Name: purification of the dendritic filopodia-rich fraction
Uploaded: 2019-05-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction at JoVE.com

אנו מודים Shigeo Okabe ו היטומי Matsuno עבור התרבות בצפיפות נמוכה של נוירונים היפוקמאל, מסאיושי מישנה עבור העכברים TLCN-לקויה, Sachiko מיצ ו מומוקו Shioזאקי לסיוע טכני, וחברי המעבדה יושיהארה לדיונים מועילים . עבודה זו נתמכת על ידי JSPS KAKENHI גרנט Nos. JP20700307, JP22700354, ו JP24500392 ו-MEXT KAKENHI גרנט Nos. JP23123525 ל-YF ו-JP20022046, JP18H04683 וJP18H05146 ל-YY.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש של RIKEN Wako.
1. תרבות ההיפוקאמאל הנוירונים
<ol><li>הכנת מדיום לתרבות
	<ol>
<li>הכנת מיקס ויטמין 200x. לפזר 100 מ"ג של D-פנטטטום חומצה hemicalcium מלח, 100 mg של כולין כלוריד, 100 mg של חומצה פולית, 180 mg של i-inositol, 100 mg של...

<ol>
	<li>Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+via+dendritic+filopodia+in+developing+hippocampal+area+CA1.">Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).</li><li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Ziv, N. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+role+of+dendritic+filopodia+in+synaptogenesis+and+spine+formation.">Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation.</a> Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).</li><li>Lohmann, C., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+local+calcium+signaling+in+rapid+synaptic+partner+selection+by+dendritic+filopodia.">A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia.</a> Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).</li><li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+formation+and+stabilization.">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+human+and+mouse+postsynaptic+proteomes+finds+high+compositional+conservation+and+abundance+differences+for+key+synaptic+proteins.">Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins.</a> PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+proteome,+diseases+and+evolution+of+the+human+postsynaptic+density.">Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density.</a> Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+telencephalin+and+ERM+family+proteins+mediates+dendritic+filopodia+formation.">Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).</li><li>Mao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+Conduct+Target+Selection+in+Cortical+Neurons+Using+Differences+in+Signal+Kinetics+of+a+Single+Kinase.">Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase.</a> Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).</li><li>Matsuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin+slows+spine+maturation.">Telencephalin slows spine maturation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).</li><li>Raemaekers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-mediated+endosomal+transport+of+Telencephalin+affects+dendritic+filopodia-to-spine+maturation.">ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation.</a> The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).</li><li>Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalon-specific+antigen+identified+by+monoclonal+antibody.">Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).</li><li>Yoshihara, Y., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin:+a+neuronal+area+code+molecule?.">Telencephalin: a neuronal area code molecule?.</a> Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).</li><li>Annaert, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+telencephalin+and+the+amyloid+precursor+protein+predicts+a+ring+structure+for+presenilins.">Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins.</a> Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+induces+phosphorylation+of+ezrin/radixin/moesin+actin-binding+proteins+through+binding+to+its+novel+neuronal+receptor+telencephalin.">Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).</li><li>Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Actinin-dependent+cytoskeletal+anchorage+is+important+for+ICAM-5-mediated+neuritic+outgrowth.">alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).</li><li>Esselens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+1+mediates+the+turnover+of+telencephalin+in+hippocampal+neurons+via+an+autophagic+degradative+pathway.">Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway.</a> Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).</li><li>Furutani, Y., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+Dendritic+Filopodia-Rich+Fraction+Isolated+by+Telencephalin+and+Vitronectin+Interaction.">Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).</li><li>Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li><li>Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+the+C-terminal+domain+regulates+cell+surface+expression+of+the+NMDA+receptor+NR1+subunit.">Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).</li><li>Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+without+NMDA+receptor+function+in+culture.">Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture.</a> European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).</li></ol>

פיתחנו שיטת טיהור עבור השבר הדנדריטים הדנדריפיאה-עשיר באמצעות זיקה בין מולקולת תא הדבקה TLCN לבין מטריקס חלבון מטריצה vitronectin. בהשוואה לשבר PSD, זה יכול להיות אפשרי כדי לזהות את החלבונים סינפטיות פועל על הסינפסה בלתי בוגר מן השבר הדנדריטי-עשיר. לפיכך, המרכיבים של השבר הדנדריטי-עשיר, שונים מאלה ...

