Name: purification of the dendritic filopodia-rich fraction
Uploaded: 2019-05-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction at JoVE.com

نشكر شيجيو أوكابي وهيتومي ماتسونو على الثقافة المنخفضة الكثافة للخلايا العصبية في فرس النهر، وماسايوشي ميشينا للفئران التي تعاني من نقص في الـ TLCN، وساكيكو ميتسوي وموموكو شيوزاكي على المساعدة التقنية، وأعضاء مختبر يوشيهارا لإجراء مناقشات مفيدة . وقد حظي هذا العمل بدعم من اللجنة المشتركة بين الأفراد والرابطة. JP20700307, JP22700354, و JP24500392 وMEXT KAKENHI منحة Nos. JP23123525 إلى YF و JP20022046 و JP18H04683 و JP18H05146 إلى YY.

وقد تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها من RIKEN واكو.
1. ثقافة الخلايا العصبية فرس النهر
<ol><li>إعداد وسط الثقافة
	<ol>
<li>إعداد مزيج فيتامين 200x. حل 100 ملغ من حمض البانتوثيك ملح الهيميكالسيوم، 100 ملغ من كلوريد الك?...

<ol>
	<li>Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+via+dendritic+filopodia+in+developing+hippocampal+area+CA1.">Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).</li><li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Ziv, N. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+role+of+dendritic+filopodia+in+synaptogenesis+and+spine+formation.">Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation.</a> Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).</li><li>Lohmann, C., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+local+calcium+signaling+in+rapid+synaptic+partner+selection+by+dendritic+filopodia.">A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia.</a> Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).</li><li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+formation+and+stabilization.">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+human+and+mouse+postsynaptic+proteomes+finds+high+compositional+conservation+and+abundance+differences+for+key+synaptic+proteins.">Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins.</a> PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+proteome,+diseases+and+evolution+of+the+human+postsynaptic+density.">Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density.</a> Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+telencephalin+and+ERM+family+proteins+mediates+dendritic+filopodia+formation.">Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).</li><li>Mao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+Conduct+Target+Selection+in+Cortical+Neurons+Using+Differences+in+Signal+Kinetics+of+a+Single+Kinase.">Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase.</a> Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).</li><li>Matsuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin+slows+spine+maturation.">Telencephalin slows spine maturation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).</li><li>Raemaekers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-mediated+endosomal+transport+of+Telencephalin+affects+dendritic+filopodia-to-spine+maturation.">ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation.</a> The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).</li><li>Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalon-specific+antigen+identified+by+monoclonal+antibody.">Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).</li><li>Yoshihara, Y., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin:+a+neuronal+area+code+molecule?.">Telencephalin: a neuronal area code molecule?.</a> Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).</li><li>Annaert, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+telencephalin+and+the+amyloid+precursor+protein+predicts+a+ring+structure+for+presenilins.">Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins.</a> Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+induces+phosphorylation+of+ezrin/radixin/moesin+actin-binding+proteins+through+binding+to+its+novel+neuronal+receptor+telencephalin.">Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).</li><li>Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Actinin-dependent+cytoskeletal+anchorage+is+important+for+ICAM-5-mediated+neuritic+outgrowth.">alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).</li><li>Esselens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+1+mediates+the+turnover+of+telencephalin+in+hippocampal+neurons+via+an+autophagic+degradative+pathway.">Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway.</a> Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).</li><li>Furutani, Y., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+Dendritic+Filopodia-Rich+Fraction+Isolated+by+Telencephalin+and+Vitronectin+Interaction.">Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).</li><li>Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li><li>Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+the+C-terminal+domain+regulates+cell+surface+expression+of+the+NMDA+receptor+NR1+subunit.">Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).</li><li>Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+without+NMDA+receptor+function+in+culture.">Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture.</a> European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).</li></ol>

قمنا بتطوير طريقة تنقية للجزء الغنية بالفيلوبوديا الددرية باستخدام التقارب بين جزيء التصاق الخلية TLCN وبروتين بروتين فيترونيكستين المصفوفة خارج الخلية. بالمقارنة مع كسر PSD، يمكن أن يكون من الممكن تحديد البروتينات متشابك تعمل على متشابك غير ناضجة من الكسر الفيلوبوديا الدندي الغنية. وهكذا...

