Name: purification of the dendritic filopodia-rich fraction
Uploaded: 2019-05-02T13:30:00
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Wir danken Shigeo Okabe und Hitomi Matsuno für die Low-Density-Kultur der Hippocampus-Neuronen, Masayoshi Mishina für TLCN-mäuse, Sachiko Mitsui und Momoko Shiozaki für technische Hilfe und Mitglieder des Yoshihara-Labors für hilfreiche Diskussionen . Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Grant Nos unterstützt. JP20700307, JP22700354 und JP24500392 und MEXT KAKENHI Grant Nos. JP23123525 auf YF und JP20022046, JP18H04683 und JP18H05146 zu YY.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee von RIKEN Wako genehmigt.
1. Kultur der Hippocampus-Neuronen
<ol><li>Vorbereitung des Kulturmediums
	<ol>
<li>Zubereitung von 200x Vitaminmischung. Lösen Sie 100 mg D-Pantothensäure-Hemicalciumsalz, 100 mg Cholinchlorid, 100 mg Folsäure, 180 mg I-Inositol, 100 mg Niacinamid, 100 mg Pyridoxal HCl und 100 mg Thiamin HCl in 500 ml Reinstwasser mit einem magnetischen Rührer. Die Lösung i...

<ol>
	<li>Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+via+dendritic+filopodia+in+developing+hippocampal+area+CA1.">Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).</li><li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Ziv, N. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+role+of+dendritic+filopodia+in+synaptogenesis+and+spine+formation.">Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation.</a> Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).</li><li>Lohmann, C., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+local+calcium+signaling+in+rapid+synaptic+partner+selection+by+dendritic+filopodia.">A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia.</a> Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).</li><li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+formation+and+stabilization.">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+human+and+mouse+postsynaptic+proteomes+finds+high+compositional+conservation+and+abundance+differences+for+key+synaptic+proteins.">Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins.</a> PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+proteome,+diseases+and+evolution+of+the+human+postsynaptic+density.">Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density.</a> Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+telencephalin+and+ERM+family+proteins+mediates+dendritic+filopodia+formation.">Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).</li><li>Mao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+Conduct+Target+Selection+in+Cortical+Neurons+Using+Differences+in+Signal+Kinetics+of+a+Single+Kinase.">Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase.</a> Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).</li><li>Matsuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin+slows+spine+maturation.">Telencephalin slows spine maturation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).</li><li>Raemaekers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-mediated+endosomal+transport+of+Telencephalin+affects+dendritic+filopodia-to-spine+maturation.">ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation.</a> The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).</li><li>Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalon-specific+antigen+identified+by+monoclonal+antibody.">Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).</li><li>Yoshihara, Y., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin:+a+neuronal+area+code+molecule?.">Telencephalin: a neuronal area code molecule?.</a> Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).</li><li>Annaert, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+telencephalin+and+the+amyloid+precursor+protein+predicts+a+ring+structure+for+presenilins.">Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins.</a> Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+induces+phosphorylation+of+ezrin/radixin/moesin+actin-binding+proteins+through+binding+to+its+novel+neuronal+receptor+telencephalin.">Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).</li><li>Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Actinin-dependent+cytoskeletal+anchorage+is+important+for+ICAM-5-mediated+neuritic+outgrowth.">alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).</li><li>Esselens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+1+mediates+the+turnover+of+telencephalin+in+hippocampal+neurons+via+an+autophagic+degradative+pathway.">Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway.</a> Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).</li><li>Furutani, Y., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+Dendritic+Filopodia-Rich+Fraction+Isolated+by+Telencephalin+and+Vitronectin+Interaction.">Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).</li><li>Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li><li>Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+the+C-terminal+domain+regulates+cell+surface+expression+of+the+NMDA+receptor+NR1+subunit.">Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).</li><li>Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+without+NMDA+receptor+function+in+culture.">Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture.</a> European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).</li></ol>

Wir entwickelten eine Reinigungsmethode für die dendritische filopodiareiche Fraktion unter Verwendung einer Affinität zwischen dem Zelladhäsionsmolekül TLCN und dem extrazellulären Matrixprotein vitronectin. Im Vergleich zur PSD-Fraktion könnte es möglich sein, die synaptischen Proteine, die auf die unreife Synapse wirken, aus der dendritischen filopodiareichen Fraktion zu identifizieren. So unterscheiden sich die Bestandteile der dendritischen filopodiareichen Fraktion um 74% von denen der PSD-Fraktion. Anders a...

