Name: measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Författarna vill erkänna Dr Kevin Bittman för hans vägledning i upprättandet av den Seahorse XFp i labbet. National Institutes of Health bevilja GM088213 stött detta arbete.

Obs: Figur 2 ger en schematisk överblick över hela protokollet.
1. tillväxt och synkronisering av nematoder befolkningen9,10
<ol><li>Överföra L4 larver av önskad genetiska bakgrunder (t.ex. N2 [wild type] och sel-12 djur) på nematoder media (NGM) tillväxtplattor (se tabell 1 för recept) nyligen seedade med en gräsmatta av Escherichia coli (OP50)11</su...

<ol>
	<li>Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+19.">Ch. 19.</a> Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).</li><li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+and+endoplasmic+reticulum+calcium+homeostasis+and+cell+death.">Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death.</a> Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).</li><li>Sarasija, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+mutations+deregulate+mitochondrial+Ca(2+)+homeostasis+and+metabolic+activity+causing+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Luz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Morphology+and+Fundamental+Parameters+of+the+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Are+Altered+in+Caenorhabditis+elegans+Strains+Deficient+in+Mitochondrial+Dynamics+and+Homeostasis+Processes.">Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes.</a> PLoS One. 10, e0130940 (2015).</li><li>Ryu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urolithin+A+induces+mitophagy+and+prolongs+lifespan+in+C.+elegans+and+increases+muscle+function+in+rodents.">Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents.</a> Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).</li><li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).</li><li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress.">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).</li><li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans.">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Structure+in+the+Body+Wall+Muscle+of+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ROS+in+Caenorhabditis+elegans+Using+a+Reduced+Form+of+Fluorescein.">Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).</li><li>Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes.">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).</li><li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones.">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li><li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12,+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer's+disease+gene.">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li><li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer's+disease.">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li><li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mitochondrial+Ca2++in+the+regulation+of+cellular+energetics.">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans.">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li></ol>

Mitokondriell andning är en insiktsfull indikator på mitokondriell funktion; Därför är att kunna mäta de syre förbrukning i ett biologiskt system, om in vitro- eller in vivo mycket värdefulla. Respirometers känner av syrehalten använder porphyrin-baserade fosfor som får härdas av syre eller via amperometrisk syresensorer som förlitar sig på generationen av en elektrisk nuvarande proportionella till syre pressar. Clark elektrod faller i den senare kategorin och har använts flitigt i litteratur, särskilt sa...