ويعتقد أن فيلبوديا الددرية هي سلائف العمود الفقري. خيوط أكتين في فيلوبوديا dendritic تنظيمتمديدها والتراجع 1،2،3. بعد الاتصال مع محور، فيلوبوديا dendritic مختارة تبدأ نضجها في العمود الفقري، ويتم تشكيل متشابك4،5. وقد تم تحديد مكونات العمود الفقري من التحليل الشامل للكسور الكثافة المشاركات6،7، في حين أن مكونات filopodia dendritic لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. وقد تبين أن telencephalin (TLCN)، ERM، SynGAP، راس، PI3 كيناز، Akt، mTOR، البولو مثل كيناز 2، CaMKII، syndecan-2، paralemin-1، ARF6، وEphB تنظيم تشكيل فيلبوديا dendritic5،8،9 ،10،11، في حين لم يتم تطوير طريقة للتحليل الشامل للجزيئات الموجودة في فيلبوديا dendritic.
يتم التعبير عن TLCN (ICAM-5) على وجه التحديد من قبل الخلايا العصبية الشائكة في الجزء الدماغ الأكثر rostral, وtelencephalon12. TLCN لديها 9 مجالات مثل Ig في منطقتها خارج الخلية، ومنطقة عبر الغشاء، والذيل السيتوبلازمي13. TLCN يربط إلى فيتورينيكستين (VN) وLFA-1 integrin في منطقتها خارج الخلية، إلى presenilin في منطقتها عبر الغشاء، وphospho-ERM وα-actinin في منطقتها السيتوبلازمية5،8،14،15 ،16. TLCN يربط إلى الهيكل السيتوني الأكتين من خلال PHOSPHo-ERM في نصائح من فيلبوديا dendritic وα-actinin في العمود الفقري ومهاوي dendritic8،16.
أظهرنا أن الإفراط في التعبير عن TLCN تعزيز تشكيل فيلبوديا dendritic وحفزت على إعادة العمود الفقري إلى filopodia10. الشكل التأسيسي النشط من ezrin ملزمة لمنطقة السيتوبلازمية TLCN وتعزيز تشكيل فيلبوديا dendritic8. وهكذا، ينظم TLCN تشكيل فيلبوديا الدندرية من خلال البروتينات الملزمة للأكتين. وقد أثبت Esselens وآخرون أن الخرز الصغير الناجم عن تراكم TLCN على الخلايا العصبية المستزرعة17. أظهرنا أن هياكل كأس phagocytic تشكلت على dendrites الخلايا العصبية حول الخرز الصغير المغلفة VN بطريقة تعتمد على TLCN15. مكونات فيلبوديا dendritic مماثلة لتلك التي من كأس phagocytic. من الصعب جمع فيلبوديا dendritic، ولكن من الأسهل نسبيا لجمع الكأس phagocytic باستخدام microbeads المغناطيسي. وهكذا، قمنا بتطوير طريقة لتنقية الكأس phagocytic بدلا من فيلبوديا dendritic18. هنا، ونحن نصف طريقة تنقية للجزء الفيلوبوديا الدندي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 ml Low Binding MCT</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>39640T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic cell culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-Actinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-9026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ezrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone3C12, SAB4200806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Galphaq</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>sc-393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>clone AP20, MAB3418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Moesin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone 38/87, M7060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLCbeta1</td>
			<td>Santacuz</td>
			<td>sc-5291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PSD95</td>
			<td>MA2</td>
			<td>ABR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Spectrin beta</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>0080085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08122.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chrolide, hydrous</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-19735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-6645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-T520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>i-Inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>Fuji Film</td>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>For detection of luminescence from WB membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic polystyrene microbeads</td>
			<td>Sperotech</td>
			<td>PM-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acid solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11130-051</td>
			<td>30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-slab size electrophoresis system</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>AE-6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin / Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Nacali</td>
			<td>28360-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R9504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain 2 Kit wako</td>
			<td>Wako</td>
			<td>291-5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1703940JA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>For production of ultra pure water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of the dendritic filopodia-rich fraction

