Name: purification of the dendritic filopodia-rich fraction
Uploaded: 2019-05-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction at JoVE.com

We bedanken Shigeo Okabe en Hitomi Matsuno voor de lage-densiteit cultuur van hippocampal neuronen, Masayoshi Mishina voor TLCN-deficiënte muizen, Sachiko Mitsui en Momoko Shiozaki voor technische assistentie, en leden van het Yoshihara laboratorium voor nuttige discussies . Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI Grant NOS. JP20700307, JP22700354 en JP24500392 en MEXT KAKENHI Grant NOS. JP23123525 naar YF en JP20022046, JP18H04683, en JP18H05146 naar YY.

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van RIKEN WAKO.
1. cultuur van Hippocampal neuronen
<ol><li>Bereiding van kweekmedium
	<ol>
<li>Bereiding van 200x vitamine mengsel. Los 100 mg van D-Pantotheenzuur hemicalcium zout, 100 mg choline chloride, 100 mg foliumzuur, 180 mg i-inositol, 100 mg niacinamide, 100 mg pyridoxal HCl, en 100 mg thiamine HCl in 500 mL ultrapuur water met behulp van een magnetische roerder. ...

<ol>
	<li>Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+via+dendritic+filopodia+in+developing+hippocampal+area+CA1.">Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).</li><li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Ziv, N. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+role+of+dendritic+filopodia+in+synaptogenesis+and+spine+formation.">Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation.</a> Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).</li><li>Lohmann, C., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+local+calcium+signaling+in+rapid+synaptic+partner+selection+by+dendritic+filopodia.">A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia.</a> Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).</li><li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+formation+and+stabilization.">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+human+and+mouse+postsynaptic+proteomes+finds+high+compositional+conservation+and+abundance+differences+for+key+synaptic+proteins.">Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins.</a> PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+proteome,+diseases+and+evolution+of+the+human+postsynaptic+density.">Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density.</a> Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+telencephalin+and+ERM+family+proteins+mediates+dendritic+filopodia+formation.">Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).</li><li>Mao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+Conduct+Target+Selection+in+Cortical+Neurons+Using+Differences+in+Signal+Kinetics+of+a+Single+Kinase.">Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase.</a> Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).</li><li>Matsuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin+slows+spine+maturation.">Telencephalin slows spine maturation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).</li><li>Raemaekers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-mediated+endosomal+transport+of+Telencephalin+affects+dendritic+filopodia-to-spine+maturation.">ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation.</a> The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).</li><li>Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalon-specific+antigen+identified+by+monoclonal+antibody.">Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).</li><li>Yoshihara, Y., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin:+a+neuronal+area+code+molecule?.">Telencephalin: a neuronal area code molecule?.</a> Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).</li><li>Annaert, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+telencephalin+and+the+amyloid+precursor+protein+predicts+a+ring+structure+for+presenilins.">Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins.</a> Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+induces+phosphorylation+of+ezrin/radixin/moesin+actin-binding+proteins+through+binding+to+its+novel+neuronal+receptor+telencephalin.">Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).</li><li>Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Actinin-dependent+cytoskeletal+anchorage+is+important+for+ICAM-5-mediated+neuritic+outgrowth.">alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).</li><li>Esselens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+1+mediates+the+turnover+of+telencephalin+in+hippocampal+neurons+via+an+autophagic+degradative+pathway.">Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway.</a> Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).</li><li>Furutani, Y., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+Dendritic+Filopodia-Rich+Fraction+Isolated+by+Telencephalin+and+Vitronectin+Interaction.">Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).</li><li>Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li><li>Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+the+C-terminal+domain+regulates+cell+surface+expression+of+the+NMDA+receptor+NR1+subunit.">Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).</li><li>Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+without+NMDA+receptor+function+in+culture.">Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture.</a> European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).</li></ol>

We ontwikkelden een zuiveringsmethode voor de dendritische filopodia-rijke fractie met behulp van affiniteit tussen de celadhesie molecule TLCN en het extracellulaire matrix eiwit vitronectine. Vergeleken met de PSD-Fractie, kan het mogelijk zijn om de synaptische eiwitten te identificeren die op de onrijpe Synapse van de dendritische filopodia-rijke fractie optreden. De bestanddelen van de dendritische filopodia-Rich fractie verschillen dus van die van de PSD-fractie met 74%. Anders dan PSD-Fractie, gebruikten we gekwee...

