Name: purification of the dendritic filopodia-rich fraction
Uploaded: 2019-05-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction at JoVE.com

Vi takker Shigeo Okabe og Hitomi Matsuno for den lave-density kultur af hippocampus neuroner, Masayoshi Mishina for tlcn-mangelfulde mus, Sachiko Mitsui og Momoko shiozaki for teknisk assistance, og medlemmer af yoshihara laboratorium for nyttige diskussioner . Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI Grant NOS. JP20700307, JP22700354 og JP24500392 og MEXT KAKENHI Grant NOS. JP23123525 til YF og JP20022046, JP18H04683 og JP18H05146 til åå.

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af den institutionelle dyrepleje-og anvendelses Komité for RIKEN Wako.
1. kultur af hippocampus neuroner
<ol><li>Forberedelse af kulturmedium
	<ol>
<li>Fremstilling af 200x vitamin mix. Opløse 100 mg af D-pantothensyre hemicalcium salt, 100 mg cholinchlorid, 100 mg folinsyre, 180 mg af i-inositol, 100 mg af niacinamid, 100 mg af PYRIDOXAL HCl, og 100 mg thiamin HCL i 500 ml af ultrarent vand ved hjælp af en magnetisk ...

<ol>
	<li>Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+via+dendritic+filopodia+in+developing+hippocampal+area+CA1.">Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).</li><li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Ziv, N. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+role+of+dendritic+filopodia+in+synaptogenesis+and+spine+formation.">Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation.</a> Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).</li><li>Lohmann, C., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+local+calcium+signaling+in+rapid+synaptic+partner+selection+by+dendritic+filopodia.">A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia.</a> Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).</li><li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+formation+and+stabilization.">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+human+and+mouse+postsynaptic+proteomes+finds+high+compositional+conservation+and+abundance+differences+for+key+synaptic+proteins.">Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins.</a> PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+proteome,+diseases+and+evolution+of+the+human+postsynaptic+density.">Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density.</a> Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+telencephalin+and+ERM+family+proteins+mediates+dendritic+filopodia+formation.">Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).</li><li>Mao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+Conduct+Target+Selection+in+Cortical+Neurons+Using+Differences+in+Signal+Kinetics+of+a+Single+Kinase.">Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase.</a> Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).</li><li>Matsuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin+slows+spine+maturation.">Telencephalin slows spine maturation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).</li><li>Raemaekers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-mediated+endosomal+transport+of+Telencephalin+affects+dendritic+filopodia-to-spine+maturation.">ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation.</a> The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).</li><li>Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalon-specific+antigen+identified+by+monoclonal+antibody.">Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).</li><li>Yoshihara, Y., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin:+a+neuronal+area+code+molecule?.">Telencephalin: a neuronal area code molecule?.</a> Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).</li><li>Annaert, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+telencephalin+and+the+amyloid+precursor+protein+predicts+a+ring+structure+for+presenilins.">Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins.</a> Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+induces+phosphorylation+of+ezrin/radixin/moesin+actin-binding+proteins+through+binding+to+its+novel+neuronal+receptor+telencephalin.">Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).</li><li>Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Actinin-dependent+cytoskeletal+anchorage+is+important+for+ICAM-5-mediated+neuritic+outgrowth.">alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).</li><li>Esselens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+1+mediates+the+turnover+of+telencephalin+in+hippocampal+neurons+via+an+autophagic+degradative+pathway.">Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway.</a> Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).</li><li>Furutani, Y., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+Dendritic+Filopodia-Rich+Fraction+Isolated+by+Telencephalin+and+Vitronectin+Interaction.">Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).</li><li>Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li><li>Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+the+C-terminal+domain+regulates+cell+surface+expression+of+the+NMDA+receptor+NR1+subunit.">Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).</li><li>Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+without+NMDA+receptor+function+in+culture.">Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture.</a> European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).</li></ol>

Vi udviklede en rensningsmetode for dendritiske filopodia-rige fraktion ved hjælp af affinitet mellem celle adhæsions molekyle TLCN og det ekstracellulære matrix protein vitronectin. Sammenlignet med PSD-fraktion kunne det være muligt at identificere de synaptiske proteiner, der optræder på den umodne synapse fra den dendritiske filopodia-rige fraktion. Bestanddelene i den dendritiske filopodia-rige fraktion adskiller sig således fra dem i PSD-fraktionen med 74%. Forskellig fra PSD fraktion, vi brugte dyrkede hipp...