פילפיאה דנדריטי נחשבים להיות סמנים מוקדמים של שפני השדרה. שקעים לוויסות השלוחה והנסיגה שלהם1,2,3. לאחר יצירת קשר עם axon, הדנדריטים הדנדריטי הנבחר להתחיל ההבשלה שלהם לתוך השדרה, ו סינפסה נוצרת4,5. מרכיבים של שפני השדרה נקבעו מניתוח מקיף של שברים בצפיפות הפוסט-סינפטיות6,7, בעוד שרכיבים של פילופיאה דנדריטי נשארים לא ידועים. הוכח כי telencephalin (tlcn), אה, סינקופה, ראס, PI3 קינאז, akt, mtor, פולו-כמו קינאז 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, ולהסדיר את המבנה הדנדריטי הדנדריטים5,8,9 ,10,11, בעוד שיטה לא פותחה עבור ניתוח מקיף של מולקולות נוכח בפילפיאה הדנדריטי.
TLCN (ICAM-5) מתבטאת במיוחד על ידי נוירונים קוצני בחלק המוח הrostral ביותר, הטלנצאלון12. TLCN 9 תחומים כמו Ig באזור החילוץ שלה, אזור טרנסקרום, ו cytoplasmic זנב13. Tlcn נקשר ל vitronectin (VN) ו-lfa-1 אינטגרציה באזור המוטרתאי שלה, לפרזלין באזור הטרנסג שלה, ולפואהו-אה ולα-אקטין באזור cytoplasmic5,8,14,15 ,16. Tlcn נקשר לשלד ציטוטין באמצעות פוספהו-אה בקצות הפילפיאה הדנדרידיה ובα-אקמין ב שבקוצים ופירים דנדריטים8,16.
הראנו כי ביטוי יתר של TLCN היווצרות הדנדריטים הדנדריטי משופרת והמושרה גרסה מחודשת של השדרה לפילפיאה10. הצורה האקטיבית והפעילה של אזרין כרוך באזור cytoplasmic של TLCN ובמערך הדנדריטים הדנדריטי המשופר8. לפיכך, TLCN מווסת את היווצרות הדנדריטים הדנדריטי דרך actin-מחייב חלבונים. Esselens ואח ' הפגינו כי מיקרוחרוזים המושרה הצטברות TLCN על נוירונים מתורבתים17. הצגנו כי מבנים של גביע phagocytic הוקמה על הדנדריטים העצביים סביב מיקרוחרוזי VN מצופה באמצעות TLCN באופן תלוי15. מרכיבים של פילפיאה דנדריטי דומים לאלה של הגביע phagocytic. קשה לאסוף filפאות הדנדריטים, אבל זה קל יחסית לאסוף את הגביע phagocytic באמצעות מיקרוחרוזי מגנטי. לכן, פיתחנו שיטה כדי לטהר את הגביע phagocytic במקום filפיאה הדנדריטים18. כאן, אנו מתארים את שיטת הטיהור עבור השבר הדנדריפיאה עשיר.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 ml Low Binding MCT</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>39640T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic cell culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-Actinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-9026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ezrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone3C12, SAB4200806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Galphaq</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>sc-393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>clone AP20, MAB3418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Moesin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone 38/87, M7060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLCbeta1</td>
			<td>Santacuz</td>
			<td>sc-5291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PSD95</td>
			<td>MA2</td>
			<td>ABR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Spectrin beta</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>0080085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08122.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chrolide, hydrous</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-19735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-6645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-T520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>i-Inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>Fuji Film</td>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>For detection of luminescence from WB membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic polystyrene microbeads</td>
			<td>Sperotech</td>
			<td>PM-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acid solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11130-051</td>
			<td>30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-slab size electrophoresis system</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>AE-6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin / Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Nacali</td>
			<td>28360-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R9504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain 2 Kit wako</td>
			<td>Wako</td>
			<td>291-5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1703940JA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>For production of ultra pure water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of the dendritic filopodia-rich fraction