Omvandlingen av adenosintrifosfat (ATP), den viktigaste källan till cellulär energi, produceras i mitokondrierna av enzymer i elektron transportkedjan (ETC) ligger i det inre mitokondriella membranet. Pyruvat, en viktig metabolit utnyttjas för mitokondriell ATP-produktion, importeras till mitokondriell matrisen där det är dekarboxylering att producera acetyl-coenzym A (CoA). Därefter träder acetyl CoA Citronsyracykeln som resulterar i framtagningen av nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH), en nyckel elektron bärarmolekyl. Eftersom elektroner från NADH skickas till syre via ETC, bygga protoner upp i mitokondriell intermembrane utrymmet, som resulterar i framtagningen av en elektrokemisk gradient över membranet. Dessa protoner kommer sedan flöda från det intermembrane utrymmet över denna elektrokemiska gradient tillbaka in i mitokondriell matrisen genom proton pore av ATP synthase, kör dess rotation och syntesen av ATP1 (figur 1).
Mitokondriefunktion är inte begränsat till energiproduktionen men är också avgörande för kalciumhomeostas, reaktiva syreradikaler (ROS) rensning och apoptos, kritiskt positionering deras funktion i organismers hälsa2. Mitokondriell funktion kan bedömas med hjälp av olika analyser, inklusive men inte begränsat till analyser som mäter mitokondriella membranpotential, ATP och ROS nivåer och mitokondrie kalcium koncentrationer. Men dessa analyser ger en enda ögonblicksbild av mitokondriell funktion och därför kanske inte ger en heltäckande bild av mitokondriell hälsa. Eftersom syreförbrukning vid ATP generation är beroende av en myriad av sekventiell reaktioner, fungerar den som en överlägsen indikator på mitokondriell funktion. Intressant, har variationer i syre förbrukning observerats som en följd av mitokondriell dysfunktion3,4,5.
Syre förbrukning (OCR) av levande prover kan mätas med hjälp av tekniker som kan delas in i två grupper: amperometrisk syresensorer och Porfyrin-baserade fosfor som kan kvävas av syre6. Amperometrisk syresensorer har använts i stor utsträckning att mäta OCR i odlade celler, vävnader, och i modellsystem, såsom C. elegans. Dock porphyrin-baserade fosfor innehållande respirometers ha följande fördelar: (1) de möjliggör en sida vid sida jämförelse av två prover i tre exemplar, (2) de kräver mindre urvalsstorlek (t.ex. 20 maskar per brunn kontra ~ 2, 000−5, 000 maskar i de avdelningen)7och (3) respirometer kan programmeras att göra fyra olika sammansatta injektioner vid önskade tidpunkter under experimentella flykt, vilket eliminerar behovet av manuell applicering.
I detta protokoll är stegen i använda en porphyrin-baserade syre-sensing respirometer åtgärd OCR i live, intakt C. elegans beskrivs. Medan det finns ett skriftligt protokoll för användning av stora format, hög genomströmning respirometer8, har detta protokoll anpassats för användning med ett mer budget vänlig, lättillgänglig och mindre skala instrument. Protokollet är särskilt användbart för att bedöma skillnaden i OCR mellan två stammar, där high-throughput screening krävs inte och dess användning skulle bli orimlig.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm, 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Kord-Valmark Labware Products</td>
			<td>2900, 2901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>6285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 &#215; 22 mm coverslip</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto yeast extract</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>212705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C314-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (dH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C987Y85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Krackeler Scientific</td>
			<td>6-72050-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4&#183;7H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans

Optimal mitokondriefunktion är avgörande för friska cellulär aktivitet, särskilt i celler som har hög energi krav liknande dem i nervsystem och muskler. Konsekvent med detta, mitokondriell dysfunktion har associerats med en myriad av neurodegenerativa sjukdomar och åldrande i allmänhet. Caenorhabditis elegans har varit en kraftfull modellsystem för att belysa många krångligheter av mitokondriell funktion. Mitokondriell andning är en stark indikator på mitokondriefunktion och nyligen utvecklade respirometers erbjuda en state-of-the-art plattform för att mäta andning i celler. I detta protokoll ger vi en teknik för att analysera live, intakt C. elegans. Detta protokoll spänner över en period av ~ 7 dagar och omfattar steg för (1) växer och synkronisering för C. elegans, (2) beredning av föreningar som injiceras och hydrering av sonder, (3) drog lastning och patron Jämviktstiden, (4) förberedelse av masken assay plattan och assay kör, och (5) efter experimentet dataanalys.

Protokollet beskrivs häri, OCR av vildtyp djur och tre olika sel-12 mutant stammar bestämdes. sel-12 kodar den C. elegans ortholog presenilin17. Mutationer i mänskliga presenilin är den vanligaste genetiska avvikelse är associerad med utveckling av familjär Alzheimers sjukdom18. Våra studier har visat förhöjda mitokondriell kalciumnivåer i sel-12 muterade djur jämfört med vildtyp djur<sup class...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mätning av syre förbrukning i intakt Caenorhabditis elegans

Mitokondriell respiration är kritisk för organismers överlevnad; syre materialåtgången är därför en bra indikator på mitokondriell hälsa. I detta protokoll, beskriver vi användning av en kommersiellt tillgängliga respirometer att mäta basal och maximal syre förbrukning i live, intakt, och fritt rörliga Caenorhabditis elegans.

