Name: purification of the dendritic filopodia-rich fraction
Uploaded: 2019-05-02T13:30:00
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Ringraziamo Shigeo Okabe e Hitomi Matsuno per la cultura a bassa densità dei neuroni ippocampali, Masayoshi Mishina per topi carenti di TLCN, Sachiko Mitsui e Momoko Shiozaki per l'assistenza tecnica, e membri del laboratorio Yoshihara per discussioni utili . Questo lavoro è stato supportato da JSPS KAKENHI Grant Nos. JP20700307, JP22700354 e JP24500392 e MEXT KAKENHI Grant Nos. da JP23123525 a YF e JP20022046, JP18H04683 e da JP18H05146 a YY.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di RIKEN Wako.
1. Cultura dei neuroni ippocampali
<ol><li>Preparazione del mezzo culturale
	<ol>
<li>Preparazione del mix di vitamine 200x. Sciogliere 100 mg di sale di emicalcio acido Pantotenico, 100 mg di cloruro di colina, 100 mg di acido folico, 180 mg di i-inositolo, 100 mg di niacinamide, 100 mg di HCl piruridossiale e 100 mg di tiamina HCl in 500 mL di acqua...

<ol>
	<li>Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+via+dendritic+filopodia+in+developing+hippocampal+area+CA1.">Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).</li><li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Ziv, N. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+role+of+dendritic+filopodia+in+synaptogenesis+and+spine+formation.">Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation.</a> Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).</li><li>Lohmann, C., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+local+calcium+signaling+in+rapid+synaptic+partner+selection+by+dendritic+filopodia.">A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia.</a> Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).</li><li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+formation+and+stabilization.">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+human+and+mouse+postsynaptic+proteomes+finds+high+compositional+conservation+and+abundance+differences+for+key+synaptic+proteins.">Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins.</a> PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+proteome,+diseases+and+evolution+of+the+human+postsynaptic+density.">Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density.</a> Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+telencephalin+and+ERM+family+proteins+mediates+dendritic+filopodia+formation.">Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).</li><li>Mao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+Conduct+Target+Selection+in+Cortical+Neurons+Using+Differences+in+Signal+Kinetics+of+a+Single+Kinase.">Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase.</a> Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).</li><li>Matsuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin+slows+spine+maturation.">Telencephalin slows spine maturation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).</li><li>Raemaekers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-mediated+endosomal+transport+of+Telencephalin+affects+dendritic+filopodia-to-spine+maturation.">ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation.</a> The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).</li><li>Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalon-specific+antigen+identified+by+monoclonal+antibody.">Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).</li><li>Yoshihara, Y., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin:+a+neuronal+area+code+molecule?.">Telencephalin: a neuronal area code molecule?.</a> Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).</li><li>Annaert, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+telencephalin+and+the+amyloid+precursor+protein+predicts+a+ring+structure+for+presenilins.">Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins.</a> Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+induces+phosphorylation+of+ezrin/radixin/moesin+actin-binding+proteins+through+binding+to+its+novel+neuronal+receptor+telencephalin.">Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).</li><li>Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Actinin-dependent+cytoskeletal+anchorage+is+important+for+ICAM-5-mediated+neuritic+outgrowth.">alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).</li><li>Esselens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+1+mediates+the+turnover+of+telencephalin+in+hippocampal+neurons+via+an+autophagic+degradative+pathway.">Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway.</a> Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).</li><li>Furutani, Y., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+Dendritic+Filopodia-Rich+Fraction+Isolated+by+Telencephalin+and+Vitronectin+Interaction.">Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).</li><li>Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li><li>Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+the+C-terminal+domain+regulates+cell+surface+expression+of+the+NMDA+receptor+NR1+subunit.">Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).</li><li>Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+without+NMDA+receptor+function+in+culture.">Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture.</a> European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).</li></ol>

Abbiamo sviluppato un metodo di purificazione per la frazione dendritica ricca di filopodia utilizzando affinità tra la molecola di adesione cellulare TLCN e la proteina matrice extracellulare vitronectina. Rispetto alla frazione PSD, potrebbe essere possibile identificare le proteine sinaptiche che agiscono sulla sinapsi immatura dalla frazione dendritica ricca di filopodia. Così, i costituenti della frazione dendritica ricca di filopodia sono diversi da quelli della frazione PSD del 74%. A differenza della frazione P...

