Name: purification of the dendritic filopodia-rich fraction
Uploaded: 2019-05-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction at JoVE.com

Vi takker Shigeo Okabe og Hitomi Matsuno for lav tetthet kultur hippocampus neurons, Masayoshi Mishina for TLCN-mangelfull mus, Sachiko Mitsui og Momoko Shiozaki for teknisk assistanse, og medlemmer av Yoshihara laboratoriet for nyttige diskusjoner . Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI Grant NOS. JP20700307, JP22700354 og JP24500392 og MEXT KAKENHI Grant NOS. JP23123525 til YF og JP20022046, JP18H04683 og JP18H05146 til åå.

Alle metoder beskrevet her over ha blitt anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité av RIKEN Wako.
1. kultur hippocampus neurons
<ol><li>Utarbeidelse av kultur medium
	<ol>
<li>Utarbeidelse av 200x vitamin mix. Oppløse 100 mg av D-Pantotensyre acid hemicalcium salt, 100 mg av kolin klorid, 100 mg folsyre, 180 mg av i-Inositol, 100 mg av Niacinamide, 100 mg pyridoxal HCl, og 100 mg av Tiamin HCl i 500 mL av ultrarent vann ved hjelp av en magnetisk rører. L?...

<ol>
	<li>Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+via+dendritic+filopodia+in+developing+hippocampal+area+CA1.">Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).</li><li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Ziv, N. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+role+of+dendritic+filopodia+in+synaptogenesis+and+spine+formation.">Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation.</a> Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).</li><li>Lohmann, C., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+local+calcium+signaling+in+rapid+synaptic+partner+selection+by+dendritic+filopodia.">A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia.</a> Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).</li><li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+formation+and+stabilization.">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+human+and+mouse+postsynaptic+proteomes+finds+high+compositional+conservation+and+abundance+differences+for+key+synaptic+proteins.">Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins.</a> PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+proteome,+diseases+and+evolution+of+the+human+postsynaptic+density.">Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density.</a> Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+telencephalin+and+ERM+family+proteins+mediates+dendritic+filopodia+formation.">Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).</li><li>Mao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+Conduct+Target+Selection+in+Cortical+Neurons+Using+Differences+in+Signal+Kinetics+of+a+Single+Kinase.">Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase.</a> Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).</li><li>Matsuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin+slows+spine+maturation.">Telencephalin slows spine maturation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).</li><li>Raemaekers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-mediated+endosomal+transport+of+Telencephalin+affects+dendritic+filopodia-to-spine+maturation.">ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation.</a> The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).</li><li>Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalon-specific+antigen+identified+by+monoclonal+antibody.">Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).</li><li>Yoshihara, Y., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin:+a+neuronal+area+code+molecule?.">Telencephalin: a neuronal area code molecule?.</a> Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).</li><li>Annaert, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+telencephalin+and+the+amyloid+precursor+protein+predicts+a+ring+structure+for+presenilins.">Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins.</a> Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+induces+phosphorylation+of+ezrin/radixin/moesin+actin-binding+proteins+through+binding+to+its+novel+neuronal+receptor+telencephalin.">Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).</li><li>Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Actinin-dependent+cytoskeletal+anchorage+is+important+for+ICAM-5-mediated+neuritic+outgrowth.">alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).</li><li>Esselens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+1+mediates+the+turnover+of+telencephalin+in+hippocampal+neurons+via+an+autophagic+degradative+pathway.">Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway.</a> Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).</li><li>Furutani, Y., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+Dendritic+Filopodia-Rich+Fraction+Isolated+by+Telencephalin+and+Vitronectin+Interaction.">Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).</li><li>Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li><li>Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+the+C-terminal+domain+regulates+cell+surface+expression+of+the+NMDA+receptor+NR1+subunit.">Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).</li><li>Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+without+NMDA+receptor+function+in+culture.">Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture.</a> European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).</li></ol>

Vi utviklet en rensing metode for dendrittiske filopodia-rike brøkdel ved hjelp av affinitet mellom celle vedheft molekylet TLCN og ekstracellulære Matrix protein vitronectin. Sammenlignet med PSD brøkdel, kan det være mulig å identifisere Synaptic proteiner opptrer på umodne synapse fra dendrittiske filopodia-rik brøk. Dermed er bestanddelene av dendrittiske filopodia-rik brøk er forskjellig fra de av PSD brøkdel av 74%. Forskjellig fra PSD brøkdel, brukte vi kultivert hippocampus neurons å aktivt danne phago...

