Name: purification of the dendritic filopodia-rich fraction
Uploaded: 2019-05-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction at JoVE.com

海馬ニューロンの低密度培養に対する岡部茂雄氏と松野仁美さん、TLCN欠損マウスの三科正義さん、技術支援を受けた三井幸子さん、塩崎桃子さん、吉原研究室のメンバーに感謝の意を表します。.この作品は、JSPSカケンヒグラント・ノーズが支援しました。JP20700307、JP22700354、JP24500392、文部研日グラントNos.JP23123525からYFおよびJP20022046、JP18H04683、およびJP18H05146からYYへ。

ここに記載されているすべての方法は、理化学研究所和光の施設動物管理・使用委員会によって承認されています。
1. 海馬ニューロンの培養
<ol><li>培養培地の調製
	<ol>
<li>200倍のビタミンミックスの調製。Dパントテイン酸ヘミカルシウム塩の100mg、塩化コリン100mg、葉酸100mg、イノシトール180mg、ナイアシンアミド100mg、ピリドキサルHCl100mg、500mLのチアミンHC...

<ol>
	<li>Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+via+dendritic+filopodia+in+developing+hippocampal+area+CA1.">Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).</li><li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Ziv, N. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+role+of+dendritic+filopodia+in+synaptogenesis+and+spine+formation.">Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation.</a> Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).</li><li>Lohmann, C., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+local+calcium+signaling+in+rapid+synaptic+partner+selection+by+dendritic+filopodia.">A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia.</a> Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).</li><li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+formation+and+stabilization.">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+human+and+mouse+postsynaptic+proteomes+finds+high+compositional+conservation+and+abundance+differences+for+key+synaptic+proteins.">Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins.</a> PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+proteome,+diseases+and+evolution+of+the+human+postsynaptic+density.">Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density.</a> Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+telencephalin+and+ERM+family+proteins+mediates+dendritic+filopodia+formation.">Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).</li><li>Mao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+Conduct+Target+Selection+in+Cortical+Neurons+Using+Differences+in+Signal+Kinetics+of+a+Single+Kinase.">Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase.</a> Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).</li><li>Matsuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin+slows+spine+maturation.">Telencephalin slows spine maturation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).</li><li>Raemaekers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-mediated+endosomal+transport+of+Telencephalin+affects+dendritic+filopodia-to-spine+maturation.">ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation.</a> The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).</li><li>Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalon-specific+antigen+identified+by+monoclonal+antibody.">Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).</li><li>Yoshihara, Y., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin:+a+neuronal+area+code+molecule?.">Telencephalin: a neuronal area code molecule?.</a> Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).</li><li>Annaert, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+telencephalin+and+the+amyloid+precursor+protein+predicts+a+ring+structure+for+presenilins.">Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins.</a> Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+induces+phosphorylation+of+ezrin/radixin/moesin+actin-binding+proteins+through+binding+to+its+novel+neuronal+receptor+telencephalin.">Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).</li><li>Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Actinin-dependent+cytoskeletal+anchorage+is+important+for+ICAM-5-mediated+neuritic+outgrowth.">alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).</li><li>Esselens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+1+mediates+the+turnover+of+telencephalin+in+hippocampal+neurons+via+an+autophagic+degradative+pathway.">Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway.</a> Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).</li><li>Furutani, Y., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+Dendritic+Filopodia-Rich+Fraction+Isolated+by+Telencephalin+and+Vitronectin+Interaction.">Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).</li><li>Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li><li>Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+the+C-terminal+domain+regulates+cell+surface+expression+of+the+NMDA+receptor+NR1+subunit.">Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).</li><li>Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+without+NMDA+receptor+function+in+culture.">Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture.</a> European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).</li></ol>

細胞接着分子TLCNと細胞外マトリックスタンパク質ビトロネクチンとの親和性を用いた樹状フィロポディアリッチ画分の精製方法を開発した。PSD画分と比較して、樹状フィロポディアが豊富な画分から未熟なシナプスに作用するシナプスタンパク質を同定することができる。したがって、樹状フィロポディア富率の構成成分は、74%によってPSD画分のものと異なる。PSD分画とは異なり、培養海馬...