فيلبوديا الددرية رقيقة وطويلة على أساس خيوط الأكتين، وأنها تمتد وتتراجع كما لو كان البحث عن محور الهدف. عندما ينشئ الفيلبوديا الددرية الاتصال مع محور الهدف، فإنها تبدأ في النضج في العمود الفقري، مما يؤدي إلى تشكيل متشابك. يتم توطين Telencephalin (TLCN) بوفرة في فيلوبوديا الددرية ويتم استبعاده تدريجيا من العمود الفقري. الإفراط في التعبير عن TLCN في الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة يحفز تشكيل فيلبوديا dendritic. أظهرنا أن التيلجيزين يرتبط بقوة بجزيء مصفوفة خارج الخلية، فيتورينيكستين. فيترونيكستين المغلفة microbeads الناجمة عن تشكيل كأس phagocytic على dendrites الخلايا العصبية. في الكأس phagocytic، TLCN، TLCN ملزمة البروتينات مثل الفسفوريلاتيد إزرين / راديكسين / موسين (فوسفو-ERM)، وF-أكتين تتراكم، مما يشير إلى أن مكونات الكأس phagocytic مماثلة لتلك التي من filopodia dendritic. وهكذا، قمنا بتطوير طريقة لتنقية الكأس phagocytic بدلا من فيلبوديا dendritic. كانت مغلفة الخرز البوليسترين المغناطيسي مع فيتوريتكن، الذي هو موجود بوفرة في وسط الثقافة من الخلايا العصبية فرس النهر والتي تحفز تشكيل كأس phagocytic على dendrites الخلايا العصبية. بعد 24 ساعة من الحضانة، كانت الكؤوس phagocytic الذوبان أقل ما يقال مع المنظفات وجمعها باستخدام فاصل المغناطيس. بعد غسل الخرز، تم تلطخ البروتينات الملزمة وتحليلها من قبل تلطيخ الفضة والنشاف الغربية. في الكسر ملزمة, [تلكن] و [أكتين] كان بوفرة حاضرة. وبالإضافة إلى ذلك، تم توطين العديد من البروتينات التي تم تحديدها من الكسر إلى فيلوبوديا الدندية. وهكذا، أطلقنا على الكسر الملزم كجزء غني بالفيلوبوديا الدندية. توضح هذه المقالة تفاصيل فيما يتعلق بطريقة تنقية للكسر الغنية بالفيلوبوديا dendritic.

في الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة، تم توطين TLCN بوفرة إلى فيلبوديا dendritic، رمح، وسوما وcolocalized مع F-actin (الشكل1A،B). عندما أضيفت microbeads البوليسترين إلى الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة، كانت مغلفة تلقائيا الخرز مع فيتورينيكستين (VN) المستمدة من ?...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction at JoVE.com

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

في هذا البروتوكول، نقدم طريقة لتنقية الكسر الغنية بالفيلوبوديا الدرورية من بنية البروز الشبيهة بالأكواب الفاغوية على الخلايا العصبية الفرسامة المستزرعة من خلال الاستفادة من التقارب المحدد والقوي بين الفيلوبودي الدندرية جزيء التصاق، TLCN، وجزيء مصفوفة خارج الخلية، فيتورينيكستين.