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Mitokondriell funktion är avgörande för cellulär homeostas och syreförbrukning är en avgörande indikator på mitokondriell hälsa. Detta protokoll ger detaljerade instruktioner mot att analysera syreförbrukningshastigheten i C.elegans. Detta protokoll använder sig av levande, mobil C.elegans ger en rättslig mätning av mitokondriell funktion.Upplysning behovet av att isolera mitokondrierna, ett steg som potentiellt kan påverka det integritet. Till att börja överföra L4-larver av önskad genetisk bakgrund på en nyfröd gräsmatta av Escherichia coli på nematodtillväxtmedia eller NGM-plattor. Använd minst två 100 mm eller tre 60 mm plattor för varje stam.Inkubera maskarna vid lämplig tillväxttemperatur i tre till fyra dagar, eller tills plattorna är koncentrerade med ett stort antal ägg och gravidmaskar. Tvätta äggen och maskarna från plattorna med hjälp av cirka 6 milliliter M9 buffert per 100 millimeters platta nematoder. Med hjälp av glas betesmark pipetter, överföra ägg och maskar i enskilda 15 milliliter centrifugrör för varje stam.Snurra avse-rör ner i tre minuter vid 6, 180 g. Efter centrifugeringen aspirerar du ut M9-bufferten som behåller bara djur- och äggpelletsen. Tillsätt tre till fyra milliliter blekmedel lösning till varje rör och intermittent virvel i sex minuter.Lägg sedan till M9-buffert för att fylla varje rör och snurra vid 6, 180 g i en minut. Aspirera supernatanten och upprepa denna tvätt med M9, tre gånger. Efter tvätten flyttar du äggpelleten till ett färskt 15 milliliterrör innehållande cirka nio milliliter M9-buffert.Synkronisera de nykläckta maskarna genom att nöta vid 20 grader Celsius i 16 till 48 timmar. Efter att ha snurrat ner dessa rör på 6, 180 g i 1,5 minuter, lägg de synkroniserade L-1 djuren ner på en nyfrögräsmatta av OP50 på individuella NGM-plattor. Håll plattorna på 20 grader Celsius tills djuren når larvstadiet L-4 efter cirka 42 timmar.Vid denna tid, använd en platina plocka för att flytta L4 larverna till OP50 seedade NGM plattor som innehåller 0,5 milligram per milliliter av FUdR för att förhindra att producera avkomma. Hydrera sensorpatronen genom att tillsätta 200 mikroliter av destillerat vatten till varje brunn på plattan, vilket säkerställer att sensorns sonder är nedsänkta. Förvara plattorna över natten i rumstemperatur.Stäng av värmeelementet inom gränssnittet för respirometer. Att förvara maskinen inuti en 15 grader Celsius inkubator sänker kärntemperaturen inom maskinen och förhindrar att djuren överhettas under analysen. Efter inkubation över natten, pipettera ut och kassera destillerat vatten som används för att hydratera sensorn sonder, och ersätta den med 200 mikroliter av calibrant lösning i varje brunn.Späd ut FCCP-stamlösningen till 100 mikromolar FCCP i destillerat vatten. Tillsätt sedan 20 mikroliter av den utspädda lösningen till injektionsport A i sensorkassetten. Tillsätt 22 mikroliter på 400 millimolarnatriumazider till injektionsport B av sensorpatronen.Sätt på respirometern. På hemskärmen väljer du Startskärmen så visas mallsidorna. På sidan mallar väljer du tomt"eller en tidigare utformad mall.Sidan grupper kommer att visas. På sidan grupper väljer du brunnar A och H som bakgrundsväldarna, och tilldelar de återstående sex brunnarna i lämpliga grupper enligt experimentplanen. Få åtkomst till protokollsidan genom att klicka på pilen på nedre högra, och se till att knappen equilibrate, basal och injektioner en och två är markerade.Justera antalet avläsningar av basal OCR samt maximal OCR och icke-mitokondriell OCR. Markera pilen på det nedre högra hörnet. En uppmaning att ladda sensorns patronplatta kommer att visas.Se till att sensorkassettens plåt är laddad i rätt orientering, följ anvisningarna på skärmen för påminnelseuppmaning. Respirametern kommer nu att jämviktskassetten. Tillsätt 