Dendritische Filopodia werden als Vorläufer von Stacheln angenommen. Actin Filamente in der dendritischen Filopodia regulieren ihre Ausdehnung und Rückzug1,2,3. Nach Kontakt mit einem Axon beginnen ausgewählte dendritische Filopodien ihre Reifung in Stacheln, und eine Synapse wirdgebildet 4,5. Komponenten der Stacheln wurden aus einer umfassenden Analyse der postsynaptischen Dichtefraktionen6,7bestimmt, während Komponenten der dendritischen Filopodia weitgehend unbekannt bleiben. Es hat sich gezeigt, dass Telencephalin (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 Kinase, Akt, mTOR, Polo-ähnliche Kinase 2, CaMKII, Syndecan-2, Paralemin-1, ARF6 und EphB die dendritische Filopodiabildung regulieren5,8,9 ,10,11, während eine Methode für die umfassende Analyse von Molekülen in der dendritischen Filopodia nicht entwickelt wurde.
TLCN (ICAM-5) wird speziell durch stachelige Neuronen im rostralsten Hirnsegment, dem Telencephalon12,exprimiert. TLCN hat 9 Ig-ähnliche Domänen in seiner extrazellulären Region, eine Transmembranregion und einen zytoplasmatischen Schwanz13. TLCN bindet in seiner extrazellulären Region an Vitronectin (VN) und LFA-1-Integrin, an Presenilin in seiner Transmembranregion und an Phospho-ERM und -Actinin in seiner zytoplasmatischen Region5,8,14,15 ,16. TLCN bindet an das Aktin-Zytoskelett durch Phospho-ERM an den Spitzen der dendritischen Filopodia und des Actinins in Stacheln und dendritischen Wellen8,16.
Wir zeigten, dass die Überexpression der TLCN-verstärkten dendritischen Filopodia-Bildung und die Umkehrung der Wirbelsäule zu Filopodia10induzierte. Die konstitutive aktive Form von Ezrin, die an die tLCN-Zytoplasma-Region gebunden ist, und verbesserte dendritische Filopodia-Bildung8. So reguliert TLCN die dendritische Filopodiabildung durch aktinbindende Proteine. Esselens et al. zeigten, dass Mikroperlen die TLCN-Akkumulation an kultivierten Neuronen17induzierten. Wir zeigten, dass phagozytische Becherstrukturen auf neuronalen Dendriten um VN-beschichtete Mikroperlen in einer TLCN-abhängigen Weise gebildet wurden15. Bestandteile der dendritischen Filopodia ähneln denen der phagozytischen Tasse. Es ist schwierig, dendritische Filopodia zu sammeln, aber es ist relativ einfacher, die phagozytische Tasse mit magnetischen Mikroperlen zu sammeln. So haben wir eine Methode entwickelt, um den phagozytischen Becher anstelle der dendritischen Filopodia18zu reinigen. Hier beschreiben wir die Reinigungsmethode für die dendritische filopodiareiche Fraktion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 ml Low Binding MCT</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>39640T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic cell culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-Actinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-9026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ezrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone3C12, SAB4200806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Galphaq</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>sc-393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>clone AP20, MAB3418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Moesin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone 38/87, M7060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLCbeta1</td>
			<td>Santacuz</td>
			<td>sc-5291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PSD95</td>
			<td>MA2</td>
			<td>ABR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Spectrin beta</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>0080085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08122.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chrolide, hydrous</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-19735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-6645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-T520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>i-Inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>Fuji Film</td>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>For detection of luminescence from WB membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic polystyrene microbeads</td>
			<td>Sperotech</td>
			<td>PM-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acid solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11130-051</td>
			<td>30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-slab size electrophoresis system</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>AE-6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin / Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Nacali</td>
			<td>28360-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R9504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain 2 Kit wako</td>
			<td>Wako</td>
			<td>291-5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1703940JA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>For production of ultra pure water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of the dendritic filopodia-rich fraction