Si pensa che la filopodi dendritica sia precursore delle spine. I filamenti di Actin nella filopodi adendriticane regolano l'estensione e la retrazione 1,2,3. Dopo aver contattato un assone, la filopodia dendritica selezionata inizia la loro maturazione in spine, e si forma una sinapsi4,5. I componenti delle spine sono stati determinati dall'analisi completa delle frazioni di densità postsinaptica6,7, mentre i componenti della filopodia dendritica rimangono in gran parte sconosciuti. È stato dimostrato che telencephalin (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 kinase, Akt, mTOR, polo-like kinase 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, e EphB regolano la formazione di filopodi dendritici5,8,9 ,10,11, mentre un metodo non è stato sviluppato per l'analisi completa delle molecole presenti nella filopodia dendritica.
TLCN (ICAM-5) è specificamente espresso dai neuroni spinosi nel segmento cerebrale più rostrale, il telencephalon12. TLCN ha 9 domini simili a Ig nella sua regione extracellulare, una regione transmembrana e una coda citoplasmica13. TLCN si lega alla vitronectina (VN) e all'integrina LFA-1 nella sua regione extracellulare, alla presenilina nella sua regione transmembrana, e alla fosfora-ERM e alla z-actinina nella sua regione citoplasmica5,8,14,15 ,16. TLCN si lega al citoscheletro dell'actina attraverso il fosforo-ERM su punta di filopodia dendritica e di z-actininina nelle spine e negli alberi dendritici8,16.
Abbiamo dimostrato che la sovraespressione del TLCN ha migliorato la formazione di filopodi a dendritici e ha indotto la reversione delle spine alla filopodia10. La forma attiva costituiscista di ezrin legata alla regione citoplasmica TLCN e la formazione di filopodia dendritica migliorata8. Così, TLCN regola la formazione di filopodi dendritici attraverso proteine che legano l'atto. Esselens et al. ha dimostrato che le microsfere hanno indotto l'accumulo di TLCN sui neuroni coltivati17. Abbiamo dimostrato che le strutture della coppa fagocitica si sono formate sui dendriti neuronali intorno alle microsfere rivestite di VN in modo dipendente dalla TLCN15. Costituenti di filopodi dendritici sono simili a quelli della coppa fagocitica. È difficile raccogliere la filopodi dendritica, ma è relativamente più facile raccogliere la coppa fagocitica utilizzando microsfere magnetiche. Così, abbiamo sviluppato un metodo per purificare la coppa fagocitica invece di filopodia dendritica18. Qui, descriviamo il metodo di purificazione per la frazione dendritica ricca di filopodia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 ml Low Binding MCT</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>39640T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic cell culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-Actinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-9026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ezrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone3C12, SAB4200806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Galphaq</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>sc-393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>clone AP20, MAB3418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Moesin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone 38/87, M7060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLCbeta1</td>
			<td>Santacuz</td>
			<td>sc-5291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PSD95</td>
			<td>MA2</td>
			<td>ABR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Spectrin beta</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>0080085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08122.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chrolide, hydrous</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-19735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-6645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-T520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>i-Inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>Fuji Film</td>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>For detection of luminescence from WB membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic polystyrene microbeads</td>
			<td>Sperotech</td>
			<td>PM-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acid solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11130-051</td>
			<td>30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-slab size electrophoresis system</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>AE-6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin / Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Nacali</td>
			<td>28360-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R9504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain 2 Kit wako</td>
			<td>Wako</td>
			<td>291-5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1703940JA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>For production of ultra pure water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of the dendritic filopodia-rich fraction