樹状フィロポディアは脊椎の前駆体であると考えられている。樹状フィロポディアのアクチンフィラメントは、その延長と引き込みを調節する1,2,3.軸と接触した後、選択された樹状フィロポディアは脊椎に成熟を開始し、シナプスが形成され、4、5.脊椎の成分は、樹状密度画率6、7の包括的な分析から決定されたが、樹状フィロポディアの成分はほとんど知られていない。テレスファリン(TLCN)、ERM、SynGAP、Ras、PI3キナーゼ、Akt、mTOR、ポロ様キナーゼ2、CaMKII、シンデカン-2、パラレミン-1、ARF6、およびEphBBがデンドリックフィロポダイヤ形成5、8、9を調節することが示されている。 ,10,11, 樹状フィロポディアに存在する分子の包括的な分析のための方法が開発されていない間.
TLCN(ICAM-5)は、最もrostral脳セグメントにおける脊椎ニューロンによって特異的に発現され、テレスファロン12である。TLCNは、その細胞外領域に9つのIg様ドメイン、膜領域、および細胞質尾13を有する。TLCNは、その細胞外領域におけるビトロネクチン(VN)およびLFA-1インテグリンに結合し、その膜領域におけるプレセニリンに、そして細胞質領域5、8、14、15におけるホスホ-ERMおよびα-アクチニンに結合する。 、16.TLCNは、脊椎および樹状シャフト8、16の樹状フィロポディアおよびα-アクチニンの先端にリン-ERMを介してアクチン細胞骨格に結合する。
我々は、TLCNの過剰発現が樹状フィロポディア形成を増強し、フィロポディア10への脊椎の復帰を誘導することを示した。TLCN細胞質領域に結合したエズリンの構成活性形態と高められた樹状フィロポディア形成8.したがって、TLCNは、アクチン結合タンパク質を介して樹状フィロポディア形成を調節する。Esselensらは、マイクロビーズが培養ニューロン17にTLCN蓄積を誘導することを実証した。我々は、TNコーティングされたマイクロビーズの周りの神経デンドライト上に、TLCN依存的な方法15で食細胞性カップ構造が形成されることを示した。樹状フィロポディアの成分は、食中毒カップのものと類似しています。樹状フィロポディアを採取することは困難ですが、磁気マイクロビーズを使用して食中毒カップを収集することは比較的容易です。そこで、樹状フィロポディア18の代わりに食細胞性カップを精製する方法を開発した。ここでは、樹状フィロポディアが豊富な画分の精製方法について説明する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 ml Low Binding MCT</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>39640T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic cell culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-Actinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-9026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ezrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone3C12, SAB4200806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Galphaq</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>sc-393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>clone AP20, MAB3418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Moesin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone 38/87, M7060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLCbeta1</td>
			<td>Santacuz</td>
			<td>sc-5291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PSD95</td>
			<td>MA2</td>
			<td>ABR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Spectrin beta</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>0080085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08122.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chrolide, hydrous</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-19735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-6645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-T520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>i-Inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>Fuji Film</td>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>For detection of luminescence from WB membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic polystyrene microbeads</td>
			<td>Sperotech</td>
			<td>PM-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acid solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11130-051</td>
			<td>30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-slab size electrophoresis system</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>AE-6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin / Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Nacali</td>
			<td>28360-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R9504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain 2 Kit wako</td>
			<td>Wako</td>
			<td>291-5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1703940JA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>For production of ultra pure water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of the dendritic filopodia-rich fraction

