Name: measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Авторы хотели бы признать за его руководство в создании Seahorse XFp в лаборатории д-р Кевин Bittman. Национальные институты здравоохранения грант, что GM088213 поддерживает эту работу.

Примечание: На рисунке 2 обеспечивает Схематический обзор полного протокола.
1. рост и синхронизации нематоды населения9,10
<ol><li>Переноса личинок L4 желаемого генетических особенностей (например, N2 [дикого типа] и sel-12 животны?...

<ol>
	<li>Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+19.">Ch. 19.</a> Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).</li><li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+and+endoplasmic+reticulum+calcium+homeostasis+and+cell+death.">Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death.</a> Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).</li><li>Sarasija, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+mutations+deregulate+mitochondrial+Ca(2+)+homeostasis+and+metabolic+activity+causing+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Luz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Morphology+and+Fundamental+Parameters+of+the+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Are+Altered+in+Caenorhabditis+elegans+Strains+Deficient+in+Mitochondrial+Dynamics+and+Homeostasis+Processes.">Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes.</a> PLoS One. 10, e0130940 (2015).</li><li>Ryu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urolithin+A+induces+mitophagy+and+prolongs+lifespan+in+C.+elegans+and+increases+muscle+function+in+rodents.">Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents.</a> Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).</li><li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).</li><li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress.">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).</li><li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans.">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Structure+in+the+Body+Wall+Muscle+of+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ROS+in+Caenorhabditis+elegans+Using+a+Reduced+Form+of+Fluorescein.">Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).</li><li>Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes.">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).</li><li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones.">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li><li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12,+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer's+disease+gene.">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li><li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer's+disease.">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li><li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mitochondrial+Ca2++in+the+regulation+of+cellular+energetics.">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans.">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li></ol>

Митохондриальное дыхание является показателем глубокий митохондриальной функции; Поэтому будучи в состоянии измерить уровень потребления кислорода в биологической системе, будь то в лабораторных условиях или в естественных условиях весьма ценным. Respirometers смысле кислорода с помощью ...

Аденозинтрифосфат (АТФ), основным источником клеточной энергии, производится в митохондриях ферментами в электрон-транспортной цепи (и т.д.), расположенный в внутренней митохондриальной мембраны. Пируват, метаболита ключа используется для митохондриального производства АТФ, импортируется в митохондриальной матрицы, где это декарбоксилировали производить ацетил коэнзима A (CoA). Впоследствии ацетил CoA вводит цикл лимонной кислоты, в результате чего образуются Никотинамидадениндинуклеотид (NADH), ключевых электронов молекулы перевозчик. Поскольку электроны от NADH передаются кислорода через и т.д., протонов накапливаться в митохондриальной межмембранное пространства, что приводит к генерации электрохимических градиента через мембрану. Эти протоны затем будет вытекать из межмембранное пространства через этот электрохимических градиент обратно в матрице митохондриальной через поры Протон АТФ-синтазы, вождение его вращения и синтез АТФ1 (рис. 1).
Митохондриальной функции не ограничивается производства энергии, но также имеет решающее значение для гомеостаза кальция, реактивнооксигенных видов (ров) очистки и апоптоз, критически позиционирование их функции в научные здоровья2. Митохондриальной функции может быть оценена с помощью различных анализов, включая но не ограничиваясь анализов, которые измеряют митохондриальной мембранного потенциала, СПС и ROS уровней и митохондриальной кальция концентрации. Однако эти анализы предоставляют один снимок митохондриальной функции и поэтому не может обеспечить всеобъемлющее представление о митохондриального здоровья. Поскольку потребление кислорода во время генерации АТФ зависит от множества последовательных реакций, он служит превосходной индикатор функции митохондрий. Интересно, что результате митохондриальной дисфункции3,,45наблюдались различия в уровнях потребления кислорода.
Нормы потребления кислорода (OCR) живых образцов может быть измерена с помощью методов, которые можно разделить на две группы: Амперометрическое датчики кислорода и на основе порфирина светомассами, которые могут быть закаленных кислорода6. Датчики растворенного в воде кислорода широко использовались для измерения OCR в культивируемых клеток, тканей и в модели систем, таких как C. elegans. Однако, на основе порфирина Люминофоры, содержащие respirometers обладают следующими преимуществами: (1) они позволяют для бок о бок сравнение двух образцов в трех экземплярах, (2) они требуют меньше размер выборки (например, 20 червей за хорошо против ~ 2, 000−5, 000 червей в Палата)7и (3), которые респирометра может быть запрограммирован делать четыре различных составных инъекции на желаемый раз на протяжении выполнения экспериментальной, устраняя необходимость ручного нанесения.
В этом протоколе шаги с помощью порфирина кислорода зондирования респирометра меру OCR в C. elegans живой, нетронутыми, описанные. Хотя есть письменный протокол для использования большого формата, высокая пропускная способность респирометра8, этот протокол был адаптирован для использования с инструментом более дружественные, доступными и меньшего масштаба бюджета. Этот протокол является особенно полезной для оценки разницы в OCR между двух штаммов, где не требуется высокопроизводительного скрининга и его использование будет чрезмерным.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm, 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Kord-Valmark Labware Products</td>
			<td>2900, 2901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>6285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 &#215; 22 mm coverslip</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto yeast extract</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>212705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C314-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (dH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C987Y85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Krackeler Scientific</td>
			<td>6-72050-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4&#183;7H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans

