Name: purification of the dendritic filopodia-rich fraction
Uploaded: 2019-05-02T13:30:00
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Nous remercions Shigeo Okabe et Hitomi Matsuno pour la culture de faible densité des neurones hippocampiques, Masayoshi Mishina pour les souris déficientes TLCN, Sachiko Mitsui et Momoko Shiozaki pour l'assistance technique, et les membres du laboratoire Yoshihara pour des discussions utiles . Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI Grant Nos. JP20700307, JP22700354, et JP24500392 et MEXT KAKENHI Grant Nos. JP23123525 à YF et JP20022046, JP18H04683, et JP18H05146 à YY.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de RIKEN Wako.
1. Culture des neurones hippocampiques
<ol><li>Préparation du milieu de culture
	<ol>
<li>Préparation du mélange de vitamine 200x. Dissoudre 100 mg de sel hémicalcium acide D-pantothénique, 100 mg de chlorure de choline, 100 mg d'acide folique, 180 mg d'i-inositol, 100 mg de niiacinamide, 100 mg de HCl pyridoxal et 100 mg de thiamin...

<ol>
	<li>Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+via+dendritic+filopodia+in+developing+hippocampal+area+CA1.">Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).</li><li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Ziv, N. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+role+of+dendritic+filopodia+in+synaptogenesis+and+spine+formation.">Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation.</a> Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).</li><li>Lohmann, C., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+local+calcium+signaling+in+rapid+synaptic+partner+selection+by+dendritic+filopodia.">A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia.</a> Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).</li><li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+formation+and+stabilization.">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+human+and+mouse+postsynaptic+proteomes+finds+high+compositional+conservation+and+abundance+differences+for+key+synaptic+proteins.">Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins.</a> PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+proteome,+diseases+and+evolution+of+the+human+postsynaptic+density.">Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density.</a> Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+telencephalin+and+ERM+family+proteins+mediates+dendritic+filopodia+formation.">Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).</li><li>Mao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+Conduct+Target+Selection+in+Cortical+Neurons+Using+Differences+in+Signal+Kinetics+of+a+Single+Kinase.">Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase.</a> Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).</li><li>Matsuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin+slows+spine+maturation.">Telencephalin slows spine maturation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).</li><li>Raemaekers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-mediated+endosomal+transport+of+Telencephalin+affects+dendritic+filopodia-to-spine+maturation.">ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation.</a> The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).</li><li>Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalon-specific+antigen+identified+by+monoclonal+antibody.">Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).</li><li>Yoshihara, Y., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin:+a+neuronal+area+code+molecule?.">Telencephalin: a neuronal area code molecule?.</a> Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).</li><li>Annaert, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+telencephalin+and+the+amyloid+precursor+protein+predicts+a+ring+structure+for+presenilins.">Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins.</a> Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+induces+phosphorylation+of+ezrin/radixin/moesin+actin-binding+proteins+through+binding+to+its+novel+neuronal+receptor+telencephalin.">Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).</li><li>Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Actinin-dependent+cytoskeletal+anchorage+is+important+for+ICAM-5-mediated+neuritic+outgrowth.">alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).</li><li>Esselens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+1+mediates+the+turnover+of+telencephalin+in+hippocampal+neurons+via+an+autophagic+degradative+pathway.">Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway.</a> Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).</li><li>Furutani, Y., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+Dendritic+Filopodia-Rich+Fraction+Isolated+by+Telencephalin+and+Vitronectin+Interaction.">Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).</li><li>Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li><li>Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+the+C-terminal+domain+regulates+cell+surface+expression+of+the+NMDA+receptor+NR1+subunit.">Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).</li><li>Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+without+NMDA+receptor+function+in+culture.">Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture.</a> European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).</li></ol>

Nous avons développé une méthode de purification pour la fraction dendritique filopodia-riche en utilisant l'affinité entre la molécule d'adhérence cellulaire TLCN et la protéine extracellulaire de protéine vitronectin. Par rapport à la fraction DEP, il pourrait être possible d'identifier les protéines synaptiques agissant sur la synapse immature de la fraction dendritique filopodia-riche. Ainsi, les constituants de la fraction dendritique filopodia-riche sont différents de ceux de la fraction PSD par 74%. Di...

