Name: measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Yazarlar laboratuarda Seahorse XFp kurulmasında onun rehberlik için Dr. Kevin Bittman kabul etmek istiyorum. Ulusal Sağlık Enstitüleri GM088213 Bu eser desteklenen verin.

Not: Resim 2 tam protokolü, şematik bir genel bakış sağlar.
1. büyüme ve eşitleme nematodunun nüfus9,10
<ol><li>İstenen genetik arka L4 larva transferi (örneğin, N2 [vahşi türü] ve sel-12 hayvan) taze bir çim Escherichia coli (OP50)11numaralı seribaşı (bkz. Tablo 1 için reçete) nematodunun büyüme medya (NGM) plakalar üzerine. En az...

<ol>
	<li>Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+19.">Ch. 19.</a> Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).</li><li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+and+endoplasmic+reticulum+calcium+homeostasis+and+cell+death.">Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death.</a> Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).</li><li>Sarasija, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+mutations+deregulate+mitochondrial+Ca(2+)+homeostasis+and+metabolic+activity+causing+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Luz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Morphology+and+Fundamental+Parameters+of+the+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Are+Altered+in+Caenorhabditis+elegans+Strains+Deficient+in+Mitochondrial+Dynamics+and+Homeostasis+Processes.">Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes.</a> PLoS One. 10, e0130940 (2015).</li><li>Ryu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urolithin+A+induces+mitophagy+and+prolongs+lifespan+in+C.+elegans+and+increases+muscle+function+in+rodents.">Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents.</a> Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).</li><li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).</li><li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress.">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).</li><li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans.">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Structure+in+the+Body+Wall+Muscle+of+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+ROS+in+Caenorhabditis+elegans+Using+a+Reduced+Form+of+Fluorescein.">Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).</li><li>Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes.">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).</li><li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones.">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li><li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12,+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer's+disease+gene.">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li><li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer's+disease.">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li><li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mitochondrial+Ca2++in+the+regulation+of+cellular+energetics.">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans.">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li></ol>

Mitokondrial solunum mitokondriyal işlev anlayışlı bir göstergesidir; Bu nedenle, tüp bebek veya içinde vivo biyolojik bir sistemde, oksijen tüketim oranları ölçmek için güçlü olmak son derece değerlidir. Respirometers oksijen ya da oksijen basıncı için elektrikli bir geçerli orantılı nesil itimat amperometric oksijen sensörler yoluyla su porfirin tabanlı fosforun kullanarak oksijen düzeyleri hissediyorum. Clark elektrot ikinci kategoriye giriyor ve özellikle solunum C. elegansiçinde a...

