Valmark Labware Products</td>
			<td>2900, 2901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>6285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 &#215; 22 mm coverslip</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto yeast extract</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>212705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C314-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (dH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C987Y85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Krackeler Scientific</td>
			<td>6-72050-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4&#183;7H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans

Optimal mitokondrie funksjonen er avgjørende for sunn cellulære aktiviteten, spesielt i celler som har høy energi krav som de i nervesystemet og muskel. Samsvar med dette, mitokondrie dysfunksjon har vært forbundet med en myriade av nevrodegenerative sykdommer, og aging generelt. Caenorhabditis elegans har vært en kraftig modellsystem for Klargjørende mange vanskelighetene med mitokondrie funksjon. Mitokondrielt åndedrett er en god indikator på mitokondrie funksjon nylig utviklede respirometers tilbyr en state-of-the-art plattform for å måle åndedrett i celler. I denne protokollen gir vi en teknikk for å analysere live, intakt C. elegans. Denne protokollen gjelder ~ 7 dager og inneholder trinn for (1) økende og synkronisering av C. elegans, (2) av forbindelser skal injiseres og hydrering sonder, (3) stoff lasting og patron balanse, (4) utarbeidelse av ormen analysen plate og analysen kjøres, og (5) post eksperiment dataanalyse.

Ved hjelp av protokollen beskrevet heri, OCR vill type dyr og tre forskjellige sel-12 mutant stammer var bestemt. sel-12 koder C. elegans ortholog presenilin17. Mutasjoner i menneskelig presenilin er den vanligste genetiske avvik knyttet til utviklingen av familiær Alzheimers18. Våre studier har vist opphøyet mitokondrie kalsium nivåer i sel-12 mutant dyr sammenlignet med wild type dyr<sup class="xref"...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Måling av oksygen inntak priser på intakt Caenorhabditis elegans

Mitokondrielt åndedrett er avgjørende for organismebiologi overlevelse; oksygen forbruksraten er derfor en god indikator på mitokondrie helse. I denne protokollen, vi beskrive bruken av et kommersielt tilgjengelig respirometer å måle basal og maksimalt oksygen forbruk priser i live, intakt, og fritt-motile Caenorhabditis elegans.