La filodée dendritique sont considérées comme des précurseurs des épines. Les filaments d'actine dans la filopodia dendritique règlent leur extension et rétractation1,2,3. Après contact avec un axone, la filodée dendritique sélectionnée commence leur maturation dans les épines, et une synapse est formée4,5. Les composants des épines ont été déterminés à partir de l'analyse complète des fractions de densité postsynaptic6,7, tandis que les composants de la filodée dendritique restent largement inconnus. Il a été démontré que la télencéphaline (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 kinase, Akt, mTOR, polo-like kinase 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, et EphB régulent la formation de filopodia dendritique5,8,9 ,10,11, alors qu'une méthode n'a pas été développée pour l'analyse complète des molécules présentes dans la filodée dendritique.
TLCN (ICAM-5) est spécifiquement exprimé par les neurones épineux dans le segment le plus rostral du cerveau, le telencephalon12. TLCN a 9 domaines Ig-like dans sa région extracellulaire, une région transmembrane, et une queue cytoplasmique13. TLCN lie à la vitronectin (VN) et LFA-1 integrin dans sa région extracellulaire, à la présénilin e dans sa région transmembrane, et à la phospho-ERM et à l'actinine dans sa région cytoplasmique5,8,14,15 ,16. TLCN se lie au cytosquelette d'actine par phospho-ERM aux extrémités de la filodée dendritique et de l'actinine dans les épines et les arbres dendritiques8,16.
Nous avons montré que la surexpression de TLCN a amélioré la formation de filopodia dendritique et a induit le retour des épines à la filopodia10. La forme active constitutive de l'ezrin lié à la région cytoplasmiquede TLCN et la formation améliorée de filopodia dendritique 8. Ainsi, TLCN régule la formation de filopodia dendritique par des protéines actin-contraignantes. Esselens et coll. ont démontré que les microbilles induisaient l'accumulation de TLCN sur les neurones cultivés17. Nous avons montré que les structures phagocytiques de tasse ont été formées sur les dendrites neuronales autour des microbilles VN-enduites dans une manière TLCN-dépendante15. Les constituants de la filodée dendritique sont semblables à ceux de la tasse phagocytique. Il est difficile de recueillir la filodée dendritique, mais il est relativement plus facile de recueillir la tasse phagocytique à l'aide de microbilles magnétiques. Ainsi, nous avons développé une méthode pour purifier la tasse phagocytique au lieu de filopodia dendritique18. Ici, nous décrivons la méthode de purification pour la fraction dendritique filopodia-riche.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 ml Low Binding MCT</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>39640T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic cell culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-Actinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-9026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ezrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone3C12, SAB4200806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Galphaq</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>sc-393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>clone AP20, MAB3418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Moesin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone 38/87, M7060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLCbeta1</td>
			<td>Santacuz</td>
			<td>sc-5291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PSD95</td>
			<td>MA2</td>
			<td>ABR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Spectrin beta</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>0080085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08122.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chrolide, hydrous</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-19735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-6645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-T520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>i-Inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>Fuji Film</td>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>For detection of luminescence from WB membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic polystyrene microbeads</td>
			<td>Sperotech</td>
			<td>PM-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acid solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11130-051</td>
			<td>30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-slab size electrophoresis system</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>AE-6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin / Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Nacali</td>
			<td>28360-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R9504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain 2 Kit wako</td>
			<td>Wako</td>
			<td>291-5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1703940JA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>For production of ultra pure water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of the dendritic filopodia-rich fraction

La filodée dendritique sont des saillies minces et longues basées sur le filament d'actine, et elles s'étendent et se rétractent comme si la recherche d'un axone cible. Lorsque la filodée dendritique établir le contact avec un axone cible, ils commencent à mûrir dans les épines, conduisant à la formation d'une synapse. La télencéphale (TLCN) est abondamment localisée dans la filodée dendritique et est progressivement exclue des épines. La surexpression de TLCN dans les neurones hippocampiques cultivés induit la formation de filopodia dendritique. Nous avons montré que la téencéphale se lie fortement à une molécule de matrice extracellulaire, la vitronectin. Les microbilles vitronectin-enduites ont induit la formation phagocytic de tasse sur les dendrites neuronales. Dans la tasse phagocytique, TLCN, les protéines tlcN-contraignantes telles que l'Ezrin/Radixin/Moesin phosphorylé (phospho-ERM), et F-actine sont accumulées, ce qui suggère que les composants de la tasse phagocytique sont semblables à ceux de la filodasie dendritique. Ainsi, nous avons développé une méthode pour purifier la tasse phagocytique au lieu de filopodia dendritique. Des perles magnétiques de polystyrène ont été enduites avec la vitronectin, qui est abondamment présente dans le milieu de culture des neurones hippocampiques et qui induit la formation phagocytic de tasse sur les dendrites neuronales. Après 24 h d'incubation, les tasses phagocytiques ont été légèrement solubilisées avec le détergent et rassemblées utilisant un séparateur d'aimant. Après avoir lavé les perles, les protéines de liaison ont été élucées et analysées par la coloration argentée et le ballonnement occidental. Dans la fraction contraignante, Le TLCN et l'actine étaient très présents. En outre, beaucoup de protéines identifiées de la fraction ont été localisées à la filopodia dendritique ; ainsi, nous avons nommé la fraction de liaison comme la fraction dendritique filopodia-riche. Cet article décrit des détails concernant la méthode de purification pour la fraction dendritique filopodia-riche.