I filodidi dendrici sono sporche sottili e lunghe basate sul filamento di actin, e si estendono e si ritraggono come se cercassero un assone bersaglio. Quando la filopodia dendritica stabilisce il contatto con un assone bersaglio, iniziano a maturare in spine, portando alla formazione di una sinapsi. La telencefine (TLCN) è abbondantemente localizzata nella filopodia dendritica ed è gradualmente esclusa dalle spine. La sovraespressione del TLCN nei neuroni ippocampali coltivati induce la formazione di filopodia dendritica. Abbiamo dimostrato che la telencefine si lega fortemente a una molecola di matrice extracellulare, la vitronectina. Le microsfere rivestite di cellavanguardia in vitronectine hanno indotto la formazione di coppe fagocitiche sui dendriti neuronali. Nella tazza fagocitica, si accumulano proteine che legano il TLCN, come Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), e F-actin, il che suggerisce che i componenti della coppa fagocitica sono simili a quelli della filodia dendritica. Così, abbiamo sviluppato un metodo per purificare la coppa fagocitica invece di filopodi a dendritica. Le perle di polistirene magnetico sono state rivestite con vitronectina, che è abbondantemente presente nel mezzo di coltura dei neuroni ippocampali e che induce la formazione di coppe fagocitiche sui dendriti neuronali. Dopo 24 h di incubazione, le tazze fagocitiche erano leggermente solubili con detergente e raccolte utilizzando un separatore magnete. Dopo aver lavato le perline, le proteine leganti sono state eluite e analizzate dalla colorazione d'argento e dalla gonfiore occidentale. Nella frazione vincolante, TLCN e actin erano abbondantemente presenti. Inoltre, molte proteine identificate dalla frazione sono state localizzate alla filopodica dendritica; così, abbiamo chiamato la frazione di legame come la frazione dendritica ricca di filopodia. Questo articolo descrive i dettagli relativi al metodo di purificazione per la frazione dendritica ricca di filopodia.

Nei neuroni ippocampali coltivati, TLCN è stato abbondantemente localizzato alla filopodia dendritica, albero, e soma e colocalizzato con F-actin (Figura 1A, B). Quando le microsfere di polistirolo sono state aggiunte ai neuroni ippocampali coltivati, le perline sono state automaticamente rivestite con vitronectina (VN) derivata dal siero bovino fetale (FBS) nel mezzo di coltura; erano principalmente legati ai dendriti, e indotto la formazio...

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Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

In questo protocollo, introduciamo un metodo per purificare la frazione dendritica ricca di filopodia dalla struttura di protrusione simile a una coppa fagocitica sui neuroni ippocampali coltivati sfruttando l'affinità specifica e forte tra un filopopodiale dendritico molecola di adesione, TLCN, e una molecola di matrice extracellulare, vitronectina.