פילפאות דנדריטי הן בליטות דקות וארוכות המבוססות על הפילטין, והן מרחיבות ומסגת כאילו מחפשים מטרה אקסון. כאשר filפאות הדנדריטים ליצור קשר עם axon היעד, הם מתחילים התבגרות לתוך הקוצים, המוביל היווצרות סינפסה. Telencephalin (TLCN) הוא מקומי בשפע בפילפיאה דנדריטי והוא נשלל בהדרגה מהקוצים. הבעות יתר של TLCN בנוירונים מתורבתים היפוקמאל מעוררת היווצרות הדנדריטים. הצגנו שtelencephalin מאגד בחוזקה למולקולה של מטריקס, ויטרופקטין. ויטרופקטין מצופה בחרוזי מיקרו-חרוזים. שנגרמה כתוצאה מהדנדריטים העצביים בגביע phagocytic, TLCN, טלCN-מחייב חלבונים כגון זרחנת אזרין/Radixin/מוסין (פוספהו-אה), ו-F-actin נצבר, אשר מציע כי מרכיבים של הגביע phagocytic דומים לאלה של פילפיאה הדנדריטי. לכן, פיתחנו שיטה לטיהור הגביע phagocytic במקום filפאות הדנדריטים. חרוזי קלקר מגנטיים היו מצופים vitronectin, אשר בשפע בתווך התרבות של נוירונים היפוקמאל ואשר משרה היווצרות גביע phagocytic על הדנדריטים העצביים. לאחר 24 שעות של דגירה, כוסות phagocytic היו מסיסות במקצת עם חומרי ניקוי ונאסף באמצעות מפריד מגנט. לאחר שטיפת החרוזים, החלבונים המחייבים היו מנותחים ונותחו על ידי כתמים מכסף וכתמים מערביים. בשבר הכריכה, tlcn ו-אקטין היו נוכחים בשפע. בנוסף, חלבונים רבים שזוהו מן השבר היו מותאמים לפילפיאה הדנדריטי; לכן, קראנו את השבר המחייב כמו השבר הדנדריפיאה-עשיר. מאמר זה מתאר פרטים בנוגע לשיטת הטיהור של השבר הדנדריטי-עשיר.

ב מתורבת נוירונים היפוקמאל, TLCN היה מקומי בשפע לפילפיאה הדנדריטי, פיר, ואת הסומה ואת מקומי עם F-actin (איור 1A, B). כאשר מיקרוחרוזי פוליסטירן התווספו לנוירונים מתורבתים, החרוזים היו מצופים באופן אוטומטי עם vitronectin (VN) נגזר סרום שור עוברי (FBS) במדיום התרבות; ...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction at JoVE.com

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לטיהור החלק הדנדריטי-עשיר של השבר הדנדריטים של הגביע phagocytic כמו מבנה בליטה על הנוירונים היפוקמאל תרבותי על ידי ניצול הזיקה הספציפית והחזקה בין מחוגה הדנדריטי מולקולת הדבקה, TLCN ומולקולת מטריקס בעלי מטריצה, vitronectin.