Dans les neurones hippocampiques cultivés, TLCN a été abondamment localisé à la filodée dendritique, l'arbre, et le soma et colocalisé avec F-actin (Figure 1A, B). Lorsque des microbilles de polystyrène ont été ajoutées aux neurones hippocampiques cultivés, les perles ont été automatiquement enduites de vitronectin (VN) dérivée du sérum bovin foetal (FBS) dans le milieu de culture; ils étaient principalement liés à des den...

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Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dans ce protocole, nous introduisons une méthode pour purifier la fraction dendritique filopodia-riche de la structure phagocytic de la coupe-comme la saillie sur les neurones hippocampiques cultivés en profitant de l'affinité spécifique et forte entre un filopodial dendritique la molécule d'adhérence, TLCN, et une molécule extracellulaire de matrice, vitronectin.

Purification de la Fraction dendritique filopodia-riche

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Comparé à la fraction de PSD, il peut être possible d’identifier la protéine synaptique agissant sur la synapse immature autour de la fraction filopodia-riche dendritique. Nous avons utilisé le neurone vivant pour induire la formation phagocytique de chapeau. Le principal avantage de cette technique est que la protéine active dans la genèse artificielle pourrait être identifiée à partir de la fraction riche en filopodes dendritiques.Pour commencer, préparer 200x Vitamin Mix en dissolvant 100 mg de vitamine B5, 100 mg de chlorure de choline, 100 mg d’acide folique, 180 mg d’i-inositol, 100 mg de vitamine B3, 100 mg d’hydrochlorure de vitamine B6 et 100 mg d’hydrochlorure de thiamine dans 500 ml d’eau ultrapure à l’aide d’un agitateur magnétique. Mélanger délicatement l’aliquot dans des tubes de 50 ml et le conserver à 20 degrés Celsius. Pour préparer la solution riboflavine, dissoudre 100 mg de riboflavine dans 500 mg d’eau ultrapure à l’aide d’un agitateur magnétique.Mélanger délicatement l’aliquot dans des tubes de 50 ml et les conserver à 20 degrés Celsius. Pour préparer un dichloride de calcium molaire dissoudre 7,35 grammes de chlorure de calcium dihydrate dans 50 ml d’eau ultrapure à l’aide d’un agitateur magnétique. Pour la préparation moyenne essentielle minimale dissoudre 400 mg de chlorure de potassium 6, 800 mg de chlorure de sodum, 2 200 mg de bicarbonate de sodium, 158 mg de dihydrate monobasique de phosphate de sodium, 7 000 mg de D-glucose et 200 mg d’héptahydrate de sulfate de magnésium, et 950 ml d’eau ultrapure, à l’aide d’un agitateur magnétique.Ensuite, utilisez une pipette de 1 ml avec une agitation constante sur un agitateur magnétique pour ajouter 1,8 ml de 1 dichloride de calcium molaire au MEM d’une manière goutte par goutte. Ajouter ensuite l’acide chlorhydrique pour ajuster le pH du MEM au pH 7,25. Ensuite, ajoutez 5 ml de mélange vitaminique 200x et 200 microlitres de solution riboflavine au MEM.Ajuster le volume du volume de la solution à 1000 ml avec de l’eau ultrapure. Filtrez la solution à l’aide d’un système de filtre de 0,22 micron et stockez-la à 4 degrés Celsius. Pour préparer 10x DNase-1 solution stock dissoudre 100 mg de Dnase-1 dans 12,5 ml de HBSS.Filtrer à travers un filtre de 0,22 micron, aliquot dans des tubes de 1,5 ml, et stocker les tubes à 20 degrés Celsius. Pour la préparation de solution de stock Ara-C dissoudre 25 mg d’Ara-C dans 8,93 ml d’eau ultrapure. Filtrer à travers un filtre de 0,22 micron, aliquot dans des tubes de 1,5 ml, et stocker à 20 degrés Celsius.Pour préparer le support de placage, mélanger 1 ml de solution d’acides aminés MEM, 750 microlitres de 1 molaire HEPES, 1 ml de B27, 125 microlitres de glutamine de 200 millimolaires, 250 microlitres de pénicilline-streptomycine, 2,5 ml de sérum bovin fœtal et 44,375 ml de MEM dans un tube de 50 ml. Pour préparer l’arrêt moyen, mélanger 1 ml de solution d’acides aminés MEM, 750 microlitres de 1 molaire HEPES, 5 ml de FBS et 43,25 ml de MEM dans un tube de 50 ml. Pour préparer le HBSS, complété par 15 millimolar HEPES, mélanger 49,25 ml de HBSS, et 750 microlitres de 1 molaire HEPES.Pour la préparation des plats enrobés de poly-l-lysine, enrober les plats de culture cellulaire en plastique de 35 mm de 0,2 mg par ml d’hydrobromide poly-l-lysine pendant une journée à 25 degrés Celsius. Ensuite, lavez la vaisselle avec 2 ml d’eau ultrapure trois fois et incubez-les avec 1,5 ml d’arrêt moyen à 25 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Incuber l’hippocampe disséqué dans un mélange contenant 500 microlitres chacun de 2,5% trypsine et 10X Dnase-1 en HBSS complété par 15 millimolar HEPES, pH 7,2, à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes avec agitation toutes les 3 minutes.Ensuite, transférez l’hippocampe à 10 ml du Stop Medium et incubez à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes pour inactiver la trypsine. Ensuite, incuber l’hippocampe disséqué dans 10 ml d’arrêt frais moyen à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Déplacez l’hippocampe dans 10 ml de milieu d’arrêt frais et incubez à 4 degrés Celsius pendant encore 5 minutes.Ensuite, déplacez l’hippocampe en 900 microlitres du milieu d’arrêt et 100 microlitres de 10X Dnase-1 dans un tube de 15 ml. Utilisez une pipette de 1 ml pour dissocier l’hippocampe en neurones isolés en pipetting 20 fois. Ajouter 9 ml de platage moyen et filtrer à travers une passoire cellulaire de 70 microns dans un tube de 50 ml.Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’un ajustement à 3,5 fois 10 à la quatrième cellule par millilitre dans le milieu de placage. Ensuite, aspirez le milieu d’arrêt des plats enrobés de poly-l-lisine. Assiette 2 ml par plat des cellules sur les plats enduits et incuber sous 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 60-64 heures.Après l’incubation, ajouter 2 microlitres de solution de stock Ara-C aux neurones et secouer le plat lentement. Gardez les plats de culture dans une boîte humidifiée sans changer le milieu de culture sous 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Purifier la fraction riche en filopodes dendritiques après 13 jours in vitro en ajoutant d’abord trois millions de microbilles magnétiques de polystyrène par plat à 20 plats contenant les neurones cultivés.Après une journée, laver les neurones dans 1 ml de PBS avec agiation trois fois pour enlever les microbilles moyennes et non liées. Après avoir enlevé PBS, lyse les neurones avec 500 microlitres par plat du tampon de lyse. Ensuite, recueillir le lysate à l’aide d’un grattoir cellulaire et transférer le lysate en 10 microtubes liant les protéines faibles.Placez les tubes sur un séparateur d’aimant et attendez une minute. Recueillir le supernatant et l’utiliser comme la fraction non lié pour la coloration d’argent et l’analyse des taches occidentales. Ensuite, transférez les perles sur un nouveau microtube liant à faible teneur en protéines et placez-les sur un séparateur magnétique pendant une minute.Retirez complètement le supernatant et ajoutez 500 microlitres du tampon de lyse. Laver les perles à l’aide d’un mélangeur Vortex pendant 15 secondes. Répétez le lavage des perles 10 fois et retirez le surnatant.Protéines elute jusqu’aux perles par l’ajout de 50 microlitres de tampon échantillon 1X SDS et faire bouillir le tube à 98 degrés Celsius pendant 5 minutes. Centrifugez le tube à 860xG 3000 RPM pendant 10 secondes et réglez le tube sur un séparateur magnétique pendant une minute. Recueillir le supernatant et l’utiliser comme la fraction liée.Mesurer les concentrations des fractions de protéines non liées et liées par l’analyse des protéines BCA. Visualisez les solutions protien avec du bleu bromophényl et ajustez la concentration à 5 nanogrammes par microlitre pour la page SDS. Séparez les fractions liées et non liées par page SDS à l’aide d’un gel de gradient de 5 à 20 %.L’argent tache le gel. Enfin, tache occidentale utilisant des anticorps primaires et secondaires appropriés selon le manuscrit. Dans les neurones hippocampaux cultivés, TLCN a été abondamment localisé à la filopodia dendritique, arbre, et soma et co-localisé avec F-actin.Les perles codées étaient principalement liées aux dendrites et induisent la formation de tasses phagocytiques par accumulation de TLCN et de F-actin sur les dendrites neuronaux. Les images de Thorecense ont montré que la formation phagocytique de tasse était crucialement dépendante de la présence de TLCN dans les dendrites. Les tasses phagocytiques ont été formées seulement sur les neurones hippocampal sauvages de type, mais pas sur les neurones hippocampal déficients de TLCN.Les résultats de la page SDS ont montré que les modèles de bande protéique étaient presque les mêmes pour les fractions non liées et liées, mais les intensités à 50 et 70 kilodalton, dans la fraction liée étaient inférieures à celles de la fraction non liée. Cependant, l’intensité de la bande n’était évidemment pas différente entre les fractions non liées et liées préparées à partir de neurones hippocampaux de culture déficients TLCN. L’analyse occidentale de tache des fractions non liées et liées a prouvé que TLCN et VN ont été principalement détectés dans la fraction liée.Actin, Ezrin, G alpha q, PLC beta 1, MAP-2 et Spectrin ont été détectés dans les fractions liées et non liées. Moesin, PSD-95, alpha-Actinin, et alpha-Tubulin ont été détectés dans la fraction non consolidée. Si la protéine de revêtement des microbilles change, cette procédure peut être appliquée pour identifier l’interaction d’essai.Cette technique pourrait identifier la protéine travaillant sur des substances artificielles. Nous croyons donc que la genèse artificielle du mécanisme peut être quantifiée. Nous croyons que la nouvelle protéine liée au désordre mental peut être identifiée de la fraction filopodia-riche dendritique.Et peut être étendu à la thérapie.