Adenozin trifosfat (ATP), ana kaynağı hücresel enerjinin mitokondri içinde iç mitokondrial membran bulunan enzimler elektron taşıma zinciri (vb) tarafından üretilmektedir. Pyruvate, mitokondriyal ATP üretimi için kullanılan bir anahtar metaboliti Dekarboksile asetil koenzim A (CoA) üretmek için nerede mitokondrial matris alınır. Daha sonra asetil CoA, sitrik asit döngüsü Nikotinamid adenin dinükleotit (NADH), bir anahtar elektron taşıyıcı molekül üretimi kaynaklanan girer. NADH elektron oksijen vb geçerken proton mitokondriyal intermembrane alanı olan bir elektrokimyasal gradyan üretimi membran arasında sonuçlar kurmak. Bu proton sonra intermembrane uzaydan bu elektrokimyasal degrade boyunca sürüş onun rotasyon ve ATP1 (şekil 1) sentezi ATP sentaz proton gözenek aracılığıyla mitokondrial matris içine geri akacaktır.
Mitokondriyal işlev enerji üretimi için sınırlı değildir ama aynı zamanda kalsiyum Homeostazı, Reaktif oksijen türleri (ROS) atma ve apoptosis, eleştirel onların işlevi organizmalar sağlık2' konumlandırma için çok önemlidir. Mitokondriyal işlev dahil ancak bunlarla sınırlı mitokondri zar potansiyel ölçmek analizleri, ATP ve ROS düzeyleri ve mitokondrial kalsiyum konsantrasyonları değil deneyleri, çeşitli kullanılarak değerlendirilebilir. Ancak, bu deneyleri mitokondriyal işlev tek bir görüntüsünü sağlar ve bu nedenle mitokondrial sağlık kapsamlı bir görünümünü sağlamayabilir. ATP üretimi sırasında oksijen tüketimi sıralı reaksiyonlar çok sayıda bağımlı olduğundan, mitokondriyal işlev üstün bir göstergesi olarak hizmet vermektedir. İlginçtir, oksijen tüketim oranları değişimler sonucunda mitokondrial disfonksiyon3,4,5gözlemledim.
Oksijen tüketim oranları (OCR) yaşayan örnekleri ölçülen genel olarak iki gruba ayrılabilir teknikleri kullanarak: amperometric oksijen sensörler ve oksijen6tarafından giderdikten porfirin tabanlı fosforun. Amperometric oksijen sensörler kapsamlı bir şekilde ölçmek OCR kültürlü hücreler, dokular ve C. elegansgibi modeli sistemlerinde kullanılmaktadır. Ancak, porfirin tabanlı fosforun respirometers içeren aşağıdaki avantajlara sahip: (1) onlar izin için bir yan yana karşılaştırma iki nüsha, örnekleri (2) onlar daha küçük örnek boyutu gerektirir (örneğin, 000 ~ 2, 000−5, karşı iyi başına 20 solucan solucanlar odası)7ve (3) respirometer adlı dört farklı bileşik enjeksiyon yapmak için programlanmış kez el ile uygulama ihtiyacını ortadan kaldırarak deneysel çalışma boyunca istenilen.
Bu protokol için bir porfirin tabanlı oksijen algılamalı respirometer ölçüde canlı, bozulmamış C. elegans OCR için kullanmakla ilgili adımlardır açıklanan. Geniş format, yüksek işlem hacmi respirometer8, kullanımı için yazılı bir protokol ise bu iletişim kuralı bir daha fazla bütçe dostu, erişilebilir ve daha küçük ölçekli aleti ile kullanmak için adapte edilmiştir. Bu iletişim kuralı OCR nerede yüksek üretilen iş tarama gerekli değildir ve kullanımı aşırı olurdu iki suşlar arasındaki farkı değerlendirmek için özellikle yararlıdır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm, 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Kord-Valmark Labware Products</td>
			<td>2900, 2901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>6285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 &#215; 22 mm coverslip</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto yeast extract</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>212705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C314-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (dH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C987Y85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Krackeler Scientific</td>
			<td>6-72050-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4&#183;7H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of oxygen consumption rates in intact caenorhabditis elegans

En iyi mitokondriyal işlev özellikle yüksek enerji talepleri de sinir sistemi ve kas gibi olan hücrelerde sağlıklı hücresel hareketlilik için önemlidir. Tutarlı, mitokondrial disfonksiyon sayısız nörodejeneratif hastalıklar ve genel olarak yaşlanma ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Caenorhabditis elegans mitokondriyal işlev birçok inceliklerini elucidating için bir güçlü modeli sistemi olmuştur. Mitokondrial solunum mitokondriyal işlev, güçlü bir göstergedir ve son zamanlarda geliştirilen respirometers solunum hücrelerdeki ölçmek için bir state-of--art platformu sunuyoruz. Bu protokol için biz canlı, bozulmamış C. elegansanaliz etmek için bir yöntem sağlar. Bu iletişim kuralı, ~ 7 gün yayılan ve (1) büyüyen ve senkronizasyon C. elegans, (2) hazırlık bileşikleri enjekte edilir ve hidrasyon probları, (3) uyuşturucu yükleme ve kartuş denge, (4) solucan tahlil hazırlanması için adımları içerir plaka ve tahlil çalıştırmak ve (5) sonrası deneme veri analizi.

İletişim kuralını kullanarak burada, OCR vahşi türü hayvan ve üç farklı sel-12 mutant suşları belirlenmiştir nitelendirdi. sel-12 presenilin17 C. elegans ortholog kodlar. İnsan presenilin mutasyonların ailesel Alzheimer hastalığı18gelişimi ile ilişkili en yaygın genetik sapma vardır. Çalışmalarımız yükseltilmiş mitokondrial kalsiyum düzeyleri sel-12 ' mutant hayvanlar vahşi t...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Oksijen tüketimi oranlarında sağlam Caenorhabditis elegans ölçümü

Mitokondrial solunum organizmalar hayatta kalmak için önemlidir; Bu nedenle, oksijen tüketim oranını mitokondrial sağlık mükemmel bir göstergesidir. Bu iletişim kuralı, Bazal ölçmek için piyasada bulunan bir respirometer nasıl kullanılacağını açıklar ve maksimal oksijen tüketimi oranlarında yaşa, sağlam ve serbestçe hareketli Caenorhabditis elegans.