Purificazione della Frazione ricca di Filopodia Dendritica

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Rispetto alla frazione PSD, può essere possibile identificare la proteina sinaptica che agisce sulla sinapsi immatura attorno alla frazione ricca di filopodi dendritici. Abbiamo usato il neurone vivo per indurre la formazione di tappi fagocitici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la proteina attiva nella genesi artificiale potrebbe essere identificata dalla frazione ricca di filopodi dendritici.Per iniziare, preparare 200x Vitamin Mix sciogliendo 100 mg di vitamina B5, 100 mg di cloruro di colina, 100 mg di acido folico, 180 mg di I-inositolo, 100 mg di vitamina B3, 100 mg di cloridrato di vitamina B6 e 100 mg di cloridrato di tiammina in 500 ml di acqua ultrapura utilizzando un agitatore magnetico. Mescolare con cura l'aliquota in tubi da 50 ml e conservarla a 20 gradi Celsius. Per preparare la soluzione di riboflavina, sciogliere 100 mg di riboflavina in 500 mg di acqua ultrapura utilizzando un agitatore magnetico.Mescolare con cura l'aliquota in tubi da 50 ml e conservare a 20 gradi Celsius. Per preparare un cloruro di calcio molare sciogliere 7,35 grammi di diidrato di cloruro di calcio in 50 ml di acqua ultrapura utilizzando un agitatore magnetico. Per la preparazione minima del mezzo essenziale sciogliere 400 mg di cloruro di potassio 6, 800 mg di cloruro di sodo, 2,200 mg di bicarbonato di sodio, 158 mg di diidrato monobasico di fosfato di sodio, 7.000 mg di D-glucosio e 200 mg di eptaidrato di solfato di magnesio e 950 ml di acqua ultrapura, utilizzando un agitatore magnetico.Successivamente, utilizzare una pipetta da 1 ml con agitazione costante su un agitatore magnetico per aggiungere 1,8 ml di 1 cloruro di calcio molare al MEM in modo drop by drop. Quindi aggiungere acido cloridrico per regolare il pH del MEM a pH 7,25. Quindi, aggiungere 5 ml di miscela di vitamine 200x e 200 microlitri di soluzione di riboflavina al MEM.Regolare il volume della soluzione a 1000 ml con acqua ultrapura. Filtrare la soluzione utilizzando un sistema di filtri da 0,22 micron e conservarla a 4 gradi Celsius. Per preparare 10x DNasi-1 soluzione stock sciogliere 100 mg di Dnase-1 in 12,5 ml di HBSS.Filtrare attraverso un filtro da 0,22 micron, aliquota in tubi da 1,5 ml e conservare i tubi a 20 gradi Celsius. Per la preparazione della soluzione di approvvigionamento Ara-C sciogliere 25 mg di Ara-C in 8,93 ml di acqua ultrapura. Filtrare attraverso un filtro da 0,22 micron, aliquota in tubi da 1,5 ml e conservare a 20 gradi Celsius.Per preparare il mezzo di placcatura, mescolare 1 ml di soluzione di amminoacido MEM, 750 microlitri di 1 HEPES molare, 1 ml di B27, 125 microlitri di glutammina millimolare, 250 microlitri di penicillina-streptomicina, 2,5 ml di siero bovino fetale e 44,375 ml di MEM in un tubo da 50 ml. Per preparare il mezzo di arresto, mescolare 1 ml di soluzione amminoacido MEM, 750 microlitri di 1 HEPES molare, 5 ml di FBS e 43,25 ml di MEM in un tubo da 50 ml. Per preparare l'HBSS, integrato con 15 HEPES millimolare, mescolare 49,25 ml di HBSS e 750 microlitri di 1 HEPES molare.Per la preparazione di piatti rivestiti in poli-l-lisina, rivestire 35 mm di stoviglie di coltura cellulare in plastica con 0,2 mg per ml di poli-l-lisina idrobromide per un giorno a 25 gradi Celsius. Successivamente, lavare i piatti con 2 ml di acqua ultrapura tre volte e incubarli con 1,5 ml di Stop Medium a 25 gradi Celsius fino all'uso. Incubare gli ippocampi sezionati in una miscela contenente 500 microlitri ciascuno del 2,5% di tripside e 10X Dnase-1 in HBSS integrati con HEPES millimolare, pH 7,2, a 37 gradi Celsius per 15 minuti con agitazione ogni 3 minuti.Quindi, trasferire gli ippocampi a 10 ml del mezzo di arresto e incubare a 4 gradi Celsius per 5 minuti per inattivare la tripside. Successivamente, incubare gli ippocampi sezionati in 10 ml di mezzo di arresto fresco a 4 gradi Celsius per 5 minuti. Spostare gli ippocampi in 10 ml di mezzo di arresto fresco e incubare a 4 gradi Celsius per altri 5 minuti.Quindi, spostare gli ippocampi in 900 microlitri del mezzo di arresto e 100 microlitri di Dnase-1 10X in un tubo da 15 ml. Utilizzare una pipetta da 1 ml per dissociare gli ippocampi in neuroni isolati pipettando 20 volte. Aggiungere 9 ml di mezzo di placcatura e filtrare attraverso un colino a celle da 70 micron in un tubo da 