טיהור של הדנדריטים הדנדריפיאה-חלק עשיר

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

בהשוואה לשבר PSD, ניתן לזהות את החלבון הסינפטי הפועל על הסינפסה לא בוגרת סביב השבר העשיר בפילופודיה. השתמשנו בנוירון חי כדי לגרום להיווצרות כובע phagocytic. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לזהות חלבון פעיל בראשית מלאכותית מהשבר העשיר בפילופודיה דנדריטית.כדי להתחיל, להכין 200x תערובת ויטמין על ידי המסת 100 מ"ג של ויטמין B5, 100 מ"ג כולין כלוריד, 100 מ"ג חומצה פולית, 180 מ"ג של I-אינוזיטול, 100 מ"ג של ויטמין B3, 100 מ"ג של ויטמין B6 הידרוכלוריד, ו 100 מ"ג של תיאמין הידרוכלוריד ב 500 מ"ל של מים אולטרהפלור באמצעות stirrer מגנטי. מערבבים בזהירות aliquot ב 50 מ"ל צינורות ולאחסן אותו ב 20 מעלות צלזיוס. כדי להכין פתרון ריבופלבין, להמיס 100 מ"ג ריבופלבין ב 500 מ"ג של מים אולטרה-חוץ באמצעות ערבוב מגנטי.מערבבים בזהירות aliquot ב 50 מ"ל צינורות ולאחסן ב 20 מעלות צלזיוס. כדי להכין אחד דיכלוריד סידן טוחנת להמיס 7.35 גרם של סידן כלוריד דיהידראקט ב 50 מ"ל של מים אולטרהפלור באמצעות stirrer מגנטי. להכנה בינונית חיונית מינימלית יש להמיס 400 מ"ג אשלגן כלורי 6, 800 מ"ג סודום כלורי, 2, 200 מ"ג של סודיום ביקרבונט, 158 מ"ג של נתרן פוספט דיהידרט מונובסי, 7, 000 מ"ג של D-גלוקוז, ו 200 מ"ג של מגנזיום סולפט heptahydrate, ו 950 מ"ל של מים אולטרה פלור, באמצעות stirrer מגנטי.לאחר מכן, השתמש פיפטה 1 מ"ל עם תסיסה מתמדת על stirrer מגנטי להוסיף 1.8 מיליליטר של 1 דיכלוריד סידן טוחנת MEM באופן טיפה על ידי טיפה. לאחר מכן מוסיפים חומצה הידרוכלורית כדי להתאים את ה- pH של ה- MEM ל- pH 7.25. לאחר מכן, מוסיפים 5 מ"ל של תערובת ויטמינים 200x ו 200 microliters של פתרון ריבופלבין ל- MEM.כוונן את עוצמת הקול של הפתרון ל- 1000 מ"ל עם מים אולטרה-חמים. מסננים את הפתרון באמצעות מערכת סינון 0.22 מיקרון ומאחסנים אותו ב-4 מעלות צלזיוס. כדי להכין 10x DNase-1 פתרון מלאי להמיס 100 מ"ג של Dnase-1 ב 12.5 מ"ל של HBSS.מסננים דרך מסנן 0.22 מיקרון, aliquot בצינורות 1.5 מ"ל, ולאחסן את הצינורות ב 20 מעלות צלזיוס. להכנת פתרון מלאי Ara-C להמיס 25 מ"ג של Ara-C ב 8.93 מ"ל של מים אולטרה ביטחון. מסננים דרך מסנן 0.22 מיקרון, aliquot בצינורות 1.5 מ"ל, ולאחסן ב 20 מעלות צלזיוס.כדי להכין את מדיום ציפוי, לערבב 1 מ"ל של פתרון חומצת אמינו MEM, 750 מיקרוליטרים של 1 HEPES טוחנת, 1 מ"ל של B27, 125 microliters של 200 מילימולאר גלוטמין, 250 microliters של פניצילין סטרפטומיצין, 2.5 מ"ל של סרום שור עוברי, ו 44.375 מ"ל של MEM בצינור 50 מ"ל. כדי להכין את מדיום עצירה, לערבב 1 מ"ל של פתרון חומצת אמינו MEM, 750 microliters של 1 HEPES טוחנת, 5 מ"ל של FBS, ו 43.25 מ"ל של MEM בצינור 50 מ"ל. כדי להכין HBSS, בתוספת 15 מילימולרים HEPES, לערבב 49.25 מ"ל של HBSS, ו 750 microliters של 1 HEPES טוחנת.