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Mitokondriyal fonksiyon hücresel homeostaz için önemlidir ve oksijen tüketim hızı mitokondriyal sağlığın belirleyici bir göstergesidir. Bu protokol, C.elegans'taki oksijen tüketim oranının analizine yönelik ayrıntılı talimatlar vermektedir. Bu protokol, mitokondriyal fonksiyonun yasal bir ölçümünü sağlayan canlı, mobil C.elegans'tan yararlanıyor.Mitokondriyi izole etme ihtiyacını arttırmak, bütünlüğü etkileyebilecek bir adım. Başlamak için, nematod büyüme medya veya NGM plakaları üzerinde Escherichia coli taze tohumlu çim üzerine istenilen genetik arka planlar L4 larvaları aktarın. Her suşu için en az iki adet 100 mm veya üç adet 60 mm plaka kullanın.Solucanları uygun büyüme sıcaklığında üç ila dört gün veya plakalar çok sayıda yumurta ve gravid solucanla yoğunlaşana kadar kuluçkaya yatırın. Yumurtaları ve solucanları 100 milimetrelik nematod tabakası başına yaklaşık 6 mililitre M9 tamponu kullanarak plakalardan yıkayın. Cam mera pipetleri kullanarak, her suşu için ayrı 15 mililitrelik santrifüj tüpler içine yumurta ve solucanlar aktarın.6, 180 g üç dakika boyunca aşağı tez tüpleri spin. Santrifüjden sonra, M9 tamponunu aspire edin ve sadece hayvan ve yumurta peletini koruyun. Her tüp ve aralıklı girdap altı dakika boyunca çamaşır suyu çözeltisi üç ila dört mililitre ekleyin.Sonra, her tüp doldurmak ve bir dakika için 6, 180 g spin M9 tampon ekleyin. Supernatant aspirate ve M9 ile bu yıkama tekrarlayın, üç kez. Yıkamadan sonra, yumurta peletini yaklaşık dokuz mililitre M9 tamponu içeren 15 mililitrelik taze bir tüpe taşıyın.Yeni yumurtadan çıkan solucanları 20 derecede 16 ila 48 saat boyunca somunlayarak senkronize edin. Bu tüpleri 6, 180 g'da 1,5 dakika eğdikten sonra, senkronize Edilmiş L-1 hayvanlarını tek tek NGM plakaları üzerinde yeni tohumlanmış OP50 çimlerine yerleştirin. Hayvanlar yaklaşık 42 saat sonra L-4 larva aşamasına ulaşana kadar plakaları 20 derecede tutun.Şu anda, L4 larvalarını mililitre başına 0,5 miligram FUdR içeren OP50 tohumlu NGM plakalarına taşımak için platin bir kazma kullanın. Sensör kartuşunu plakadaki her kuyuya 200 mikrolitre distile su ekleyerek nemlendirin ve sensör problarının batırılmasını sağlar. Tabakları gece boyunca oda sıcaklığında saklayın.Solunum arayüzündeki ısıtma elemanını kapatın. Makinenin 15 derecelik bir kuluçka makinesi içinde saklanması, makineiçindeki çekirdek sıcaklığını düşürür ve titre sırasında hayvanların aşırı ısınmasını önler. Bir gece kuluçkadan sonra, pipet dışarı ve sensör probları nemlendirmek için kullanılan distile su atmak ve her kuyuda kalibrant çözeltisi 200 mikrolitre ile değiştirin.FCCP stok çözeltisini distile suda 100 mikromolar FCCP'ye seyreltin. Ardından, sensör kartuşundaki enjeksiyon portu A'ya seyreltilmiş çözeltinin 20 mikrolitresini ekleyin. Sensör kartuşunun b enjeksiyon portuna 22 mikrolitre 400 milimolar sodyum azit ekleyin.Şimdi, solunum cihazını aç. Ana ekranda başlat'ı seçin ve şablon sayfaları görüntülenir. Şablonlar sayfasında boş"u veya önceden tasarlanmış bir şablonu seçin.Gruplar sayfası görüntülenir. Gruplar sayfasında, arka plan kuyuları olarak A ve H kuyularını seçin ve kalan altı kuyuyu deney planına göre uygun gruplara atayın. Sağ alttaki oku tıklatarak protokol sayfasına erişin ve bir ve iki düğmenin seçildiğinden emin olun.Bazal OCR okumalarının yanı sıra maksimum OCR ve mitokondriyal olmayan OCR okuma sayısını ayarlayın. Sağ alt köşedeki oku seçin. Sensör kartuş plakasını yüklemek için bir istem görüntülenir.Sensör kartuş plakasının, anımsatıcı ekranındaki talimatları izleyerek doğru yönde yüklendiğinden emin olun. Solunum cihazı