Dendritische filopodia wordt beschouwd als voorlopers van stekels. Actin filamenten in de dendritische filopodia reguleren hun verlenging en terugtrekking1,2,3. Na contact met een axon beginnen geselecteerde dendritische filopodia hun rijping in stekels en wordt een synaps gevormd op4,5. Componenten van stekels zijn vastgesteld aan de hand van een uitgebreide analyse van postsynaptische dichtheids fracties6,7, terwijl de componenten van dendritische filopodia grotendeels onbekend blijven. Het is aangetoond dat telencephalin (tlcn), ERM, syngap, ras, PI3 kinase, Akt, mtor, Polo-achtige kinase 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, en ephb reguleren dendritische filopodia vorming5,8,9 ,10,11, terwijl een methode niet is ontwikkeld voor de uitgebreide analyse van moleculen die in de dendritische filopodia aanwezig zijn.
Tlcn (ICAM-5) wordt specifiek uitgedrukt door stekelige neuronen in het meest rostrale migratoire hersen segment, de telencephalon12. TLCN heeft 9 Ig-achtige domeinen in de extracellulaire regio, een transmembraan regio, en een cytoplasmische staart13. Tlcn bindt aan vitronectine (VN) en LFA-1 integrine in zijn extracellulaire regio, aan presenilin in zijn transmembraan regio, en aan fosho-ERM en α-actinine in de cytoplasmische regio5,8,14,15 ,16. Tlcn bindt aan de actine cytoskelet via fosho-ERM op de uiteinden van dendritische filopodia en α-actinine in stekels en dendritische assen8,16.
We toonden aan dat overexpressie van tlcn verbeterde dendritische filopodia-formatie en de reversie van stekels veroorzaakte tot filopodia10. De constitutieve actieve vorm van Ezrin gebonden aan de TLCN cytoplasmatische regio en verbeterde dendritische filopodia formatie8. Zo reguleert TLCN de vorming van dendritische filopodia door middel van actin-bindende eiwitten. Esselens et al. heeft aangetoond dat microbeads de accumulatie van TLCN op gekweekte neuronen17induceerde. We toonden aan dat de fagocytische beker structuren werden gevormd op neuronale dendrites rond VN-gecoate microbeads in een TLCN-afhankelijke manier15. Bestanddelen van dendritische filopodia lijken op die van de phagocytische beker. Het is moeilijk om dendritische filopodia te verzamelen, maar het is relatief gemakkelijker om de phagocytische beker te verzamelen met behulp van magnetische microbeads. Zo ontwikkelden we een methode om de fagocytische beker te zuiveren in plaats van dendritische filopodia18. Hier beschrijven we de zuiveringsmethode voor de dendritische filopodia-rijke Fractie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 ml Low Binding MCT</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>39640T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic cell culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-Actinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-9026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ezrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone3C12, SAB4200806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Galphaq</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>sc-393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>clone AP20, MAB3418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Moesin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone 38/87, M7060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLCbeta1</td>
			<td>Santacuz</td>
			<td>sc-5291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PSD95</td>
			<td>MA2</td>
			<td>ABR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Spectrin beta</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>0080085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08122.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chrolide, hydrous</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-19735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-6645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-T520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>i-Inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>Fuji Film</td>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>For detection of luminescence from WB membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic polystyrene microbeads</td>
			<td>Sperotech</td>
			<td>PM-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acid solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11130-051</td>
			<td>30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-slab size electrophoresis system</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>AE-6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin / Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Nacali</td>
			<td>28360-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R9504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain 2 Kit wako</td>
			<td>Wako</td>
			<td>291-5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1703940JA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>For production of ultra pure water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of the dendritic filopodia-rich fraction