להכנת מנות מצופות פולי-ל-ליסין, יש לצפות במנות תרבות תאי פלסטיק 35 מ"מ עם 0.2 מ"ג למ"ל של פולי-ל-ליסין הידרוברומיד ליום אחד ב-25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את הכלים עם 2 מ"ל של מים אולטרה לחץ שלוש פעמים דגירה אותם עם 1.5 מ"ל של עצור בינוני ב 25 מעלות צלזיוס עד השימוש. דגירה ההיפוקמפוס מנותח בתערובת המכילה 500 microliters כל אחד 2.5% טריפסין ו 10X Dnase-1 ב HBSS בתוספת 15 מילימולרים HEPES, pH 7.2, ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות עם תסיסה כל 3 דקות.לאחר מכן, להעביר את ההיפוקמפוס ל 10 מ"ל של עצירה בינונית דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי להשבית טריפסין. לאחר מכן, הדגירה ההיפוקמפוס נותח ב 10 מ"ל של טרי להפסיק בינוני ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. מעבירים את ההיפוקמפוס ל-10 מ"ל של עצירה טרייה בינונית ומדגירה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות נוספות.לאחר מכן, להעביר את ההיפוקמפוס לתוך 900 microliters של מדיום עצירה ו 100 microliters של 10X Dnase-1 בצינור 15 מ"ל. השתמש פיפטה 1 מ"ל כדי לנטרל את ההיפוקמפוס לתוך נוירונים מבודדים על ידי pipetting 20 פעמים. מוסיפים 9 מ"ל של ציפוי בינוני, ומסננים דרך מסננת תאים של 70 מיקרון, לצינור של 50 מ"ל.לספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer ולהתאים ל 3.5 פעמים 10 לתאים הרביעי למיליליטר במדיום ציפוי. לאחר מכן, שאפו את מדיום העצירה מהמנות המצופות בפולי-ל-ליסטין. צלחת 2 מ"ל למנה של התאים על הכלים מצופים דגירה תחת 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60-64 שעות.לאחר הדגירה, מוסיפים 2 מיקרוליטרים של פתרון מלאי Ara-C לנוירונים ומנערים את המנה לאט. שמור את מנות התרבות בקופסה לחה מבלי לשנות את מדיום התרבות תחת 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס. לטהר את שבר עשיר filopodia דנדריטי לאחר 13 ימים במבחנה על ידי תחילה הוספת שלושה מיליון microbeads פוליסטירן מגנטי לכל מנה ל 20 מנות המכילות את הנוירונים התרבותיים.לאחר יום אחד, לשטוף את הנוירונים ב 1 מ"ל של PBS עם agiation שלוש פעמים כדי להסיר את microbeads בינוני ולא מאוגד. לאחר הסרת PBS, lyse הנוירונים עם 500 microliters לכל צלחת של מאגר תיזה. לאחר מכן, לאסוף את lysate עם מגרד תא ולהעביר את lysate לתוך 10 microtubes חלבון נמוך מחייב.שים את הצינורות על מפריד מגנט ולחכות דקה אחת. לאסוף את supernatant ולהשתמש בו כשבר מאוגד עבור כתמי כסף וניתוח כתם מערבי. לאחר מכן, מעבירים את חרוזים למיקרו-צינור חדש מחייב חלבון נמוך ומגדירים על מפריד מגנטי למשך דקה אחת.הסר לחלוטין את העל-טבעי והוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר התיזה. לשטוף את חרוזים באמצעות מערבל מערבולת במשך 15 שניות. חוזרים על שטיפת חרוזים 10 פעמים ומסירים את העל-טבעי.חלבוני Elute עד חרוזים על ידי תוספת של 50 microliters של חיץ מדגם SDS 1X ולהרתיח את הצינור ב 98 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. צנטריפוגה הצינור ב 860xG 3000 סל"ד במשך 10 שניות ולהגדיר את הצינור על מפריד מגנטי במשך דקה אחת. לאסוף את supernatant ולהשתמש בו כשבר מאוגד.