50 ml.Contare il numero di cellule che usano un emocitometro e una regolazione a 3,5 per 10 fino alle quattro cellule per millilitro nel mezzo di placcatura. Successivamente, aspirare il mezzo di arresto dalle stoviglie rivestite in poli-l-lisina. Piatto 2 ml per piatto delle cellule sui piatti rivestiti e incubare sotto il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per 60-64 ore.Dopo l'incubazione, aggiungere 2 microlitri di soluzione di calcio Ara-C ai neuroni e scuotere lentamente il piatto. Conservare i piatti di coltura in una scatola umidificata senza cambiare il mezzo di coltura sotto il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Purificare la frazione ricca di filopodi dendritici dopo 13 giorni in vitro aggiungendo prima tre milioni di microperline magnetiche in polistirolo per piatto a 20 piatti contenenti i neuroni coltivati.Dopo un giorno, lavare i neuroni in 1 ml di PBS con agitazione tre volte per rimuovere le microperline medie e non unite. Dopo aver rimosso pbs, lyse i neuroni con 500 microlitri per piatto del tampone dilisi. Successivamente, raccogliere il lisato con un raschietto cellulare e trasferire il lisato in 10 microtubi leganti a basso contenuto proteico.Impostare i tubi su un separatore di magneti e attendere un minuto. Raccogli il supernatante e usalo come frazione non vincolata per la colorazione dell'argento e l'analisi western blot. Successivamente, trasferire le perline su un nuovo microtubo legante a basso contenuto proteico e impostare su un separatore magnetico per un minuto.Rimuovere completamente il supernatante e aggiungere 500 microlitri del tampone dilisi. Lavare le perline utilizzando un miscelatore Vortex per 15 secondi. Ripetere il lavaggio delle perline 10 volte e rimuovere il supernatante.Elute proteine fino alle perline con l'aggiunta di 50 microlitri di 1X SDS tampone campione e far bollire il tubo a 98 gradi Celsius per 5 minuti. Centrifugare il tubo a 860xG 3000 RPM per 10 secondi e impostare il tubo su un separatore magnetico per un minuto. Raccogliere il supernatante e utilizzarlo come frazione associata.Misurare le concentrazioni delle frazioni proteiche non legate e legate dal saggio proteico BCA. Visualizza le soluzioni di protien con blu bromofile e regola la concentrazione a 5 nanogrammi per microlitro per la pagina SDS. Separare le frazioni associate e non associate per pagina SDS utilizzando un gel gradiente 5-20%..Macchia d'argento nel gel. Infine, western blot usando anticorpi primari e secondari appropriati secondo il manoscritto. Nei neuroni ippocampali coltivati, il TLCN era abbondantemente localizzato nei filopodi dendritici, nell'albero e nel soma e co-localizzato con F-actin.Le perline codificate erano principalmente legate a dendriti e inducevano la formazione di tazze fagocitiche per accumulo di TLCN e F-actina su dendriti neuronali. Le immagini di Thorecense mostravano che la formazione di coppe fagocitiche dipendeva in modo cruciale dalla presenza di TLCN nei dendriti. Le tazze fagocitiche si sono formate solo su neuroni ippocampali di tipo selvaggio, ma non su neuroni ippocampali defficienti TLCN.I risultati della pagina SDS hanno mostrato che i modelli di banda proteica erano quasi gli stessi per le frazioni non legate e legate, ma le intensità a 50 e 70 kilodalton, nella frazione legata erano inferiori a quelle della frazione non legata. Tuttavia, l'intensità della banda non era ovviamente diversa tra le frazioni non legate e legate preparate dai neuroni ippocampali di coltura defficiente TLCN. L'analisi western delle frazioni non legate e legate ha mostrato che TLCN e VN sono stati rilevati principalmente nella frazione associata.Actin, Ezrin, G alpha q, PLC beta 1, MAP-2 e Spectrin, sono stati rilevati sia nelle frazioni legate che in uscita. Moesin, PSD-95, alfa-actinina e alfa-tubulina sono stati rilevati nella frazione non vincolata. Se la proteina di rivestimento delle microperline cambia, questa procedura può essere applicata per identificare l'interazione del saggio.Questa tecnica potrebbe identificare la proteina che lavora su sostanze artificiali. Quindi crediamo che il meccanismo della genesi artificiale possa essere quantificato. Crediamo che nuove proteine associate al disturbo mentale possano essere identificate dalla frazione ricca di filopodi dendritici.E può essere esteso alla terapia.

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