تنقية الكسر الدندي الغنية فيلبوديا

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

بالمقارنة مع جزء PSD، يمكن أن يكون من الممكن لتحديد البروتين متشابك تعمل على المشبك غير ناضجة حول الكسر فيلوبوديا الغنية. استخدمنا الخلايا العصبية الحية للحث على تشكيل قبعة البلعوم. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أن البروتين النشط في التكوين الاصطناعي يمكن تحديدها من الكسر الغني فيلوبوديا التشجر.للبدء، إعداد 200x فيتامين ميكس عن طريق حل 100 ملغ من فيتامين ب5, 100 ملغ من كلوريد الكولين, 100 ملغ من حمض الفوليك, 180 ملغ من I-إينوزيتول, 100 ملغ من فيتامين B3, 100 ملغ من فيتامين B6 هيدروكلوريد, و 100 ملغ من هيدروكلوريد الثيامين في 500 مل من الماء فائقة الخطورة باستخدام مزر المغناطيسي. خلط بعناية aliquot في أنابيب 50 مل وتخزينها في 20 درجة مئوية. لإعداد محلول الريبوفلافين، قم بحل 100 ملغ من الريبوفلافين في 500 ملغ من الماء فائق الخطورة باستخدام مُثير مغناطيسي.خلط aliquot بعناية في أنابيب 50 مل وتخزينها في 20 درجة مئوية. لتحضير 1 كلور كلوريد الكالسيوم المولر حل 7.35 غراما من تحلل كلوريد الكالسيوم في 50 مل من الماء فائقة الخطورة باستخدام مُثير مغناطيسي. للحد الأدنى من إعداد المتوسطة الأساسية حل 400 ملغ من كلوريد البوتاسيوم 6، 800 ملغ من كلوريد الصوديوم، 2، 200 ملغ من بيكربونات الصوديوم، 158 ملغ من الصوديوم فوسفات أحادية الصوديوم ثنائي هيدرويت، 7، 000 ملغ من د-جلوكوز، و 200 ملغ من كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدات، و 950 مل من الماء فائقة الخطورة، وذلك باستخدام مُثير مغناطيسي.بعد ذلك، استخدم ماصة 1 مل مع هياج مستمر على مُحرك مغناطيسي لإضافة 1.8 مل من 1 كلوري كلوريد الكالسيوم المولر إلى MEM بطريقة قطرة. ثم يضاف حمض الهيدروكلوريك لضبط درجة الحموضة في MEM إلى 7.25 درجة الحموضة. ثم, إضافة 5 مل من 200x مزيج فيتامين و 200 ميكرولترات من محلول الريبوفلافين إلى MEM.ضبط حجم حجم المحلل إلى 1000 مل مع الماء فائقة الpure. تصفية الحل باستخدام نظام مرشح 0.22 ميكرون وتخزينه في 4 درجات مئوية. لإعداد 10x DNase-1 حل الأسهم حل 100 ملغ من Dnase-1 في 12.5 مل من HBSS.تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرون، aliquot في أنابيب 1.5 مل، وتخزين الأنابيب في 20 درجة مئوية. ل Ara-C إعداد الأسهم حل 25 ملغ من آرا-C في 8.93 مل من الماء فائقة الpure. تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرون، aliquot في أنابيب 1.5ml، وتخزينها في 20 درجة مئوية.لإعداد وسط الطلاء، مزيج 1 مل من محلول MEM Amino Acid، 750 ميكرولترات من 1 مولر HEPES، 1 مل من B27، 125 ميكرولترات من 200 ملليمولار الجلوتامين، 250 ميكرولترات من البنسلين-ستربتوميسين، 2.5 مل من مصل البقر الجنيني، و 44.375 مل من MEM في أنبوب 50 مل. لإعداد وسيلة التوقف، مزيج 1 مل من محلول الأحماض الأمينية MEM، 750 ميكرولتر من 1 هبس مول، 5 مل من FBS، و 43.25 مل من MEM في أنبوب 50 مل. لإعداد HBSS، تستكمل مع HEPES 15 ملليمتر، مزيج 49.25 مل من HBSS، و 750 ميكرولترات من 1 مولر HEPES.