Dendritiske filopodia menes at være forløbere for spines. Actin filamenter i dendritiske filopodia regulerer deres forlængelse og tilbagetrækning1,2,3. Efter kontakt med en Axon begynder udvalgte dendritiske filopodia deres modning i spines, og en synapse dannes4,5. Komponenterne i Spiner er blevet fastlagt ud fra omfattende analyse af postsynaptiske massefylde fraktioner6,7, mens komponenterne i dendritiske filopodia er stort set ukendte. Det har vist sig, at telencepin (tlcn), ERM, syngap, RAS, PI3 kinase, akt, MTOR, Polo-like kinase 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, ARF6 og ephb regulerer dendritiske filopodia dannelse5,8,9 ,10,11, mens en metode ikke er blevet udviklet til den omfattende analyse af molekyler, der findes i dendritiske filopodia.
TLCN (ICAM-5) udtrykkes specifikt af spiny neuroner i det mest rostrale hjerne segment, telencephalon12. Tlcn har 9 IG-lignende domæner i sin ekstracellulære region, en transmembran region, og en cytoplasmisk hale13. Tlcn binder sig til vitronectin (vn) og LFA-1 anti i dets ekstracellulære region, til presenilin i dets transmembran-region, og til phospho-ERM og α-actinin i dets cytoplasmiske region5,8,14,15 ,16. Tlcn binder sig til det cytoskelet actin gennem fosho-ERM ved spidserne af dendritiske filopodia og α-actinin i spines og dendritiske aksler8,16.
Vi viste, at overekspression af TLCN forbedret dendritiske filopodia dannelse og induceret omversion af spines til filopodia10. Den konstitutive aktive form af PMS bundet til tlcn cytoplasmiske region og forbedret dendritiske filopodia dannelse8. Således regulerer TLCN dendritiske filopodia dannelse gennem actin bindende proteiner. Esselens et al. påviste, at mikroperler inducerede TLCN-akkumulering på dyrkede neuroner17. Vi viste, at fagocytiske Cup strukturer blev dannet på neuronal dendritter omkring VN-belagte mikroperler i en TLCN-afhængige måde15. Bestanddele af dendritiske filopodia svarer til de fagocytiske bæger. Det er svært at indsamle dendritiske filopodia, men det er relativt lettere at indsamle den fagocytiske kop ved hjælp af magnetiske mikroperler. Således udviklede vi en metode til at rense den fagocytiske kop i stedet for dendritiske filopodia18. Her beskriver vi rensningsmetoden for den dendritiske filopodia-rige fraktion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 ml Low Binding MCT</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>39640T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic cell culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-Actinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-9026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ezrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone3C12, SAB4200806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Galphaq</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>sc-393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>clone AP20, MAB3418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Moesin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone 38/87, M7060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLCbeta1</td>
			<td>Santacuz</td>
			<td>sc-5291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PSD95</td>
			<td>MA2</td>
			<td>ABR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Spectrin beta</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>0080085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08122.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chrolide, hydrous</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-19735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-6645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-T520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>i-Inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>Fuji Film</td>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>For detection of luminescence from WB membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic polystyrene microbeads</td>
			<td>Sperotech</td>
			<td>PM-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acid solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11130-051</td>
			<td>30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-slab size electrophoresis system</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>AE-6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin / Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Nacali</td>
			<td>28360-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R9504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain 2 Kit wako</td>
			<td>Wako</td>
			<td>291-5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1703940JA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>For production of ultra pure water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of the dendritic filopodia-rich fraction