Dendritische Filopodia sind dünne und lange Vorsprünge, die auf dem Actin-Filament basieren, und sie dehnen sich aus und ziehen sich zurück, als ob sie nach einem Zielaxon suchen. Wenn die dendritischen Filopodia Kontakt mit einem Zielaxon herstellen, beginnen sie, zu Stacheln zu reifen, was zur Bildung einer Synapse führt. Telencephalin (TLCN) ist reichlich in dendritischen Filopodien lokalisiert und wird nach und nach von Stacheln ausgeschlossen. Die Überexpression von TLCN in kultivierten Hippocampus-Neuronen induziert die dendritische Filopodia-Bildung. Wir zeigten, dass Telencephalin stark an ein extrazelluläres Matrixmolekül, vitronectin, bindet. Vitronectin-beschichtete Mikroperlen induzierten phagozytische Tasse Bildung auf neuronalen Dendriten. In der phagozytischen Tasse, TLCN, TLCN-bindende Proteine wie phosphorylierte Sezrin/Radixin/Moesin (Phospho-ERM), und F-Actin sind angesammelt, was darauf hindeutet, dass Komponenten der phagozytischen Tasse denen der dendritischen Filopodia ähneln. So entwickelten wir eine Methode zur Reinigung der phagozytischen Tasse anstelle der dendritischen Filopodia. Magnetische Polystyrolperlen wurden mit Vitronectin beschichtet, das im Kulturmedium der Hippocampus-Neuronen reichlich vorhanden ist und phagozytische Becherbildung bei neuronalen Dendriten induziert. Nach 24 h Inkubation wurden die phagozytischen Becher leicht mit Waschmittel verwoben und mit einem Magnetabscheider gesammelt. Nach dem Waschen der Perlen wurden die Bindungsproteine eluiert und durch Silberfärbung und Western-Blotting analysiert. In der Bindungsfraktion waren TLCN und Actin reichlich vorhanden. Darüber hinaus wurden viele Proteine, die aus der Fraktion identifiziert wurden, auf die dendritische Filopodia lokalisiert; Daher nannten wir die Bindungsfraktion die dendritische filopodiareiche Fraktion. Dieser Artikel beschreibt Details über die Reinigungsmethode für die dendritische filopodiareiche Fraktion.

In kultivierten Hippocampus-Neuronen wurde TLCN reichlich auf die dendritische Filopodia, Welle und Soma lokalisiert und mit F-Actin kolokalisiert (Abbildung 1A, B). Wenn Polystyrol-Mikroperlen kultivierten Hippocampus-Neuronen zugesetzt wurden, wurden die Perlen automatisch mit Vitronectin (VN) beschichtet, das aus fetalem Rinderserum (FBS) im Kulturmedium gewonnen wurde; sie waren hauptsächlich an Dendriten gebunden, und sie induzierten di...

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Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

In diesem Protokoll führen wir eine Methode zur Reinigung der dendritischen filopodiareichen Fraktion aus der phagozytischen Cup-ähnlichen Vorsprungstruktur auf kultivierten Hippocampus-Neuronen ein, indem wir die spezifische und starke Affinität zwischen einem dendritischen Filopodialen Adhäsionsmolekül, TLCN, und ein extrazelluläres Matrixmolekül, vitronectin.