מדדו את הריכוזים של שברי החלבון הלא מאוגדים והכרוגדים לפי מסקעת החלבון של BCA. דמיינו פתרונות פרוטאין עם כחול ברומופנים והתאימו את הריכוז ל-5 ננוגרם למיקרוליטר לעמוד SDS. הפרד את השברים המאוגדים והבלתי מאוגדים באמצעות דף SDS באמצעות ג'ל הדרגתי של 5-20%..כסף מכתים את הג'ל. לבסוף, כתם מערבי באמצעות נוגדנים ראשוניים ומשניים מתאימים על פי כתב היד. בנוירונים מתורבתים בהיפוקמפוס, TLCN היה מקומי בשפע לפילופודיה דנדריטית, פיר, וסומה והיה מקומי במשותף עם F-actin.חרוזים מקודדים היו קשורים בעיקר דנדריטים לגרום להיווצרות של כוסות phagocytic על ידי הצטברות של TLCN ו F-actin על דנדריטים עצביים. תמונות Thorecense הראו כי היווצרות phagocytic היה תלוי באופן מכריע על נוכחות של TLCN בדנדריטים. ה כוסות phagocytic נוצרו רק על נוירונים בהיפוקמפוס סוג פראי, אבל לא על TLCN נוירונים ההיפוקמפוס defficient.תוצאות עמוד SDS הראו כי דפוסי רצועת החלבון היו כמעט זהים עבור שברים לא מאוגדים וכבולים אבל התעצמויות ב 50 ו 70 קילודאלטון, בשבר כבול היו נמוכים יותר מאלה בשבר מאוגד. עם זאת, עוצמת הלהקה לא הייתה שונה באופן ברור בין שברים לא מאוגדים וכבולים שהוכנו מתאי עצב בהיפוקמפוס של תרבות TLCN. ניתוח כתם מערבי של שברים לא מאוגדים וכבולים הראה כי TLCN ו- VN זוהו בעיקר בשבר המאוגד.אקטין, עזרין, G אלפא q, PLC בטא 1, MAP-2, ו ספקטרין, זוהו הן שברים מאוגדים ולא מאוגדים. מוסין, PSD-95, אלפא-אקטין, ואלפא-טובלין זוהו בשבר הלא מאוגד. אם חלבון ציפוי של microbeads לשנות, הליך זה ניתן להחיל כדי לזהות אינטראקציה הבדיקה.טכניקה זו יכולה לזהות את החלבון עובד על חומרים מלאכותיים. אז אנחנו מאמינים שניתן לכמת את המנגנון הזה. אנו מאמינים כי חלבון חדש הקשורים להפרעה נפשית ניתן לזהות מן השבר דנדריטי filopodia עשיר.ו ניתן להאריך לטיפול.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

ניתוח של מורפולוגיה השדרה דנדריטים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית Cultured

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

גרימת צמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים מתורבתים

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

הניתוח של מורפולוגיה דנדריטים סלולרי פורקינג&#39; בתרבויות Slice Organotypic

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

הערכה של דנדריטים arborization ברכס המשונן של האזור בהיפוקמפוס של עכברים

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Purification of Mouse Brain Vessels

טיהור של כלי מוח עכבר

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

ניתוח מורפולוגיה דנדריטים ב עמודות שכבות

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

הערכת המורכבות בהיפוקמפוס דנדריטי בעכברים בגילאים בשיטת Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

בזמן אמת Iontophoresis עם Tetramethylammonium כדי לכמת את נפח השבר ואת הצרות של המוח תאיים שטח

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

ניתוח כמותי של Arborization דנדריטים עצביים מורכבות בדרוזופילה

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...