Dendritiske filopodia er tynde og lange fremspring baseret på actin filament, og de udvider og trækker som om at søge efter et mål Axon. Når dendritiske filopodia etablerer kontakt med et mål Axon, begynder de at modnes i spines, hvilket fører til dannelsen af en synapse. Telencephalin (TLCN) er rigeligt lokaliseret i dendritiske filopodia og er gradvist udelukket fra spines. Overekspression af TLCN i dyrkede hippocampus neuroner inducerer dendritiske filopodia dannelse. Vi viste, at telencepin stærkt binder sig til en ekstracellulær matrix molekyle, vitronectin. Vitronectin-coatede mikroperler induceret Fagocytisk kop dannelse på neuronal dendritter. I fagocytic Cup akkumuleres tlcn-bindende proteiner såsom phosphoryleret Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM) og F-actin, hvilket tyder på, at komponenterne i det fagocytiske bæger ligner dem af dendritiske filopodia. Således udviklede vi en metode til rensning af den fagocytiske kop i stedet for dendritiske filopodia. Magnetiske polystyren perler blev belagt med vitronectin, som er rigeligt til stede i kulturen medium hippocampus neuroner og som inducerer Fagocytisk kop dannelse på neuronal dendritter. Efter 24 timers inkubation var de fagocytiske kopper mildt opløste med vaskemiddel og indsamlet ved hjælp af en magnet separator. Efter vask af perlerne blev de bindende proteiner elueret og analyseret ved sølvfarvning og vestlig blotting. I bindings brøken var TLCN og actin rigeligt til stede. Desuden blev mange proteiner identificeret fra fraktionen lokaliseret til dendritiske filopodia; således, vi navngiver bindende fraktion som dendritiske filopodia-rige fraktion. I denne artikel beskrives detaljer om rensningsmetoden for den dendritiske filopodia-rige fraktion.

I dyrkede hippocampus neuroner, TLCN var rigeligt lokaliseret til dendritiske filopodia, aksel, og Soma og colokeret med F-actin (figur 1a, B). Når polystyren mikroperler blev tilsat til dyrkede hippocampus neuroner, blev perlerne automatisk belagt med vitronectin (VN) afledt af føtal bovint serum (FBS) i dyrkningsmediet; de var hovedsageligt bundet til dendritter, og de inducerede dannelsen af fagocytiske kopper (figur...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction at JoVE.com

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

I denne protokol introducerer vi en metode til rensning af dendritiske filopodia-rige fraktion fra den fagocytiske Cup-lignende fremspringende struktur på dyrkede hippocampus neuroner ved at drage fordel af den specifikke og stærke affinitet mellem en dendritisk filopodial adhæsions molekyle, TLCN og et ekstracellulær matrix molekyle, vitronectin.