purification-of-the-dendritic-filopodia-rich-fraction

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

L&#39;analyse de la morphologie des épines dendritiques dans les neurones du SNC de culture

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Recherche

Neurosciences

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Induire la croissance dendritique dans des cultures de neurones sympathiques

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

L&#39;analyse de la morphologie de Purkinje cellules dendritiques dans les cultures organotypique

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Évaluation de l&#39;arborisation dendritique dans le gyrus denté de la région de l&#39;hippocampe chez la souris

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Purification de souris vaisseaux cérébraux

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Analyse dendritique Morphologie dans les colonnes et les couches

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Évaluation de la complexité dendritique de l&#39;hippocampe chez les souris vieillies utilisant la méthode de Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the extracellular space (ECS) of the living brain. The ECS surrounds all brain cells and contains both interstitial fluid and extracellular matrix. The transport of many substances required for brain activity, including neurotransmitters, hormones, and nutrients, occurs by diffusion through the ECS. Changes in the volume and geometry of this space occur during normal brain processes, like sleep, and pathological conditions, like ischemia. However, the structure and regulation of brain ECS, particularly in diseased states, remains largely unexplored. The RTI method measures two physical parameters of living brain: volume fraction and tortuosity. Volume fraction is the proportion of tissue volume occupied by ECS. Tortuosity is a measure of the relative hindrance a substance encounters when diffusing through a brain region as compared to a medium with no obstructions. In RTI, an inert molecule is pulsed from a source microelectrode into the brain ECS. As molecules diffuse away from this source, the changing concentration of the ion is measured over time using an ion-selective microelectrode positioned roughly 100 &#181;m away. From the resulting diffusion curve, both volume fraction and tortuosity can be calculated. This technique has been used in brain slices from multiple species (including humans) and in vivo to study acute and chronic changes to ECS. Unlike other methods, RTI can be used to examine both reversible and irreversible changes to the brain ECS in real time.

This protocol describes real-time iontophoresis, a method that measures physical parameters of the extracellular space (ECS) of living brains. The diffusion of an inert molecule released into the ECS is used to calculate the ECS volume fraction and tortuosity. It is ideal for studying acute reversible changes to brain ECS.

Itophorèse en temps réel avec du tétraméthylammonium pour quantifier la fraction de volume et la tortuosité de l&#39;espace extracellulaire du cerveau

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

Analyse quantitative de la complexité d’arborisation dendritique neuronale chez la drosophile

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...