樹状フィロポディアは、アクチンフィラメントに基づいて薄く長い突起であり、それらは、ターゲット軸を検索するかのように拡張し、後退します。樹状フィロポディアが標的軸線との接触を確立すると、それらは脊椎に成熟し始め、シナプスの形成につながる。テレンセファリン(TLCN)は樹状フィロポディアに豊富に局在し、徐々に脊椎から除外される。培養海馬ニューロンにおけるTLCNの過剰発現は、樹状性フィロポディア形成を誘導する。我々は、テレスファリンが細胞外マトリックス分子、ビトロネクチンに強く結合することを示した。ビトロネクチンコーティングマイクロビーズは、神経デンドライト上の食器細胞性カップ形成を誘発した。食細胞カップでは、TLCN、リン酸化エズリン/ラジキシン/モエシン(ホスホ-ERM)、F-アクチンなどのTLCN結合タンパク質が蓄積され、食中毒カップの成分が樹状フィロポディアのものと類似していることを示唆している。そこで、樹状フィロポディアの代わりに食細胞性カップを精製する方法を開発した。磁気ポリスチレンビーズは、海馬ニューロンの培養培地に豊富に存在し、神経デンドライト上の食細胞性カップ形成を誘導するビトロネクチンでコーティングされた。インキュベーションの24時間後、ファゴサイトカップを洗剤で軽度に可溶化し、磁石セパレータを用いて回収した。ビーズを洗浄した後、結合タンパク質をタンパク質をタンパク質をタンパク質をタンパク質でタンパク質にして、銀染色およびウェスタンブロッティングにより分析した。結合画分では、TLCNおよびアクチンが豊富に存在していた。さらに、画分から同定された多くのタンパク質は樹状フィロポディアに局在した。したがって、結合分数を樹状フィロポディアリッチ画として命名した。この記事では、樹状フィロポディアリッチ画の精製方法に関する詳細について説明します。

培養海馬ニューロンにおいて、TLCNは樹状フィロポディア、シャフト、およびソマに豊富に局在し、F-アクチンと共局所化した(図1A、B)。培養海馬ニューロンにポリスチレンマイクロビーズを添加すると、ビーズは培養培地中の胎児ウシ血清(FBS)由来のビトロネクチン(VN)で自動的に被覆された。彼らは主にデンドライトに結合し、彼ら...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction at JoVE.com

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

このプロトコルでは、樹状性フィロポジア間の特異的かつ強い親和性を利用して、培養海馬ニューロン上の食中毒カップ様突起構造から樹状フィロポジアが豊富な画分を精製する方法を紹介する。接着分子、TLCN、および細胞外マトリックス分子、ビトロネクチン。