Оптимальные функции митохондрий имеет решающее значение для здорового клеточную активность, особенно в клетках, которые имеют высокие энергетические потребности как в нервной системы и мышц. В соответствии с этим, митохондриальной дисфункции был связан с множеством нейродегенеративных заболеваний и старения в целом. Caenorhabditis elegans были мощной модели системы для выяснения многих тонкостях митохондриальной функции. Митохондриальное дыхание является сильным показателем митохондриальной функции и недавно разработанных respirometers предлагают состояние искусства платформу для измерения дыхания в клетках. В этом протоколе мы предоставляем технику для анализа живой, нетронутыми C. elegans. Этот протокол охватывает период ~ 7 дней и включает в себя шаги для синхронизации C. elegans, (2) подготовка соединений для инъекций и гидратации зонды, уравновешивания загрузки и картридж (3) наркотиков, (4) подготовка анализа червя и выращивания (1) пластины и пробирного запуска и анализ данных (5) после эксперимента.

С помощью протокола описаного, OCR дикого типа животных и три различных sel-12 мутантных штаммов были определены. SEL-12 кодирует ortholog C. elegans Пресенилин17. Мутации в человека Пресенилин являются наиболее распространенным генетическим аберрации, св?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Измерение коэффициентов потребления кислорода в неповрежденной Caenorhabditis elegans

Митохондриальное дыхание имеет решающее значение для выживания Организменное; Таким образом норма потребления кислорода является отличным показателем митохондриального здоровья. В этом протоколе мы описывают использование коммерчески доступных респирометра измерить базальную и максимальной кислорода расхода в жить, нетронутыми и свободно подвижные Caenorhabditis elegans.