Rensning af den dendritiske Filopodia-rige fraktion

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Sammenlignet med PSD fraktion, kan det være muligt at identificere det synaptiske protein, der handler på den umodne synapse omkring dendritiske filopodia-rige fraktion. Vi brugte levende neuron til at fremkalde fagocytisk cap dannelse. Den største fordel ved denne teknik er, at aktivt protein i kunstige tilblivelse kunne identificeres fra dendritiske filopodia rige fraktion.Til at begynde, forberede 200x Vitamin Mix ved at opløse 100 mg vitamin B5, 100 mg cholinchlorid, 100 mg folinsyre, 180 mg I-inositol, 100 mg Vitamin B3, 100 mg Vitamin B6-hydrochlorid og 100 mg thiaminhydrorid i 500 ml ultrapurevand ved hjælp af en magnetomrører. Bland forsigtigt aliquot i 50 ml rør og opbevar det ved 20 grader Celsius. For at forberede riboflavin opløsning, opløses 100 mg riboflavin i 500 mg ultrapure vand ved hjælp af en magnetisk omrører.Bland forsigtigt aliquot i 50 ml rør og opbevares ved 20 grader Celsius. Til fremstilling af en molar calciumdichlorid opløses 7,35 gram calciumchloriddihydrat i 50 ml ultrarent vand ved hjælp af et magnetisk omrører. For minimum essentielt middelpræparat opløses 400 mg kaliumchlorid 6 800 mg sodumchlorid, 2, 200 mg natriumbikarbonat, 158 mg natriumphosphatmonobasic dihydrat, 7, 000 mg D-glucose og 200 mg magnesiumsulfat heptahydrat og 950 ml ultrapurtvand ved hjælp af en magnetomrører.Dernæst skal du bruge en 1 ml pipette med en konstant omrøring på en magnetisk omrører til at tilsætte 1,8 ml 1 molar calciumdichlorid til MEM i en dråbe for dråbe måde. Derefter tilsættes saltsyre for at justere pH-koncentrationen af MEM til pH 7,25. Derefter tilsættes 5 ml 200x vitamin mix og 200 mikroliter riboflavin opløsning til MEM.Opløsningens volumen justeres til 1000 ml med ultrarent vand. Filtrere opløsningen ved hjælp af en 0,22 mikron filter system og gemme den ved 4 grader Celsius. Til fremstilling af 10x DNase-1 stock opløsning opløses 100 mg Dnase-1 i 12,5 ml HBSS.Filtrer gennem et 0,22 mikron filter, aliquot i 1,5 ml rør, og opbevar rørene ved 20 grader Celsius. Til Ara-C-beholdning opløses 25 mg Ara-C i 8,93 ml ultrarent vand. Filter gennem en 0,22 mikron filter, aliquot i 1,5 ml rør, og opbevares ved 20 grader Celsius.For at forberede Plating Medium, 1 ml MEM Aminosyreopløsning, 750 mikroliter af 1 molar HEPES, 1 ml B27, 125 mikroliter af 200 millimolarglglamin, 250 mikroliter penicillin-streptomycin, 2,5 ml føtalt kvægserum og 44,375 ml MEM i et 50 ml tube. For at klargøre stopmediet blandes 1 ml MEM-aminosyreopløsning, 750 mikroliter af 1 molar HEPES, 5 ml FBS og 43,25 ml MEM i et 50 ml rør. Til fremstilling af HBSS, suppleret med 15 millimolar HEPES, blandes 49,25 ml HBSS og 750 mikroliter af 1 molar HEPES.Til fremstilling af poly-l-lysinbelagte retter, pels 35 mm plastcellekulturretter med 0,2 mg pr. ml poly-l-lysin hydrobromid for en dag ved 25 grader Celsius. Dernæst vaskes skålene med 2 ml ultrarent vand tre gange og inkuberes dem med 1,5 ml Stop Medium ved 25 grader Celsius, indtil det bruges. Inkubere de dissekerede hippocampi i en blanding, der indeholder 500 mikroliter hver af 2,5% trypsin og 10X Dnase-1 i HBSS suppleret med 15 millimolar HEPES, pH 7,2, ved 37 grader Celsius i 15 minutter med omrøring hvert 3 minut.Derefter overføre hippocampi til 10 ml af Stop Medium og inkubere ved 4 grader Celsius i 5 minutter for at inaktivere trypsin. Dernæst inkubere de dissekeret hippocampi i 10 ml frisk stop medium ved 4 grader Celsius i 5 minutter. Flyt hippocampi i 10 ml frisk stop medium og inkubere ved 4 grader Celsius i yderligere 5 minutter.Flyt derefter hippocampi i 900 mikroliter af stopmediet og 100 mikroliter på 10X Dnase-1 i et 15 ml rør. Brug en 1 ml pipette til at adskille hippocampi i isolerede neuroner ved pipettering 20 gange. Tilsæt 9 ml plating medium, og filtreres gennem en 70 mikron celle si, i en 50 ml rør.Tæl antallet af celler ved hjælp af et hæmocytometer og en justering til 3,5 gange 10 til de fjerde celler pr. milliliter i plating medium. Dernæst aspirere stopmediet fra poly-l-lisine belagte retter. Plade 2 ml pr fad af cellerne på de belagte retter og inkuberes under 5% kuldioxid ved 37 grader Celsius i 60-64 timer.Efter inkubationen tilsættes 2 mikroliter Ara-C-lageropløsning til neuronerne og ryst skålen langsomt. Hold kulturretterne i en befugtet kasse uden at ændre