Dendritische filopodia zijn dunne en lange uitsteeksels op basis van de actine filament, en ze verlengen en intrekken alsof ze zoeken naar een doel-axon. Wanneer de dendritische filopodia contact leggen met een doel-axon, beginnen ze te rijpen in stekels, wat leidt tot de vorming van een synaps. Telencephalin (TLCN) is overvloedig gelokaliseerd in dendritische filopodia en wordt geleidelijk uitgesloten van stekels. Overexpressie van TLCN in gekweekte hippocampal neuronen induceert dendritische filopodia vorming. We toonden aan dat telencephalin sterk bindt aan een extracellulair matrix molecuul, vitronectine. Vitronectin-gecoate microbeads geïnduceerde fagocytische beker vorming op neuronale dendrieten. In de fagocytische beker worden TLCN, TLCN-bindende eiwitten zoals gefosforyleerd Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM) en F-actin verzameld, wat suggereert dat componenten van de phagocytische beker vergelijkbaar zijn met die van dendritische filopodia. Zo ontwikkelden we een methode voor het zuiveren van de fagocytische beker in plaats van dendritische filopodia. Magnetische polystyreen kralen werden bekleed met vitronectine, die overvloedig aanwezig is in het cultuurmedium van hippocampal neuronen en die fagocytische beker vorming op neuronale dendrieten induceert. Na 24 uur incubatie werden de fagocytische bekers mild gesolubiliseerd met wasmiddel en verzameld met behulp van een Magneet separator. Na het wassen van de kralen werden de bindende eiwitten geeluteerd en geanalyseerd door zilver kleuring en Western blotting. In de bindende fractie waren TLCN en actine overvloedig aanwezig. Bovendien werden veel eiwitten die uit de Fractie werden geïdentificeerd, gelokaliseerd in de dendritische filopodia; zo noemden we de bindende fractie als de dendritische filopodia-rijke Fractie. Dit artikel beschrijft de details met betrekking tot de zuiveringsmethode voor de dendritische filopodia-Rich Fractie.

In gekweekte hippocampal neuronen, TLCN was overvloedig gelokaliseerd aan de dendritische filopodia, schacht, en Soma en cogelokaliseerd met F-actin (Figuur 1a, B). Wanneer polystyreen microbeads werden toegevoegd aan gekweekte hippocampal neuronen, werden de parels automatisch bekleed met vitronectine (VN) afgeleid van foetaal runderserum (FBS) in het kweekmedium; ze waren voornamelijk gebonden aan dendrites, en ze veroorzaakte de vorming va...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction at JoVE.com

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

In dit protocol introduceren we een methode voor het zuiveren van de dendritische filopodia-rijke Fractie van de phagocytische beker-achtige uitsteeksel structuur op gekweekte hippocampal neuronen door gebruik te maken van de specifieke en sterke affiniteit tussen een dendritische filopodial adhesie molecuul, TLCN, en een extracellulaire matrix molecuul, vitronectine.