Dendrittiske filopodia antas å være forløpere for pigger. Utgangen filamenter i dendrittiske filopodia regulere sin forlengelse og uttrekk1,2,3. Etter å ha kontaktet en axon, valgte dendrittiske filopodia begynne sin modning i pigger, og en synapse er dannet4,5. Komponenter av pigger har blitt bestemt fra omfattende analyse av postsynaptic tetthet fraksjoner6,7, mens komponenter av dendrittiske filopodia fortsatt i stor grad ukjent. Det har blitt vist at telencephalin (TLCN), erm, SynGAP, RAS, PI3 kinase, akt, mTOR, Polo-like kinase 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, og EphB regulere dendrittiske filopodia formasjon5,8,9 ,10,11, mens en metode ikke er utviklet for den omfattende analyse av molekyler til stede i dendrittiske filopodia.
TLCN (ICAM-5) er spesielt uttrykt ved spiny neurons i de mest rostral hjernen segmentet, Telencephalon12. TLCN har 9 IG-lignende domener i sin ekstracellulære region, en transmembrane region, og en cytoplasmatiske hale13. TLCN binder seg til vitronectin (vn) og LFA-1 integrin i sin ekstracellulære region, til presenilin i sin transmembrane region, og til fosfat-erm og α-actinin i sin cytoplasmatiske region5,8,14,15 ,16. TLCN binder seg til utgangen cytoskeleton gjennom fosfat-erm på tuppen av dendrittiske filopodia og α-actinin i pigger og dendrittiske aksler8,16.
Vi viste at overuttrykte av TLCN forbedret dendrittiske filopodia formasjon og indusert reversion av pigger til filopodia10. Den konstituerende aktive formen av Ezrin bundet til TLCN cytoplasmatiske regionen og forbedret dendrittiske filopodia formasjon8. Således regulerer TLCN dendrittiske filopodia formasjon gjennom utgangen-bindende proteiner. Esselens et al. demonstrerte at mikroperler indusert TLCN akkumulering på kultivert neurons17. Vi viste at phagocytic Cup strukturer ble dannet på neuronal dendrites rundt VN-belagt mikroperler i en TLCN-avhengig måte15. Bestanddeler av dendrittiske filopodia er lik de av phagocytic koppen. Det er vanskelig å samle dendrittiske filopodia, men det er relativt lettere å samle phagocytic koppen ved hjelp av magnetisk mikroperler. Dermed har vi utviklet en metode for å rense phagocytic koppen i stedet for dendrittiske filopodia18. Her beskriver vi rensing metoden for dendrittiske filopodia-rik brøk.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 ml Low Binding MCT</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>39640T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic cell culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-Actinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-9026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ezrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone3C12, SAB4200806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Galphaq</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>sc-393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>clone AP20, MAB3418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Moesin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone 38/87, M7060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLCbeta1</td>
			<td>Santacuz</td>
			<td>sc-5291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PSD95</td>
			<td>MA2</td>
			<td>ABR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Spectrin beta</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>0080085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08122.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chrolide, hydrous</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-19735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-6645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-T520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>i-Inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>Fuji Film</td>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>For detection of luminescence from WB membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic polystyrene microbeads</td>
			<td>Sperotech</td>
			<td>PM-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acid solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11130-051</td>
			<td>30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-slab size electrophoresis system</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>AE-6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin / Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Nacali</td>
			<td>28360-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R9504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain 2 Kit wako</td>
			<td>Wako</td>
			<td>291-5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1703940JA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>For production of ultra pure water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of the dendritic filopodia-rich fraction