kulturmediet under 5% kuldioxid ved 37 grader Celsius. Rens dendritiske filopodia rige fraktion efter 13 dage in vitro ved først at tilføje tre millioner magnetiske polystyren mikroperler pr fad til 20 retter, der indeholder de dyrkede neuroner.Efter en dag vaskes neuronerne i 1 ml PBS med agiation tre gange for at fjerne de mellemstore og ubundne mikroperler. Efter fjernelse af PBS, lyse neuroner med 500 mikroliter pr fad af lysis buffer. Dernæst indsamles lysatet med en celleskraber og overføre lysatet i 10 lavproteinbindende mikrorør.Sæt rørene på en magnet adskille og vente i et minut. Saml supernatant og bruge det som ubundet fraktion for sølv farvning og vestlige blot analyse. Dernæst overføre perlerne til en ny lav protein bindende mikrorør og sæt på en magnetisk separatr i et minut.Fjern helt supernatanten, og tilsæt 500 mikroliter af lysisbufferen. Vask perlerne ved hjælp af en Vortex mixer i 15 sekunder. Gentag vask af perlerne 10 gange og fjern supernatant.Elute proteiner ned til perlerne ved tilsætning af 50 mikroliter af 1X SDS prøve buffer og kog røret ved 98 grader Celsius i 5 minutter. Centrifuge røret ved 860xG 3000 RPM i 10 sekunder og sæt røret på en magnetisk separatr i et minut. Saml supernatant og bruge det som den bundne fraktion.Indtag koncentrationerne af de ubundne og bundne proteinfraktioner ved hjælp af BCA-proteinanalysen. Visualiser protienopløsninger med bromophenylblå og juster koncentrationen til 5 nanogram pr. mikroliter til SDS-side. Adskærg de bundne og ubundne brøker efter SDS-side ved hjælp af en 5-20%gradientgel.Sølvplette gelen. Endelig western blot ved hjælp af passende primære og sekundære antistoffer i henhold til manuskriptet. I dyrkede hippocampale neuroner, var TLCN rigeligt lokaliseret til dendritiske filopodia, aksel, og soma og co-lokaliseret med F-actin.De kodede perler var hovedsageligt bundet til dendritter og fremkalde dannelsen af fagocytiske kopper ved akkumulering af TLCN og F-actin på neuronal dendritter. Thorecense billeder viste, at fagocytiske kop dannelse var afgørende afhængig af tilstedeværelsen af TLCN i dendritter. De fagocytiske kopper blev kun dannet på vilde type hippocampal neuroner, men ikke på TLCN defficient hippocampal neuroner.SDS-sideresultaterne viste, at proteinbåndmønstrene var næsten de samme for de ubundne og bundne fraktioner, men intensiteterne ved 50 og 70 kilodalton, i den bundne fraktion, var lavere end i den ubundne fraktion. Men bandet intensitet var ikke naturligvis forskellig mellem de ubundne og bundet fraktioner udarbejdet fra TLCN defficient kultur hippocampal neuroner. Western blot-analysen af de ubundne og bundne fraktioner viste, at TLCN og VN hovedsagelig blev påvist i den bundne fraktion.Actin, Ezrin, G alpha q, PLC beta 1, MAP-2 og Spectrin blev påvist i både de bundne og ubundne fraktioner. Moesin, PSD-95, alpha-Actinin og alpha-Tubulin blev opdaget i den ubundne fraktion. Hvis belægning protein af mikroperler ændre, denne procedure kan anvendes til at identificere assay interaktion.Denne teknik kunne identificere det protein, der virker på kunstige stoffer. Så vi mener, at mekanismen kunstig tilblivelse kan kvantificeres. Vi mener, at nyt protein forbundet med psykisk lidelse kan identificeres fra dendritiske filopodia-rige fraktion.Og kan udvides til terapi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Fremkalde dendritisvækst i dyrkede sympatiske neuroner

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Hurtig Mikro-iontophoresis af glutamat og GABA: et nyttigt redskab til Undersøge Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Vurdering af dendritiske arborization i gyrus dentatus i hippocampus-regionen i mus

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Oprensning af musehjerne Fartøjer

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analyse Dendritiske Morfologi i Kolonner og Lag

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Vurdering af hippocampal dendritisk kompleksitet hos gamle mus ved anvendelse af Golgi-Cox-metoden

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Real-time iontophorese med tetramethylammonium til kvantificering af volumen fraktion og tortuosity af hjernens ekstracellulære rum

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Kvantitativ analyse af Neuronal dendritiske Arborization kompleksitet i Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...