Zuivering van de dendritische Filopodia-rijke Fractie

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

In vergelijking met psd-fractie kan het mogelijk zijn om het synaptische eiwit te identificeren dat werkt op de onrijpe synaps rond de dendritische filopodia-rijke fractie. We gebruikten levend neuron om fagocytische cap vorming te induceren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat actief eiwit in kunstmatige ontstaan kan worden geïdentificeerd uit de dendritische filopodia rijke fractie.Om te beginnen, bereid 200x vitamine mix door het oplossen van 100 mg vitamine B5, 100 mg Choline Chloride, 100 mg foliumzuur, 180 mg I-inositol, 100 mg vitamine B3, 100 mg vitamine B6chloride hydro, en 100 mg thiaminechloride in 500 ml ultrazuiver water met behulp van een magnetische roerder. Meng aliquot voorzichtig in buizen van 50 ml en bewaar het op 20 graden Celsius. Voor het bereiden van riboflavine oplossing, los 100 mg riboflavine in 500 mg ultrazuiver water met behulp van een magnetische roerder.Meng aliquot voorzichtig in buizen van 50 ml en bewaar op 20 graden Celsius. Voor te bereiden een molaire calciumdichloride oplossen 7,35 gram calciumchloride dihydraat in 50 ml ultrazuiver water met behulp van een magnetische roerder. Los voor minimum essential medium preparaat 400 mg kaliumchloride 6 op; 800 mg sodumchloride, 2, 200 mg natriumbicarbonaat, 158 mg natriumfosfaatmonobasisch dihydraat, 7, 000 mg D-glucose en 200 mg magnesiumsulfaat heptahydraat en 950 ml ultrazuiver water, met behulp van een magnetische roerder.Gebruik vervolgens een pipet van 1 ml met een constante agitatie op een magnetische roerder om 1,8 ml calciumdichloride van 1 molaire calcium in een druppel voor druppel aan het MEM toe te voegen. Voeg vervolgens zoutzuur toe om de pH van het MEM aan te passen aan pH 7,25. Voeg vervolgens 5 ml vitaminemix van 200x en 200 microliter riboflavine aan het MEM toe.Stel het volume van de oplossing in op 1000 ml met ultrazuiver water. Filter de oplossing met een filtersysteem van 0,22 micron en bewaar deze op 4 graden Celsius. Voor de bereiding van 10x DNase-1 voorraadoplossing los 100 mg Dnase-1 op in 12,5 ml HBSS.Filtreer door een filter van 0,22 micron, aliquot in buizen van 1,5 ml en bewaar de buizen op 20 graden Celsius. Los voor Ara-C voorraadoplossing 25 mg Ara-C op in 8,93 ml ultrazuiver water. Filtreer door een filter van 0,22 micron, aliquot in 1,5 ml buizen en bewaar op 20 graden Celsius.Ter voorbereiding van het Plating Medium, meng 1 ml MEM Aminozuuroplossing, 750 microliter van 1 molaire HEPES, 1 ml B27, 125 microliter 200 millimolar glutamine, 250 microliter penicilline-streptomycine, 2,5 ml Fetal Bovine Serum en 44,375 ml MEM in een buis van 50 ml. Om het stopmedium voor te bereiden, meng je 1 ml MEM-aminozuuroplossing, 750 microliter van 1 molaire HEPES, 5 ml FBS en 43,25 ml MEM in een buis van 50 ml. Voor de bereiding van HBSS, aangevuld met 15 millimolar HEPES, meng 49,25 ml HBSS en 750 microliters van 1 kies HEPES.Voor poly-l-lysine gecoate gerechten bereiding, jas 35 mm plastic cel kweek gerechten met 0,2 mg per ml poly-l-lysine hydrobromide voor een dag op 25 graden Celsius. Was vervolgens de afwas met 2 ml ultrazuiver water drie keer en broed ze uit met 1,5 ml Stop Medium bij 25 graden Celsius tot gebruik. Incubeer de ontleed hippocampi in een mengsel met 500 microliters elk van 2,5% trypsine en 10X Dnase-1 in HBSS aangevuld met 15 millimolar HEPES, pH 7.2, bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten met agitatie om de 3 minuten.Breng de hippocampi vervolgens 5 minuten over op 10 ml van het stopmedium en broed op 4 graden Celsius om trypsine te inactiveren. Vervolgens, incubeer de ontleed hippocampi in 10 ml vers stopmedium bij 4 graden Celsius gedurende 5 minuten. Verplaats hippocampi in 10 ml vers stopmedium en incubbate nog 5 minuten bij 4 graden Celsius.Verplaats de hippocampi vervolgens in 900 microliter van het stopmedium en 100 microliter van 10X Dnase-1 in een buis van 15 ml. Gebruik een pipet van 1 ml om de hippocampi te scheiden in geïsoleerde neuronen door 20 keer te pipetten. Voeg 9 ml beplatingsmedium toe en filtreer door een 70 micron celzeef in een buis van 50 ml.Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer en een aanpassing tot 3,5 keer 10 tot de vierde cellen per milliliter in beplating medium. Vervolgens, aspirate het stopmedium van de poly-l-lisine gecoate gerechten. Plaat 2 ml per schotel van de cellen op de gecoate gerechten en incubeer onder 5%kooldioxide bij 37 graden Celsius gedurende 60-64 uur.Voeg na de incubatie 2 microliters Ara-C-voorraadoplossing toe aan de neuronen en schud de schotel langzaam. Bewaar de kweekgerechten in een bevochtigde doos zonder het kweekmedium onder de 5% kooldioxide te veranderen bij 37 graden Celsius. Zuiver de dendritische filopodia rijke fractie na 13 dagen in vitro door eerst drie miljoen magnetische polystyreen microbeads per gerecht toe te voegen aan 20 gerechten met de gekweekte neuronen.Na een dag, was de neuronen in 1 ml PBS met agiatie drie keer om de medium en ongebonden microbeads te verwijderen. Na het verwijderen van PBS, lyse de neuronen met 500 microliter per schotel van de lyse buffer. Verzamel vervolgens het lysaat met een celschraper en breng het lysaat over in 10 eiwitarme bindende microbuisjes.Zet de buizen op een magneet separater en wacht een minuut. Verzamel de supernatant en gebruik het als de niet-gebonden fractie voor zilver vlekken en westerse vlek analyse. Breng de kralen vervolgens over naar een nieuwe eiwitarme bindende microbuis en zet ze een minuut op een magnetische separater.Verwijder de supernatant volledig en voeg 500 microliter van de lysebuffer toe. Was de kralen met behulp van een Vortex mixer gedurende 15 seconden. Herhaal het wassen van de kralen 10 keer en verwijder de supernatant.Elute eiwitten tot aan de kralen door de toevoeging van 50 microliters van 1X SDS monster buffer en kook de buis op 98 graden Celsius gedurende 5 minuten. Centrifuge de buis op 860xG 3000 RPM gedurende 10 seconden en zet de buis op een magnetische separater voor een minuut. Verzamel de supernatant en gebruik het als de gebonden fractie.Meet de concentraties van de niet-gebonden eiwitfracties door de BCA-eiwittest. Visualiseer protien-oplossingen met bromfylblauw en pas de concentratie aan op 5 nanogram per microliter voor SDS-pagina. Scheid de gebonden en niet-gebonden breuken per SDS-pagina met behulp van een verloopgel van 5-20%.Zilver vlek de gel. Ten slotte, westerse vlek met behulp van de juiste primaire en secundaire antilichamen volgens het manuscript. In gekweekte hippocampal neuronen, TLCN was overvloedig gelokaliseerd om de dendritische filopodia, schacht, en soma en co-gelokaliseerd met F-actine.De gecodeerde kralen waren voornamelijk gebonden aan dendrieten en induceren de vorming van fagocytische bekers door accumulatie van TLCN en F-actin op neuronale dendrieten. Thorecense beelden toonden aan dat fagocytische bekervorming was van cruciaal belang afhankelijk van de aanwezigheid van TLCN in dendrieten. De fagocytische cups werden alleen gevormd op wilde type hippocampal neuronen, maar niet op TLCN defficient hippocampal neuronen.SDS pagina resultaten toonden aan dat de eiwit band patronen waren bijna hetzelfde voor de niet-gebonden en gebonden fracties, maar de intensiteiten op 50 en 70 kilodalton, in de gebonden fractie waren lager dan die in de niet-gebonden fractie. Echter, de band intensiteit was niet duidelijk verschillend tussen de niet-gebonden en gebonden fracties bereid van TLCN defficient cultuur hippocampal neuronen. Uit de westerse vlekanalyse van de niet-gebonden en gebonden fracties bleek dat TLCN en VN vooral in de gebonden fractie werden gedetecteerd.Actin, Ezrin, G alpha q, PLC beta 1, MAP-2 en Spectrin, werden gedetecteerd in zowel de gebonden als niet-gebonden fracties. Moesin, PSD-95, alpha-Actinin en alpha-Tubulin werden in de niet-gebonden fractie gedetecteerd. Als coatingeiwit van de microbeads verandert, kan deze procedure worden toegepast om de interactie met de test te identificeren.Deze techniek kan het eiwit identificeren dat op kunstmatige stoffen werkt. Dus we geloven dat mechanisme kunstmatige ontstaan kan worden gekwantificeerd. Wij geloven dat nieuwe eiwitten geassocieerd met psychische stoornis kan worden geïdentificeerd uit de dendritische filopodia-rijke fractie.En kan worden uitgebreid tot de therapie.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Analyse van de dendritische Spine Morfologie in gekweekte CNS Neuronen

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Het induceren van dendritische groei in gekweekte sympathische neuronen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

De Analyse van de Purkinje cel dendritische morfologie in organotypische slice culturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snel Micro-iontoforese van glutamaat en GABA: een nuttig instrument om Synaptic Integratie Onderzoek

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Beoordeling van Dendritische arborization in de gyrus dentatus van de hippocampus regio in Muizen

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Zuivering van Mouse Brain Schepen

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Het analyseren van dendrietmorfologie in Kolommen en Lagen

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Beoordeling van Hippocampale Dendritische Complexiteit in Oude Muizen Met behulp van de Golgi-Cox Methode

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Real-time iontophorese met tetramethylammonium om volume-fractie en tortuositeit van de extracellulaire ruimte van de hersenen te kwantificeren

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Kwantitatieve analyse van neuronale dendritische Arborization complexiteit in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...