Reinigung der dendritischen Filopodia-reichen Fraktion

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Im Vergleich zur PSD-Fraktion kann es möglich sein, das synaptische Protein zu identifizieren, das auf die unreife Synapse um die dendritische filopodiareiche Fraktion wirkt. Wir verwendeten lebende Neuron, um phagozytische Kappenbildung zu induzieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass aktives Protein in künstlicher Genese aus der dendritischen filopodiareichen Fraktion identifiziert werden konnte.Zu Beginn bereiten Sie 200x Vitamin Mix vor, indem Sie 100 mg Vitamin B5, 100 mg Cholinchlorid, 100 mg Folsäure, 180 mg I-Inositol, 100 mg Vitamin B3, 100 mg Vitamin B6-Hydrochlorid und 100 mg Thiaminhydrochlorid in 500 ml Reinstwasser mit einem magnetischen Rührmittel auflösen. Aliquot in 50 ml Tuben sorgfältig mischen und bei 20 Grad Celsius lagern. Um Riboflavin-Lösung vorzubereiten, lösen Sie 100 mg Riboflavin in 500 mg Reinstwasser mit einem magnetischen Rührer auf.Aliquot in 50 ml Tuben sorgfältig mischen und bei 20 Grad Celsius lagern. Um ein molares Calciumdichlorid zuzubereiten, lösen Sie 7,35 Gramm Calciumchloriddihydrat in 50 ml Reinstwasser mit einem magnetischen Rührer auf. Für die Minimale Essential Medium Zubereitung 400 mg Kaliumchlorid 6, 800 mg Sodumchlorid, 2, 200 mg Natriumbicarbonat, 158 mg Natriumphosphat monobasisches Dihydrat, 7 000 mg D-Glucose und 200 mg Magnesiumsulfat-Heptahydrat und 950 ml Reinstwasser mit einem Magnetrührer auflösen.Als nächstes verwenden Sie eine 1 ml Pipette mit einer konstanten Rührung auf einem magnetischen Rührer, um 1,8 ml 1 Molar-Calciumdichlorid in einer Tropfen-für-Tropfen-Manier in das MEM zu geben. Fügen Sie dann Salzsäure hinzu, um den pH-Wert des MEM auf pH 7,25 einzustellen. Dann 5 ml 200x Vitaminmischung und 200 Mikroliter Riboflavinlösung in das MEM geben.Stellen Sie das Volumen der Lösung mit Reinstwasser auf 1000 ml ein. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22-Mikron-Filtersystem und lagern Sie sie bei 4 Grad Celsius. Zur Herstellung von 10x DNase-1 Stofflösung 100 mg Dnase-1 in 12,5 ml HBSS auflösen.Filtern Sie durch einen 0,22 Mikron Filter, aliquot in 1,5 ml Tuben, und lagern Sie die Rohre bei 20 Grad Celsius. Für Ara-C Stofflösungszubereitung 25 mg Ara-C in 8,93 ml Reinstwasser auflösen. Filtern Sie durch einen 0,22 Mikron Filter, aliquot in 1,5ml Tuben, und lagern Sie bei 20 Grad Celsius.Zur Zubereitung des Platting Mediums 1 ml MEM-Aminosäurelösung, 750 Mikroliter 1 Molaren-HEPES, 1 ml B27, 125 Mikroliter 200 Millimolar-Glutamin, 250 Mikroliter Penicillin-Streptomycin, 2,5 ml Fetales Rinderserum und 44,375 ml MEM in einer 50-ml-Röhre mischen. Zur Zubereitung des Stoppmediums 1 ml MEM-Aminosäurelösung, 750 Mikroliter 1 Molaren-HEPES, 5 ml FBS und 43,25 ml MEM in einer 50 ml-Röhre mischen. Zur Herstellung von HBSS, ergänzt mit 15 Millimolar HEPES, mischen 49,25 ml HBSS und 750 Mikroliter von 1 Molaren-HEPES.Für poly-l-lysinbeschichtete Geschirrzubereitung 35 mm Kunststoffzellkulturschalen mit 0,2 mg pro ml Poly-l-Lysinhydrobromid für einen Tag bei 25 Grad Celsius beschichten. Als nächstes waschen Sie die Teller mit 2 ml Reinstwasser dreimal und bebrüten sie mit 1,5 ml Stop Medium bei 25 Grad Celsius bis zum Gebrauch. Inkubieren Sie die sezierten Hippocampi in einer Mischung mit 500 Mikrolitern von je 2,5%Trypsin und 10X Dnase-1 in HBSS ergänzt mit 15 Millimolar HEPES, pH 7,2, bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten mit Agitation alle 3 Minuten.Dann übertragen Sie das Hippocampi auf 10 ml des Stop Mediumund und inkubieren bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten, um Trypsin zu inaktivieren. Als nächstes inkubieren Sie das sezierte Hippocampi in 10 ml frischem Stop-Medium bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten. Bewegen Sie Hippocampi in 10 ml frisches Stoppmedium und brüten bei 4 Grad Celsius für weitere 5 Minuten.Dann bewegen Sie das Hippocampi in 900 Mikroliter des Stoppmediums und 100 Mikroliter 10X Dnase-1 in einer 15 ml Tube. Verwenden Sie eine 1 ml Pipette, um die Hippocampi in isolierte Neuronen zu dissoziieren, indem Sie 20 Mal Pipettieren. Fügen Sie 9 ml Beschichtungsmedium und filtern Sie durch ein 70 Mikron Zellsieb, in eine 50 ml Tube.Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer und eine Anpassung an 3,5 mal 10 auf die vierte Zelle pro Milliliter in Beschichtungsmedium. Als nächstes das Stoppmedium von den poly-l-lisinbeschichteten Schalen ansaugen. Platte 2 ml pro Schale der Zellen auf den beschichteten Tellern und inkubieren unter 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius für 60-64 Stunden.Nach der Inkubation 2 Mikroliter Ara-C-Stammlösung in die Neuronen geben und das Gericht langsam schütteln. Bewahren Sie die Kulturgerichte in einer befeuchteten Box auf, ohne das Kulturmedium bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid zu verändern. Reinigen Sie die dendritische filopodia reiche Fraktion nach 13 Tagen in vitro, indem Sie zunächst drei Millionen magnetische Polystyrol-Mikroperlen pro Schale zu 20 Gerichten hinzufügen, die die kultivierten Neuronen enthalten.Nach einem Tag, waschen Sie die Neuronen in 1 ml PBS mit Agiation dreimal, um die mittelgroßen und ungebundenen Mikroperlen zu entfernen. Nach dem Entfernen von PBS, lysieren Sie die Neuronen mit 500 Mikroliter pro Schale des Lysepuffers. Als nächstes sammeln Sie das Lysat mit einem Zellschaber und übertragen Sie das Lysat in 10 eiweißarme Mikroröhrchen.Stellen Sie die Rohre auf einen Magneten getrennt und warten Sie eine Minute. Sammeln Sie den Überstand und verwenden Sie ihn als ungebundenen Bruch für Silberfärbung und Western Blot-Analyse. Als nächstes übertragen Sie die Perlen auf ein neues proteinarmes Mikrorohr und setzen Sie für eine Minute auf einen magnetischen Trenner.Entfernen Sie den Überstand vollständig, und fügen Sie 500 Mikroliter des Lysepuffers hinzu. Waschen Sie die Perlen mit einem Vortex-Mixer für 15 Sekunden. Wiederholen Sie das Waschen der Perlen 10 Mal und entfernen Sie den Überstand.Elute Proteine bis zu den Perlen durch Zugabe von 50 Mikroliter 1X SDS Probenpuffer und kochen Sie die Röhre bei 98 Grad Celsius für 5 Minuten. Zentrifugieren Sie das Rohr 10 Sekunden lang bei 860xG 3000 U/min und stellen Sie das Rohr für eine Minute auf einen magnetischen Trenner. Sammeln Sie den Überstand und verwenden Sie ihn als gebundenen Bruch.Messen Sie die Konzentrationen der ungebundenen und gebundenen Proteinfraktionen durch den BCA-Proteintest. Visualisieren Sie Protien-Lösungen mit Bromphenylblau und passen Sie die Konzentration auf 5 Nanogramm pro Mikroliter für SDS-Seite an. Trennen Sie die gebundenen und ungebundenen Brüche durch SDS-Seite mit einem 5-20%gradient gel.Silber Fleck das Gel. Schließlich, Western Blot mit geeigneten primären und sekundären Antikörpern nach dem Manuskript. In kultivierten Hippocampus-Neuronen wurde TLCN reichlich auf die dendritische Filopodia, Welle und Soma lokalisiert und mit F-Actin kolokalisiert.Die kodierten Perlen waren hauptsächlich an Dendriten gebunden und induzierten die Bildung von phagozytischen Bechern durch Ansammlung von TLCN und F-Actin auf neuronalen Dendriten. Thorecense-Bilder zeigten, dass die phagozytische Becherbildung entscheidend von der Anwesenheit von TLCN in Dendriten abhängig war. Die phagozytischen Becher wurden nur auf wilden Hippocampus-Neuronen gebildet, aber nicht auf TLCN defficient Hippocampal Neuronen.Die Ergebnisse der SDS-Seite zeigten, dass die Proteinbandmuster für die ungebundenen und gebundenen Fraktionen fast gleich waren, aber die Intensitäten bei 50 und 70 Kilodalton im gebundenen Bruchteil waren niedriger als die in der ungebundenen Fraktion. Die Bandintensität war jedoch nicht offensichtlich anders zwischen den ungebundenen und gebundenen Brüchen, die aus TLCN defficient Culture Hippocampusneuronen hergestellt wurden. Die Western-Blot-Analyse der ungebundenen und gebundenen Brüche zeigte, dass TLCN und VN hauptsächlich in der gebundenen Fraktion nachgewiesen wurden.Actin, Ezrin, G alpha q, PLC beta 1, MAP-2 und Spectrin wurden sowohl in den gebundenen als auch in den ungebundenen Fraktionen nachgewiesen. Moesin, PSD-95, Alpha-Actinin und Alpha-Tubulin wurden in der ungebundenen Fraktion nachgewiesen. Wenn sich das Beschichtungsprotein der Mikroperlen ändert, kann dieses Verfahren angewendet werden, um die Assay-Wechselwirkung zu identifizieren.Diese Technik könnte das Protein identifizieren, das an künstlichen Substanzen arbeitet. Wir glauben also, dass die künstliche Genese des Mechanismus quantifiziert werden kann. Wir glauben, dass neues Protein, das mit einer psychischen Störung verbunden ist, aus der dendritischen filopodiareichen Fraktion identifiziert werden kann.Und kann auf die Therapie ausgedehnt werden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Forschung

Neurowissenschaften

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Induktion von dendritischen Wachstums in Cultured sympathischen Neuronen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Reinigung von Maus-Hirngefäße

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analyse dendritischer Morphologie in Spalten und Schichten

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Echtzeit-Iontophorese mit Tetramethylammonium zur Quantifizierung der Volumenfraktion und Tortuosität des Gehirns extrazellulären Raumes

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analyse der neuronalen dendritischen Arborization Komplexität in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...