Dendrittiske filopodia er tynne og lange utstikkende basert på utgangen filament, og de strekker og trekker seg som om du søker etter et mål axon. Når dendrittiske filopodia etablere kontakt med en mål axon, begynner de å modnes i pigger, noe som fører til dannelsen av en synapse. Telencephalin (TLCN) er rikelig lokalisert i dendrittiske filopodia og blir gradvis ekskludert fra pigger. Overuttrykte av TLCN i kultivert hippocampus neurons induserer dendrittiske filopodia formasjon. Vi viste at telencephalin sterkt binder seg til en ekstracellulære matrise molekyl, vitronectin. Vitronectin-belagt mikroperler indusert phagocytic kopp formasjon på neuronal dendrites. I phagocytic Cup, TLCN, TLCN-bindende proteiner som fosforylert Ezrin/Radixin/Moesin (fosfat-ERM), og F-utgangen er akkumulert, noe som tyder på at komponentene i phagocytic koppen er lik de av dendrittiske filopodia. Derfor utviklet vi en metode for rensing av phagocytic koppen i stedet for dendrittiske filopodia. Magnetiske polystyren perler var belagt med vitronectin, som er rikelig til stede i kulturen medium for hippocampus neurons og som induserer phagocytic kopp formasjon på neuronal dendrites. Etter 24 h av inkubasjons, phagocytic koppene var mildt solubilized med vaskemiddel og samlet inn ved hjelp av en magnet separator. Etter vask av perlene, ble de bindende proteinene eluert og analysert av sølv flekker og vestlig blotting. I bindingen brøk, TLCN og utgangen var rikelig til stede. I tillegg ble mange proteiner identifisert fra fraksjonen lokalisert til dendrittiske filopodia; dermed kalte vi bindingen brøk som dendrittiske filopodia-rik brøk. Denne artikkelen beskriver detaljer om rensing metoden for dendrittiske filopodia-rik brøk.

I kulturperler hippocampus neurons, var TLCN rikelig lokalisert til dendrittiske filopodia, aksel, og Soma og colocalized med F-utgangen (figur 1a, B). Når polystyren mikroperler ble lagt til kultivert hippocampus neurons, ble perlene automatisk belagt med vitronectin (VN) avledet fra fosterets storfe serum (FBS) i kulturen medium; de var hovedsakelig bundet til dendrites, og de induserte dannelsen av phagocytic kopper (...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction at JoVE.com

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

I denne protokollen introduserer vi en metode for rensing av dendrittiske filopodia fraksjon fra phagocytic Cup-lignende protrusion struktur på kultivert hippocampus neurons ved å utnytte den spesifikke og sterke affinitet mellom en dendrittiske filopodial vedheft molekyl, TLCN, og en ekstracellulære matrise molekyl, vitronectin.