لتحضير الأطباق المغلفة بولي-ل-ليسين، معطف 35 مم أطباق ثقافة الخلايا البلاستيكية مع 0.2 ملغ لكل مل من بولي-ل-ليسين هيدروبروميد ليوم واحد في 25 درجة مئوية. بعد ذلك، اغسل الأطباق بـ 2 مل من الماء فائق الخطورة ثلاث مرات وحضنها بـ 1.5 مل من Stop Medium عند 25 درجة مئوية حتى الاستخدام. احتضان فرس النهر تشريح في خليط يحتوي على 500 ميكرولترات كل من 2.5٪ التربسين و 10X Dnase-1 في HBSS تكملها 15 ملليمتر HEPES، درجة ح H 7.2، في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع الانفعالات كل 3 دقائق.ثم، نقل قرن آمون إلى 10 مل من وقف المتوسطة واحتضان في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق لactivate التربسين. المقبل، احتضان فرس النهر تشريح في 10 مل من محطة جديدة متوسطة في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. نقل فرس النهر إلى 10 مل من وقفة جديدة متوسطة واحتضان في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق أخرى.ثم، نقل قرن آمون في 900 ميكرولتررس من توقف المتوسطة و 100 ميكرولترات من 10X Dnase-1 في أنبوب 15 مل. استخدام ماصة 1 مل لتفكك قرن آمون في الخلايا العصبية المعزولة عن طريق الأنابيب 20 مرة. إضافة 9 مل من المتوسطة الطلاء، وتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون، في أنبوب 50 مل.عد عدد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيتات وضبط إلى 3.5 مرة 10 إلى الخلايا الرابعة لكل ملليلتر في وسط الطلاء. المقبل، التعرق وسيلة التوقف من الأطباق المغلفة بولي ل-lisine. لوحة 2 مل لكل طبق من الخلايا على الأطباق المغلفة واحتضان تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لمدة 60-64 ساعة.بعد الحضانة، إضافة 2 ميكرولتررس من Ara-C حل الأسهم إلى الخلايا العصبية ويهز الطبق ببطء. الحفاظ على أطباق الثقافة في مربع مرطب دون تغيير متوسط الثقافة تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية. تنقية الزجر فيلوبوديا الغنية بعد 13 يوما في المختبر عن طريق أول إضافة ثلاثة ملايين ميكروبات البوليسترين المغناطيسي في الطبق الواحد إلى 20 أطباق تحتوي على الخلايا العصبية المستزرعة.بعد يوم واحد، وغسل الخلايا العصبية في 1 مل من برنامج تلفزيوني مع ازاحة ثلاث مرات لإزالة الميكروبات المتوسطة وغير المنضمة. بعد إزالة برنامج تلفزيوني، lyse الخلايا العصبية مع 500 ميكرولتر في طبق من العازلة تحلل. المقبل، وجمع lysate مع مكشطة الخلية ونقل lysate في 10 منخفضة البروتين ربط الأنابيب الدقيقة.تعيين أنابيب على فصل المغناطيس والانتظار لمدة دقيقة واحدة. جمع نابيرانت واستخدامه كسر غير منضم للفضة تلطيخ وتحليل البقعة الغربية. بعد ذلك، نقل الخرز إلى ميكروتيتوب جديد منخفض البروتين ملزم وتعيين على فصل المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة.إزالة تماما من supernatant، وإضافة 500 ميكرولترات من العازلة تحلل. غسل الخرز باستخدام خلاط دوامة لمدة 15 ثانية. كرر غسل الخرز 10 مرات وإزالة افرنح.بروتينات elute وصولا الى الخرز عن طريق إضافة 50 ميكرولترات من 1X SDS عينة العازلة ويغلي الأنبوب في 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 860xG 3000 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان وتعيين أنبوب على منفصلة المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. جمع المابير واستخدامها كسر منضم.