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Mitokondriefunksjon er avgjørende for cellulær homeostase og oksygenforbruk er en avgjørende indikator på mitokondriehelse. Denne protokollen gir detaljerte instruksjoner for å analysere oksygenforbruket i C.elegans. Denne protokollen gjør bruk av live, mobile C.elegans gir en juridisk måling av mitokondriefunksjon.Heve behovet for å isolere mitokondrier, et skritt som potensielt kan påvirke det er integritet. Til å begynne, overføre L4 larver av ønsket genetisk bakgrunn på en nyseedd plen av Escherichia coli på nematode vekstmedier eller NGM plater. Bruk minst to 100 mm eller tre 60 mm plater for hver belastning.Inkuber ormene ved riktig veksttemperatur i tre til fire dager, eller til platene er konsentrert med et stort antall egg og gravid ormer. Vask eggene og ormene av platene ved hjelp av ca. 6 milliliter M9-buffer per 100 millimeter plate nematoder. Bruk glassbeitepipetter, overfør egg og ormer til individuelle 15 milliliter sentrifugerør for hver stamme.Spinn teter ned rørene i tre minutter ved 6, 180 g. Etter sentrifugering, aspirere ut M9 buffer beholde bare dyret og egg pellet. Tilsett tre til fire milliliter blekemiddelløsning til hvert rør og midlertidig virvel i seks minutter.Deretter legger du til M9-buffer for å fylle hvert rør og spinne på 6, 180 g i ett minutt. Aspirer overnatanten og gjenta denne vasken med M9, tre ganger. Etter vasken flytter du eggpelleten til et friskt 15 milliliter rør som inneholder omtrent ni milliliter M9-buffer.Synkroniser de nyklekkede ormene ved å nutating på 20 grader Celsius i 16 til 48 timer. Etter å ha snurret disse rørene ned på 6, 180 g i 1,5 minutter, legg de synkroniserte L-1 dyrene ned på en nyseeded plen av OP50 på individuelle NGM-plater. Hold platene på 20 grader Celsius til dyrene når L-4 larvalstadiet etter ca. 42 timer.På dette tidspunktet, bruk en platina plukke for å flytte L4 larver til OP50 seeded NGM plater som inneholder 0,5 milligram per milliliter FUdR for å hindre fra å produsere avkom. Hydrer sensorkassetten ved å tilsette 200 mikroliter destillert vann til hver brønn på platen, slik at sensorprobene er nedsenket. Oppbevar platene over natten ved romtemperatur.Slå av varmeelementet i respirometergrensesnittet. Lagring av maskinen inne i en 15 graders Celsius inkubator senker kjernetemperaturen i maskinen og hindrer dyrene i å overopphetes under analysen. Etter inkubasjon over natten, pipette ut og kast destillert vann som brukes til å hydrere sensorprober, og erstatte den med 200 mikroliter av kalifarløsningen i hver brønn.Fortynn FCCP-lagerløsningen til 100 mikromos FCCP i destillert vann. Tilsett deretter 20 mikroliter av den fortynnede oppløsningen til injeksjonsport A i sensorkassetten. Tilsett 22 mikroliter med 400 millimolarnatriumazider til injeksjonsport B på sensorkassetten.Slå på respirometeret. Velg start på startskjermen, og malsidene vises. Velg tom"eller en tidligere utformet mal på malsiden.Grupper-siden vises. På gruppesiden velger du brønner A og H som bakgrunnsbrønner, og tilordner de resterende seks brønnene til passende grupper i henhold til den eksperimentelle planen. Få tilgang til protokollsiden ved å klikke pilen nederst til høyre, og sørg for at likevekt, basal og injeksjoner en og to knapp er valgt.Juster antall avlesninger av basal OCR samt maksimal OCR og ikke-mitokondrie OCR. Velg pilen nederst til høyre. En melding om å laste sensorkassettplaten vises.Kontroller at sensorkassettplaten er lagt i riktig retning, og følg instruksjonene på skjermbildet for påminnelsesmelding. Respirameteret vil nå likevekte sylinderampullen. Tilsett 200 mikroliter M9-buffer i hver av de åtte brønnene og de omkringliggende reservoarene på celleplaten.Plukk ca 100 ormer fra hver belastning på usette NGM plater, og la det hvile i to til tre minutter. Deretter luke slutten av platina plukke med M9 buffer og plukke 20 alder synkronisert dyr i brønner B til G, forlater bakgrunnen brønnene A og H tom. Klikk nå OK på respirometerprogramvaren for å løse ut platen som inneholder kalibreringsbufferen.Fjern platen fra respirometeret og la sensorkassetten være inne i instrumentet. Sett på kalibrantplaten med platen som inneholder dyrene. Last plater og lukk døren ved å trykke fortsett og la analysen kjøre.Når analysen er fullført, følger du instruksjonene på skjermen for å fjerne celleplaten og sensorkassetten. Sett inn en flash-enhet i USB-porten for å lagre kjøredatakrigsformatet. Fjern sensorkassetten og la dyrene legge seg til bunnen av brønnene i ca. to minutter.Plasser celleplatene under et stereodeksjonsmikroskop og telle antall dyr per brønn. Åpne analyseprogramvaren, etterfulgt av normaliseringsfanen, for å normalisere oksygenforbruket til dyrenummer. Bruk passende nivåer for de ulike gruppene under endre"-kategorien, og eksporter filen som en prismefil for videre analyse.Gjennomsnittet av de fem første målingene er basal OCR. Gjennomsnittet av de fem målingene etter FCCP-tillegg er den maksimale OCR. Til slutt er gjennomsnittet av de siste fem målingene etter natriumazididtillegg ikke-mitokondriekondrasjonshastigheten.Siden kalsiumdysregulering kan føre til endret mitokondriefunksjon, ble OCR hos både sel-12 mutanter og ville dyr målt for å undersøke effekten av sel-12 mutasjoner på mitokondriefunksjon og helse. Ville typer dyr viste konsekvent basal OCR priser under fem picomoles per minutt, per orm. Mens alle tre stammer av sel-12 mutanter viste betydelig forhøyet OCR, på omtrent syv picomoles per minutt, per orm.Ved tillegg av FCCP var det en økning i OCR av vill type, samt sel-12 mutanter, som forventet. Ville typer dyr viste maksimal OCR på omtrent syv picomoler per minutt, per orm. Mens sel-12 mutanter hadde OCR på ca 10 picomoles per minutt, per orm.Bruk levende, godt matet og asynkroniserte dyr i denne analysen, og unngå overføring av egg eller skrotter til analysebrønner. Videre bør den indre temperaturen på instrumentet ikke overstige 25 grader Celsius. Blekemiddel, FCCP, FUdR og natriumazid er giftige.Derfor bør det tas hensyn til å bruke vernehansker under fremstilling av lagerløsninger og legemiddelbelastning.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grunnleggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og observasjon

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Utvinning og analyse i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Tilskudd av flerumettede fettsyrer i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Gnager Working Hjerte modell for studier av hjerteinfarkt Ytelse og oksygenforbruk

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

dyrking av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I tre dimensjoner i laboratoriet

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Kvantifiserende vevsspesifikk proteostatisk nedgang i caenorhabditt elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modellering Alder-Assosiert Neurodegenerative Sykdommer i Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...