Rensing av dendrittiske Filopodia-rik brøk

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Sammenlignet med PSD-fraksjonen kan det være mulig å identifisere det synaptiske proteinet som virker på den umodne synapsen rundt dendrittiske filopodiarike fraksjonen. Vi brukte levende nevron for å indusere fagocytisk hettedannelse. Den største fordelen med denne teknikken er at aktivt protein i kunstig genese kan identifiseres fra dendrittiske filopodia rik fraksjon.For å begynne, forberede 200x vitamin mix ved å oppløse 100 mg vitamin B5, 100 mg kolin klorid, 100 mg folsyre, 180 mg I-inositol, 100 mg vitamin B3, 100 mg vitamin B6 hydroklorid, og 100 mg tiaminhydroklorid i 500 ml ultrapure vann ved hjelp av en magnetisk røre. Bland aliquot forsiktig i 50 ml rør og oppbevar den ved 20 grader Celsius. For å forberede riboflavin oppløsning, oppløs 100 mg riboflavin i 500 mg ultrarent vann ved hjelp av en magnetisk rører.Bland aliquot forsiktig i 50 ml rør og oppbevar ved 20 grader Celsius. For å forberede en molar kalsiumdiklorid oppløse 7,35 gram kalsiumkloriddihydrat i 50 ml ultrapure vann ved hjelp av en magnetisk rører. For minimum essensiell medium preparat oppløses 400 mg kaliumklorid 6, 800 mg sodumklorid, 2, 200 mg natriumbikarbonat, 158 mg natriumfosfatmonobasisk dihydrat, 7, 000 mg D-glukose og 200 mg magnesiumsulfatheptahydrat og 950 ml ultrarent vann, ved hjelp av magnetisk rører.Deretter bruker du en 1 ml pipette med en konstant agitasjon på en magnetisk rører for å tilsette 1,8 ml 1 molar kalsiumdiklorid til MEM i en dråpe for dråpe. Tilsett deretter saltsyre for å justere pH-en til pH 7,25. Deretter legger du til 5 ml 200x vitaminblanding og 200 mikroliter riboflavin-oppløsning til MEM.Juster volumet volumet av oppløsningen til 1000 ml med ultrarent vann. Filtrer løsningen ved hjelp av et 0,22 mikron filtersystem og lagre den ved 4 grader Celsius. For å forberede 10x DNase-1 lagerløsning oppløses 100 mg Dnase-1 i 12,5 ml HBSS.Filtrer gjennom et 0,22 mikronfilter, aliquot i 1,5 ml rør, og lagre rørene ved 20 grader Celsius. For Ara-C lager oppløsning forberedelse oppløse 25 mg Ara-C i 8,93 ml ultrapure vann. Filtrer gjennom et 0,22 mikron filter, aliquot i 1,5 ml rør, og lagre på 20 grader Celsius.For å forberede platingmediet, bland 1 ml MEM aminosyreoppløsning, 750 mikroliter med 1 molar HEPES, 1 ml B27, 125 mikroliter på 200 millimolar glutamin, 250 mikroliter med penicillin-streptomycin, 2,5 ml fetal storfe serum og 44,375 ml MEM i et 50 ml rør. For å forberede stoppmediet, bland 1 ml MEM aminosyreoppløsning, 750 mikroliter med 1 molar HEPES, 5 ml FBS og 43,25 ml MEM i et 50 ml rør. For å forberede HBSS, supplert med 15 millimolar HEPES, bland 49,25 ml HBSS og 750 mikroliter med 1 molar HEPES.For poly-l-lysinbelagte retter forberedelse, coat 35 mm plast celle kultur retter med 0,2 mg per ml poly-l-lysin hydrobromid for en dag på 25 grader Celsius. Deretter vasker du oppvasken med 2 ml ultrarent vann tre ganger og inkuberer dem med 1,5 ml Stop Medium ved 25 grader Celsius til bruk. Inkuber den dissekerte hippocampi i en blanding som inneholder 500 mikroliter hver av 2,5% trypsin og 10X Dnase-1 i HBSS supplert med 15 millimolar HEPES, pH 7,2, ved 37 grader Celsius i 15 minutter med agitasjon hvert tredje minutt.Deretter overfører hippocampi til 10 ml av Stop Medium og inkuberer ved 4 grader Celsius i 5 minutter for å inaktivere trypsin. Deretter inkuberer du den dissekerte hippocampi i 10 ml friskt stoppmedium ved 4 grader Celsius i 5 minutter. Flytt hippocampi i 10 ml friskt stoppmedium og inkuber ved 4 grader Celsius i ytterligere 5 minutter.Deretter flytter du hippocampi inn i 900 mikroliter av stoppmediet og 100 mikroliter med 10X Dnase-1 i et 15 ml rør. Bruk en 1 ml pipette til å ta avstand fra hippocampi i isolerte nevroner ved å pipettering 20 ganger. Tilsett 9 ml plating medium, og filtrer gjennom en 70 mikron celle sil, i en 50 ml rør.Telle antall celler ved hjelp av et hemocytometer og en justering til 3,5 ganger 10 til de fjerde cellene per milliliter i plating medium. Deretter aspirerer du stoppmediet fra poly-l-lisinebelagte retter. Plate 2 ml per tallerken av cellene på belagte retter og inkubere under 5% karbondioksid ved 37 grader Celsius i 60-64 timer.Etter inkubasjonen, tilsett 2 mikroliter Ara-C lagerløsning til nevronene og rist parabolen sakte. Hold kulturrettene i en fuktet boks uten å endre