200 mikroliter M9-buffert i var och en av de åtta brunnarna och omgivande reservoarer av cellplattan.Plocka cirka 100 maskar från varje stam på oseedade NGM plattor, och låt vila i två till tre minuter. Sedan våt slutet av platina plocka med M9 buffert och plocka 20 ålder synkroniserade djur i brunnar B genom G, lämnar bakgrunden brunnar A och H tom. Klicka nu på OK på respirometerprogramvaran för att mata ut plattan som innehåller kalibreringsbuffert.Ta bort plattan från respirometern som lämnar sensorkassetten inuti instrumentet. Byt ut calibrantplattan mot plattan som innehåller djuren. Ladda plattor och stäng dörren genom att slå fortsätta och låt analysen att köra.När analysen köra är klar, följ uppmaningarna på skärmen för att ta bort cellplattan och sensorn patron. Sätt in ett flashminne i USB-porten för att spara formatet run data war. Ta bort sensorkassetten och låt djuren lägga sig till botten av brunnarna i cirka två minuter.Placera cellplattorna under ett stereo dissekerande mikroskop och räkna antalet djur per brunn. Öppna analysprogramvaran, följt av normaliseringsfliken, för att normalisera syreförbrukningshastigheten till djurnummer. Tillämpa lämpliga nivåer för de olika grupperna under fliken ändra", och exportera filen som en prisma-fil för vidare analys.Genomsnittet av de första fem mätningarna är den basala OCR. Genomsnittet av de fem mätningarna efter FCCP tillägg är det maximal OCR. Slutligen är medelvärdet av de senaste fem mätningarna efter natriumazidtillsats den icke-mitokondriella respirationshastigheten.Eftersom kalcium dysregulation kan resultera i ändrade mitokondriell funktion, OCR i både sel-12 mutanter och vilda typ djur mättes för att undersöka effekten av sel-12 mutationer på mitokondriell funktion och hälsa. Vilda typ djur visade konsekvent basala OCR priser under fem picomoles per minut, per mask. Medan alla tre stammar av sel-12 mutanter visade betydligt förhöjda OCR, av cirka sju picomoles per minut, per mask.Vid tillägg av FCCP, det fanns en ökning av OCR av vilda typ, liksom SEL-12 mutanter, som förväntat. Vilda typ djur visade maximal OCR på cirka sju picomoles per minut, per mask. Medan sel-12 mutanter hade OCR på cirka 10 picomoles per minut, per mask.Använd levande, väl utfodrat, och asynkroniserade djur i denna analys, och undvika överföring av ägg eller slaktkroppar i assay wells. Vidare bör instrumentets inre temperatur inte överstiga 25 grader Celsius. Bleach, FCCP, FUdR, och natriumazid är giftiga.Därför bör man se till att bära skyddshandskar under beredning av stamlösningar och läkemedelsbelastning.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolering och In vitro Aktivering av Caenorhabditis elegans Spermier

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-baserade dietrestriktioner i Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Mikroskopi av tidig embryogenesen i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basisk<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering och miljöövervakning

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraktion och analys i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Mätning av mRNA dämpfaktorer i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Använda<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Stammar

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Gnagare Working Heart modell för studier av Myocardial prestanda och syreförbrukning

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

odling av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I tre dimensioner i laboratoriet

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Kvantifiering av vävnadsspecifik proteostatisk nedgång i caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Bedömning av de novo Proteinsyntesen Priser i Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...