قياس تركيزات من غير منضمة ومقيدة البروتين الكسور من قبل BCA المقايسة البروتين. تصور حلول protien مع الأزرق البروموفينيل وضبط التركيز على 5 نانوغرام لكل ميكرولتر لصفحة SDS. فصل الكسور المنضمة وغير المنضمة بواسطة صفحة SDS باستخدام هلام متدرج بنسبة 5-20٪.الفضة تلطخ الجل. وأخيراً، لطخة غربية باستخدام أجسام مضادة أولية وثانوية مناسبة وفقاً للمخطوطة. في الخلايا العصبية فرس النهر مثقف, وكان موضعية بغزارة TLCN إلى فيلوبوديا التشعب, رمح, و سوما وشارك في ترجمة مع F-actin.كانت الخرز المشفرة مرتبطة بشكل رئيسي بالدنخ والحث على تكوين أكواب بتحريف من خلال تراكم TLCN و F-actin على dendrites العصبية. أظهرت صور Thorecense أن تشكيل كأس البلعومات كان يعتمد بشكل حاسم على وجود TLCN في dendrites. تم تشكيل الكؤوس البلعوية فقط على الخلايا العصبية فرس النهر من النوع البرية، ولكن ليس على TLCN defficient فرس النهر الخلايا العصبية.وأظهرت نتائج صفحة SDS أن أنماط نطاق البروتين كانت تقريبا هي نفسها بالنسبة للكسور غير المنضمة والمقيدة ولكن الكثافة في 50 و 70 كيلودالون، في الكسر المقيد كانت أقل من تلك الموجودة في الكسر غير المنضم. ومع ذلك ، فإن كثافة الفرقة لم تكن مختلفة بوضوح بين الكسور غير المقيدة والمضمونة المعدة من TLCN defficient الثقافة فرس النهر الخلايا العصبية. وأظهر تحليل البقعة الغربية للكسور غير المنضمة والمقيدة أن TLCN و VN تم اكتشافهما بشكل رئيسي في الكسر المقيد.اكتين، عزرين، G ألفا س، المجلس التشريعي الفلسطيني بيتا 1، MAP-2، وسبيكترين، تم الكشف عنها في كل من الكسور المنضمة وغير المنضمة. تم الكشف عن Moesin، PSD-95، ألفا-أكتينين، وألفا توبولين في الكسر غير المنضم. إذا تغير بروتين الطلاء من الميكروبات ، يمكن تطبيق هذا الإجراء لتحديد التفاعل الفحص.هذه التقنية يمكن أن تحدد البروتين العامل على المواد الاصطناعية. لذلك نعتقد أن الآلية التكوين الاصطناعي يمكن قياسها كميا. ونحن نعتقد أن البروتين الجديد المرتبطة بالاضطراب العقلي يمكن تحديدها من الكسر الكارني فيلوبوديا الغنية.ويمكن أن تمتد إلى العلاج.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

تحليل الصرف العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي لؤلؤ

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

حفز النمو في الخلايا العصبية شجيري متعاطف مثقف

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

على تحليل من الخليوي بركينيي علم الصرف شجيرى في الثقافات شريحة عضوي النمط

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

تقييم شجيري تشجر في التلفيف المسنن من منطقة الحصين في الفئران

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Purification of Mouse Brain Vessels

تنقية ماوس سفن الدماغ

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

تحليل الجذعية الصرف في الأعمدة والطبقات

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

تقييم التعقيد الجذعي الحصين في الفئران المسنين باستخدام طريقة جولجي-كوكس

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

في الوقت الحقيقي الرحلان الشاردي مع تيتراميثيلامونيوم لكمية حجم الكسر و تورتوسيتي من الدماغ خارج الخلية الفضاء

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

التحليل الكمي لتعقيد أربوريزاتيون الجذعية العصبية في المورفولوجية

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...