kulturmediet under 5% karbondioksid ved 37 grader Celsius. Rens den dendrittiske filopodiarike fraksjonen etter 13 dager in vitro ved først å legge til tre millioner magnetiske polystyrenmikroperler per tallerken til 20 retter som inneholder de kultiverte nevronene.Etter en dag vask nevronene i 1 ml PBS med agiation tre ganger for å fjerne middels og ubundet mikroperler. Etter å ha fjernet PBS, lyse nevronene med 500 mikroliter per tallerken av lysis buffer. Deretter samler du lysatet med en celleskraper og overfører lysatet til 10 lave proteinbindende mikrorør.Sett rørene på en magnetseparer og vent i ett minutt. Samle supernatant og bruke den som den ubundne fraksjonen for sølvfarging og vestlig flekkanalyse. Deretter overfører du perlene til et nytt lavt proteinbindende mikrorør og setter på en magnetisk separatør i ett minutt.Fjern det supernatante fullstendig, og tilsett 500 mikroliter av lysisbufferen. Vask perlene med en Vortex-mikser i 15 sekunder. Gjenta vaskingen av perlene 10 ganger og fjern det overnaturlige.Elute proteiner ned til perlene ved tilsetning av 50 mikroliter av 1X SDS prøvebuffer og kok røret ved 98 grader Celsius i 5 minutter. Sentrifuger røret ved 860xG 3000 RPM i 10 sekunder og sett røret på en magnetisk separatør i ett minutt. Samle supernatant og bruke den som den bundne brøken.Mål konsentrasjonene av de ubundet og bundne proteinfraksjonene ved BCA-proteinanalysen. Visualiser protienløsninger med bromofenyblå og juster konsentrasjonen til 5 nanogram per mikroliter for SDS-siden. Skill de bundne og ubundne brøkene etter SDS-siden ved hjelp av en 5-20 % graderingsgel.Sølv flekk gelen. Til slutt, Western blot ved hjelp av passende primære og sekundære antistoffer i henhold til manuskriptet. I kultiverte hippocampale nevroner ble TLCN rikelig lokalisert til dendrittiske filopodia, aksel og soma og sam-lokalisert med F-actin.De kodede perlene var hovedsakelig bundet til dendritter og indusere dannelsen av fagocytiske kopper ved akkumulering av TLCN og F-actin på nevronale dendritter. Thorecense bilder viste at fagocytisk koppdannelse var avgjørende avhengig av tilstedeværelsen av TLCN i dendritter. De fagocytiske koppene ble bare dannet på ville hippocampale nevroner, men ikke på TLCN mangelfulle hippocampal nevroner.SDS-sideresultater viste at proteinbåndmønstrene var nesten de samme for de ubundet og bundne fraksjonene, men intensitetene på 50 og 70 kilodalton, i den bundne fraksjonen var lavere enn de i den ubundne fraksjonen. Imidlertid var båndintensiteten ikke åpenbart forskjellig mellom de ubundne og bundne fraksjonene utarbeidet fra TLCN-mangelfulle kultur hippocampal nevroner. Western blot analyse av de ubundet og bundne brøkene viste at TLCN og VN hovedsakelig ble oppdaget i den bundne fraksjonen.Actin, Ezrin, G alpha q, PLC beta 1, MAP-2 og Spectrin, ble oppdaget i både bundne og ubundne fraksjoner. Moesin, PSD-95, alfa-Actinin og alfa-Tubulin ble oppdaget i den ubundne fraksjonen. Hvis beleggproteinet i mikroperlene endres, kan denne prosedyren brukes til å identifisere analyseinteraksjon.Denne teknikken kan identifisere proteinet som arbeider med kunstige stoffer. Så vi tror at mekanismen kunstig genese kan kvantifiseres. Vi tror at nytt protein forbundet med psykisk lidelse kan identifiseres fra den dendrittiske filopodia-rike fraksjonen.Og kan utvides til terapien.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Inducing dendrittiske Veksten i dyrkede sympatiske Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontoforese av glutamat og GABA: Et nyttig verktøy for å etterforske Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Vurdering av Dendritic arborization i Dentate Gyrus av hippocampus regionen i Mus

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Rensing av musehjerne Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analysere Dendritic Morfologi i kolonner og Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Vurdering av hippocampal dendritisk kompleksitet hos gamle mus ved bruk av Golgi-Cox-metoden

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Real-time Iontophoresis med tetrametylammonium for å kvantifisere volumfraksjon og tortuositet i hjernens ekstracellulære rom

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Kvantitativ analyse av Neuronal dendrittiske Arborization kompleksitet i Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...