樹状フィロポディアリッチ画の精製

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

PSD画分と比較して、樹状性フィロポディアリッチ分画の周りの未熟シナプスに作用するシナプスタンパク質を同定することができる。私たちは、貪食性キャップ形成を誘導するために生きたニューロンを使用しました。この技術の主な利点は、人工起源における活性タンパク質が樹状性フィロポディアリッチな画分から同定できることである。始めるには、100mgのビタミンB5、100mgのコリンクロライド、100mgの葉酸、180mgのI-イノシトール、ビタミンB3100mg、ビタミンB6塩酸塩100mg、および100mgのチアミン塩酸塩を500mgの超純水系水質物酸塩に溶解させて200xビタミンミックスを調製します。50mlチューブにアリコートを慎重に混ぜ、摂氏20度で保存します。リボフラビン溶液を調製するには、磁気攪拌機を用いて500mgの超純水に100mgのリボフラビンを溶解する。50mlチューブにアリコートを慎重に混ぜ、摂氏20度で保存してください。1モルの二塩化カルシウムを調製するために、磁気攪拌機を用いて50mlの超純水に塩化カルシウム二水和物7.35グラムを溶解する。最小必須培地調製のために溶解する塩化カリウムの400mg、塩化ソドゥムの800mg、2、200mgの重炭酸ナトリウム、158mgのリン酸ナトリウム単塩基二水和物、7、000mgのD-グルコース、および200mgの硫酸ヘプタ水和物、および950mlの超純水を使用して、アパラメを用いた。次に、磁気攪拌機に一定の攪拌を伴う1mlピペットを使用して、滴下方式で1.8mlの二塩化カルシウム1.8mlをMEMに加えます。次に塩酸を加え、MEMのpHをpH7.25に調整します。次に、5 ml の 200x ビタミンミックスと 200 マイクロリットルのリボフラビン溶液を MEM に加えます。溶液の体積を超純水で1000mlに調整します。0.22ミクロンのフィルターシステムを使用して溶液をフィルターし、摂氏4度で保存します。10x DNase-1ストック溶液を調製するために、100mgのDNA-1をHBSSの12.5mlに溶解する。0.22ミクロンのフィルターを通してフィルター、1.5 mlの管のアリコート、および20°Cで管を貯える。Ara-Cストック溶液調製用に8.93mlの超純水に25mgのAra-Cを溶解する。0.22ミクロンのフィルター、1.5mlチューブのアリコートを通してフィルターし、摂氏20度で保存します。メッキ培地を調製するには、1mlのMEMアミノ酸溶液、1モルHEPESの750マイクロリットル、B27の1ml、200ミリモルグルタミンの125マイクロリットル、ペニシリンストレプトマイシン250マイクロリットル、2.5mlの胎児牛血清、および44.375mlのMEM mlで混合する。停止培地を調製するために、MEMアミノ酸溶液1ml、1モルHEPESの750マイクロリットル、FBSの5ml、および43.25mlのMEMを50mlチューブに混合する。HBSSを調製するには、15ミリモルHEPESを補充し、49.25mlのHBSS、および1モルHEPESの750マイクロリットルを混合する。ポリリジンコーティングされた皿の準備のために、25°Cで1日ポリl-リジン臭化水素化物のmlあたり0.2 mgで35ミリメートルプラスチック細胞培養皿をコーティングします。次に、2mlの超純水で皿を3回洗い、使用するまで摂氏25度で1.5mlのストップミディアムでインキュベートします。解剖された海馬を、HBSSの2.5%トリプシンと10X Dnase-1のそれぞれ500マイクロリットルを含む混合物でインキュベートし、15ミリモルHEPES、pH 7.2、37°Cで37度摂氏37度で3分毎に攪拌します。その後、海馬をストップミディアムの10mlに移し、摂氏4度で5分間インキュベートしてトリプシンを不活性化します。次に、解剖した海馬を摂氏4度で10mlの新鮮な停止培地で5分間インキュベートする。海馬を10mlの新鮮な停止培地に移し、摂氏4度でさらに5分間インキュベートします。次いで、海馬を停止培地の900マイクロリットルに、15mlチューブ内の10X Dnase-1の100マイクロリットルに移動させる。1 ml ピペットを使用して、海馬を分離ニューロンに 20 回ピペット化して分離します。9mlのメッキ培地を加え、70ミクロンの細胞ストレーナーを通して50mlのチューブにフィルターを入れる。メッキ媒体中の1ミリリットル当たり4番目の細胞に3.5倍の10倍に調整して、ヘモサイトーメーターを使用して細胞の数を数えます。次に、ポリl-リジンコーティングされた食器から停止培地を吸引する。コーティングされた皿の細胞の皿あたりの皿あたり2mlを皿に入れ、60-64時間摂氏37度で5%の二酸化炭素の下でインキュベートする。インキュベーションの後、ニューロンにAra-Cストック溶液の2マイクロリットルを加え、ゆっくりと皿を振ります。培養液を摂氏37度で5%の二酸化炭素の下で変えずに、加湿箱に入れておいてください。培養ニューロンを含む20皿に最初に1皿あたり300万個の磁気ポリスチレンマイクロビーズを追加して、インビトロで13日後に樹状フィロポディア豊富な分画を精製します。