artık kartuşun dengesini sağlayacaktır. Hücre plakasının sekiz kuyuve çevresindeki rezervuarların her birine 200 mikrolitre M9 tamponekleyin.Her bir suştan yaklaşık 100 solucanı tohumsuz NGM plakaları üzerine alın ve 2-3 dakika dinlendirin. Daha sonra, M9 tampon ile platin almak sonuna ıslak ve arka plan kuyuları A ve H boş bırakarak, G ile b kuyuları içine 20 yaş senkronize hayvanlar almak. Şimdi, kalibrasyon arabelleği içeren plakayı çıkarmak için solunum yazılımına Tamam'ı tıklayın.Sensörün kartuşunu cihazın içinde bırakarak plakayı solunum cihazından çıkarın. Kalibrant plakasını hayvanları içeren plakaile değiştirin. Plakaları yükleyin ve vurarak kapıyı kapatın devam edin ve tazyikin çalışmasına izin verin.Tdeneme çalışması tamamlandıktan sonra, hücre plakasını ve sensör kartuşu çıkarmak için ekrandaki istemleri izleyin. Çalışan veri savaş biçimini kaydetmek için USB bağlantı noktasına bir flash sürücü ekleyin. Sensör kartuşu çıkarın ve hayvanların yaklaşık iki dakika boyunca kuyuların dibine yerleşmesine izin verin.Hücre plakalarını stereo bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin ve her kuyudaki hayvan sayısını sayın. Oksijen tüketim oranlarını hayvan sayısına göre normalleştirmek için normalleştirme sekmesini izleyen analiz yazılımını açın. Değiştir sekmesi altındaki çeşitli gruplar için uygun düzeyleri uygulayın ve daha fazla analiz için dosyayı prizma dosyası olarak dışa aktarın.İlk beş ölçümün ortalaması bazal OCR'dir. FCCP ilavesi sonrası beş ölçümün ortalaması maksimal OCR'dir. Son olarak, sodyum azid ilavesi sonrası son beş ölçümün ortalaması mitokondriyal olmayan solunum oranıdır.Kalsiyum disregülasyonu mitokondriyal fonksiyonda değişikliğe neden olabileceğinden, sel-12 mutasyonlarının ve yabani tip hayvanlarda OCR ölçüldü ve sel-12 mutasyonlarının mitokondriyal fonksiyon ve sağlık üzerindeki etkisini incelemek için ölçüldü. Vahşi tip hayvanlar sürekli solucan başına, dakikada beş picomoles altında bazal OCR oranları gösterdi. Sel-12 mutantlarının üç suşları solucan başına dakikada yaklaşık yedi pikomoles, ocr önemli ölçüde yüksek gösterdi iken.FCCP eklenmesi üzerine, yabani tip OCR bir artış oldu, yanı sıra sel-12 mutantlar, beklendiği gibi. Yabani tip hayvanlar solucan başına dakikada yaklaşık yedi pikomoles maksimum OCR gösterdi. Sel-12 mutantları dakikada yaklaşık 10 pikomoles OCR iken, solucan başına.Bu teşrinde canlı, iyi beslenmiş ve senkronize edilmiş hayvanları kullanın ve yumurta veya leşlerin istinat kuyularına aktarılmasından kaçının. Ayrıca, cihazın iç sıcaklığı 25 santigrat dereceyi geçmemelidir. Çamaşır suyu, FCCP, FUdR ve sodyum azid toksiktir.Bu nedenle, stok çözümleri nin hazırlanması ve ilaç yüklemesi sırasında koruyucu eldiven takmaya özen verilmelidir.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

İzolasyon ve In vitro Etkinleştirme Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Biyoloji

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Katı Plaka tabanlı Diyet Kısıtlama Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

MRNA Çürüme Oranlarının Ölçümü<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</emKullanma&gt;<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Suşlar

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Miyokard Performans ve Oksijen Tüketimi İnceleme Kemirgen Çalışma Kalp Modeli

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

yetiştirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Laboratuvarı Üç boyutlu

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans de novo Protein Sentez Oranlarının Değerlendirilmesi

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...