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Митохондриальная функция имеет решающее значение для клеточного гомеостаза, а уровень потребления кислорода является решающим показателем митохондриального здоровья. Этот протокол содержит подробные инструкции по анализу скорости потребления кислорода в C.elegans. Этот протокол использует живые, мобильные C.elegans, обеспечивающие юридическое измерение митохондриальной функции.Повышение необходимости изолировать митохондрии, шаг, который потенциально может повлиять на его целостность. Для начала перенесите личинки L4 желаемого генетического происхождения на свежесеянную лужайку кишечной палочки на нематодные средства роста или NGM пластины. Используйте по крайней мере две 100 мм или три 60 мм пластин для каждого штамма.Инкубировать червей при соответствующей температуре роста в течение трех-четырех дней, или до тех пор, пока пластины сосредоточены с большим количеством яиц и гравийных червей. Вымойте яйца и червей с пластин, используя примерно 6 миллилитров буфера M9 на 100 миллиметров пластины нематод. Используя стеклянные пипетки пастбища, перенесите яйца и червей в отдельные 15 миллилитровых центрифуг для каждого штамма.Спиновые пробирки трубки вниз в течение трех минут на 6, 180 г. После центрифугации, аспирировать из буфера M9 сохраняя только животное и яйцо гранулы. Добавьте три-четыре миллилитров раствора отбеливателя в каждую трубку и периодически вихрь в течение шести минут.Затем добавьте буфер M9, чтобы заполнить каждую трубку и вращаться на 6, 180 г в течение одной минуты. Аспирировать супернатант и повторить эту стирку с M9, три раза. После мытья перемести яичные гранулы в свежую 15-миллилитровую трубку, содержащую примерно девять миллилитров буфера M9.Синхронизировать свежевылупившихся червей, орехи при 20 градусах по Цельсию в течение 16 до 48 часов. После спиннинг этих труб вниз на 6, 180 г в течение 1,5 минут, положить синхронизированных L-1 животных вниз на свежесеянной лужайке OP50 на отдельных ngM пластин. Держите пластины на 20 градусов по Цельсию, пока животные не достигнут стадии личинки L-4 примерно через 42 часа.В это время используйте платиновый выбор для перемещения личинок L4 в пластины OP50, содержащие 0,5 миллиграмма на миллилитр FUdR, чтобы предотвратить производство потомства. Гидратировать картридж датчика, добавив 200 микролитров дистиллированной воды в каждую колодец на пластине, гарантируя, что датчик зонды погружены. Храните тарелки на ночь при комнатной температуре.Выключите нагревательный элемент в интерфейсе респирометра. Хранение машины внутри инкубатора по Цельсию на 15 градусов снижает температуру ядра в машине и предотвращает перегрев животных во время анализа. После ночной инкубации, пипетка и отказаться от дистиллированной воды, используемой для гидратации датчика зондов, и заменить его 200 микролитров раствора калибранта в каждой хорошо.Разбавить раствор акций FCCP до 100 микромолейных FCCP в дистиллированной воде. Затем добавьте 20 микролитров разбавленного раствора для впрыска порта А в сенсорный картридж. Добавьте 22 микролитров 400 миллимолярные азиды натрия для впрыска порта B сенсорного картриджа.Теперь включите респирометр. На домашнем экране выберите начало и появятся страницы шаблонов. На странице шаблонов выберите пустой"или ранее разработанный шаблон.Страница групп будет отображаться. На странице групп выберите скважины A и H в качестве фоновых скважин и назначьте оставшиеся шесть скважин соответствующим группам в соответствии с экспериментальным планом. Получите доступ к странице протокола, нажав на стрелку в правом нижнем праве, и убедитесь, что равновесные, базальные и инъекции одной и двух кнопок выбраны.Отрегулируйте количество показаний базального OCR, а также максимальный OCR и не митохондриальный OCR. Выберите стрелку в правом нижнем углу. Появится подсказка для загрузки сенсорной пластины картриджа.Убедитесь, что пластина картриджа датчика загружается в нужной ориентации, следуя инструкциям на экране напоминания. Респирометр теперь будет уравночные картриджа. Добавьте 200 микролитров буфера M9 в каждую из восьми скважин и окружающих резервуаров клеточной пластины.Выберите около 100 червей из каждого штамма на несеяные пластины NGM, и дайте отдохнуть в течение двух-трех минут. Затем, мокрый конец платины забрать с буфером M9 и выбрать 20 возрастных синхронизированных животных в скважины B через G, в результате чего фоновые скважины А и H пусто. Теперь нажмите OK на программное обеспечение респирометра, чтобы извлечь пластину, содержащую буфер калибровки.Снимите пластину с респирометра, оставив сенсорный картридж внутри прибора. Замените калибрантную пластину пластиной, содержащей животных. Загрузите пластины и закройте дверь, нажав продолжать и позволяют анализ для запуска.После того, как анализ запустить завершена, следуйте подсказки на экране, чтобы удалить пластину ячейки и датчик картриджа. Вставьте флэш-накопитель в порт USB, чтобы сохранить формат войны данных. Удалите сенсорный картридж и позвольте животным осесть на дне колодцев в течение примерно двух минут.Поместите клеточные пластины под стерео рассечение микроскопа и подсчитайте количество животных на колодец. Откройте программное обеспечение для анализа, а затем вкладку нормализации, чтобы нормализовать уровень потребления кислорода до числа животных. Примените соответствующие уровни для различных групп в соответствии с изменением "таб, и экспортировать файл в качестве призмы файл для дальнейшего анализа.Среднее значение первых пяти измерений составляет базальный OCR. Среднее значение пяти измерений после добавления FCCP является максимальным OCR. Наконец, среднее значение последних пяти измерений после добавления азида натрия – это нетихондриальная частота дыхания.Поскольку дисрегуляция кальция может привести к изменению митохондриальной функции, OCR как у мутантов sel-12, так и у диких животных был измерен для изучения влияния мутаций sel-12 на митохондриальную функцию и здоровье. Дикие животные типа последовательно показали базальные ставки OCR ниже пяти пикомолов в минуту, на червя. В то время как все три штамма мутантов sel-12 показали значительно повышенный OCR, приблизительно семь пикомолов в минуту, на червя.Помимо FCCP, произошло увеличение OCR дикого типа, а также сель-12 мутантов, как и ожидалось. Дикие животные типа показали максимальный OCR приблизительно семь пикомолов в минуту, на червя. В то время как мутанты sel-12 имели OCR приблизительно 10 пикомолов в минуту, на червя.Используйте живых, хорошо кормили, и асинхронизированных животных в этом анализе, и избежать передачи яиц или туш в анализ скважин. Кроме того, внутренняя температура прибора не должна превышать 25 градусов по Цельсию. Отбеливатель, FCCP, FUdR и азид натрия токсичны.Поэтому следует позаботиться о том, чтобы носить защитные перчатки при подготовке фондовых растворов и загрузке лекарств.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Выделение и В пробирке Активация Caenorhabditis Элеганс Сперма

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Покадровый Микроскопия раннего эмбриогенеза в Caenorhabditis Элеганс

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Основной<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Методы синхронизации и наблюдения

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Добыча простагландинов и анализа в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Диетических добавок полиненасыщенных жирных кислот в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Грызун Рабочая модель сердца по изучению инфарктом производительности и потребления кислорода

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Выращивание<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; В трех измерениях в лаборатории

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Количественная оценка тканеспецифического снижения протеостатического снижения caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Моделирование Возраст-ассоциированных нейродегенеративных заболеваний в Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...