1日後、1mlのPBSでニューロンを3回痛みで洗浄し、培地と非結合マイクロビーズを除去します。PBSを除去した後、リシスバッファーの1皿あたり500マイクロリットルでニューロンを溶精します。次に、細胞スクレーパーでライセートを回収し、10個の低タンパク質結合マイクロチューブにリセートを移す。マグネットのセパライにチューブをセットし、1分間待ちます。上清を収集し、銀染色およびウェスタンブロット分析のための非結合分画として使用します。次に、ビーズを新しい低タンパク質結合マイクロチューブに移し、磁気分離器に1分間セットします。上清を完全に取り除き、500マイクロリットルのリシスバッファーを加えます。渦ミキサーを使用してビーズを15秒間洗います。ビーズの洗浄を10回繰り返し、上清を取り除きます。1X SDSサンプルバッファーの50マイクロリットルを添加してビーズにタンパク質を溶出し、5分間摂氏98度でチューブを沸騰させます。860xG 3000 RPMでチューブを10秒間遠心し、1分間磁気分離器にチューブをセットします。上清を収集し、バインドされた分数として使用します。BCAタンパク質アッセイにより非結合および結合タンパク質画分の濃度を測定します。ブロモフェニルブルーでプロチエン溶液を視覚化し、SDSページのマイクロリットル当たり5ナノグラムに濃度を調整します。5~20%の勾配ゲルを使用して、SDSページでバインドされた分数と非結合分数を分離します。銀染色ゲル。最後に、原稿に従って適切な一次および二次抗体を用いてウェスタンブロット。培養された海馬ニューロンにおいて、TLCNは樹状結腸状フィロポディア、シャフト、およびソーマに豊富に局在し、F-actinと共局化した。コードされたビーズは主に樹状突起に結合し、神経樹状突起にTLCNおよびF-アクチンを蓄積することによって食作用性カップの形成を誘導した。Thorecense画像は、食細胞性カップ形成が樹状突起におけるTLCNの存在に極めて重要な依存していることを示した。食細胞性カップは野生型海馬ニューロンでのみ形成されたが、TLCNの非効率的な海馬ニューロンでは形成されなかった。SDSページの結果は、タンパク質バンドパターンが非結合および結合画分でほぼ同じであったが、50キロおよび70キロダルトンでの強度は、結合された画分において非結合画分のそれよりも低いことを示した。しかし、バンド強度は、TLCN非効率的な培養海馬ニューロンから調製された非結合画分と結合画分の間で明らかに異ならなかった。非結合および結合画分のウェスタンブロット分析は、TLCNおよびVNが主に結合された画分で検出されたことを示した。アクチン、エズリン、Gアルファq、PLCベータ1、MAP-2、およびスペクトリンは、結合画分と非結合画分の両方で検出された。モエシン、PSD-95、α-アクチニン、α-チューブリンは、非結合画分で検出された。マイクロビーズの被覆タンパク質が変化する場合、この手順はアッセイ相互作用を同定するために適用することができる。この技術は、人工物質に取り組んでいるタンパク質を同定することができた。ですから、人工起源のメカニズムを定量化できると考えています。精神障害に関連する新しいタンパク質は、樹状性フィロポディアが豊富な分画から同定できると考えています。そして、治療に拡張することができます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

培養中枢神経系ニューロンの樹状突起スパイン形態の解析

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

培養交感神経ニューロンの樹状成長を誘導する

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

器官切片培養におけるプルキンエ細胞の樹状突起の形態分析

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

マウスの海馬領域の歯状回における樹状樹枝状分岐の評価

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Purification of Mouse Brain Vessels

マウス脳血管の精製

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

列およびレイヤーで樹状形態を分析します

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Golgi-Cox法を用いた老齢マウスにおける海馬の樹状突起の複雑さの評価

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

脳の細胞外空間の体積分率とねじれを定量するためのテトラメチルアンモニウムによるリアルタイムイオントフォレシス

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

ショウジョウバエのニューロン樹状分枝複雑さの定量解析

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...