Name: purification of the dendritic filopodia-rich fraction
Uploaded: 2019-05-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction at JoVE.com

Мы благодарим Сигэо Окабе и Хитоми Мацуно за культуру низкой плотности гиппокампа нейронов, Масаёси Мишина за несовершенных мышей TLCN, Сатико Мицуи и Момоко Сиодзаки за техническую помощь, а также членов лаборатории Yoshihara для полезных обсуждений . Эта работа была поддержана JSPS KAKENHI Грант Нос. JP20700307, JP22700354, а также JP24500392 и MEXT KAKENHI Грант Нос. JP23123525 до YF и JP20022046, JP18H04683 и JP18H05146 до YY.

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию RIKEN Wako.
1. Культура Гиппокампальных нейронов
<ol><li>Подготовка культуры среды
	<ol>
<li>Приготовление 200-х витаминной смеси. Растворите 100 мг D-пантотеновой кис...

<ol>
	<li>Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+via+dendritic+filopodia+in+developing+hippocampal+area+CA1.">Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).</li><li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Ziv, N. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+role+of+dendritic+filopodia+in+synaptogenesis+and+spine+formation.">Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation.</a> Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).</li><li>Lohmann, C., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+local+calcium+signaling+in+rapid+synaptic+partner+selection+by+dendritic+filopodia.">A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia.</a> Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).</li><li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+formation+and+stabilization.">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+human+and+mouse+postsynaptic+proteomes+finds+high+compositional+conservation+and+abundance+differences+for+key+synaptic+proteins.">Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins.</a> PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).</li><li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+proteome,+diseases+and+evolution+of+the+human+postsynaptic+density.">Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density.</a> Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+telencephalin+and+ERM+family+proteins+mediates+dendritic+filopodia+formation.">Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).</li><li>Mao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+Conduct+Target+Selection+in+Cortical+Neurons+Using+Differences+in+Signal+Kinetics+of+a+Single+Kinase.">Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase.</a> Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).</li><li>Matsuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin+slows+spine+maturation.">Telencephalin slows spine maturation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).</li><li>Raemaekers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-mediated+endosomal+transport+of+Telencephalin+affects+dendritic+filopodia-to-spine+maturation.">ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation.</a> The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).</li><li>Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalon-specific+antigen+identified+by+monoclonal+antibody.">Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).</li><li>Yoshihara, Y., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telencephalin:+a+neuronal+area+code+molecule?.">Telencephalin: a neuronal area code molecule?.</a> Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).</li><li>Annaert, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+telencephalin+and+the+amyloid+precursor+protein+predicts+a+ring+structure+for+presenilins.">Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins.</a> Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).</li><li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+induces+phosphorylation+of+ezrin/radixin/moesin+actin-binding+proteins+through+binding+to+its+novel+neuronal+receptor+telencephalin.">Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).</li><li>Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Actinin-dependent+cytoskeletal+anchorage+is+important+for+ICAM-5-mediated+neuritic+outgrowth.">alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).</li><li>Esselens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+1+mediates+the+turnover+of+telencephalin+in+hippocampal+neurons+via+an+autophagic+degradative+pathway.">Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway.</a> Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).</li><li>Furutani, Y., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+Dendritic+Filopodia-Rich+Fraction+Isolated+by+Telencephalin+and+Vitronectin+Interaction.">Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).</li><li>Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li><li>Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+the+C-terminal+domain+regulates+cell+surface+expression+of+the+NMDA+receptor+NR1+subunit.">Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).</li><li>Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+without+NMDA+receptor+function+in+culture.">Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture.</a> European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).</li></ol>

Мы разработали метод очистки дендритной фракции, богатой филоподией, используя сродство между молекулой клеточной адгезии TLCN и внеклеточным матричным белками vitronectin. По сравнению с фракцией PSD, можно было бы определить синаптические белки, действующие на незрелый синапс из дендритной ...

Дендритная филоподия считается предшественниками шипов. Актиновые нити в дендритной филоподии регулируютих расширение и опрокиды 1,2,3. После контакта с аксоном, выбранный дендритный филоподия начинает свое созревание в шипы, и синапс образуется4,5. Компоненты шипов были определены на основе всестороннегоанализа постсинаптических фракций плотности 6,7,в то время как компоненты дендритной филоподии остаются в значительной степени неизвестными. Было показано, что теленцефин (TLCN), ERM, SynGAP, Рас, PI3 киназы, Akt, mTOR, поло-как киназа 2, CaMKII, синдекан-2, паралемин-1, ARF6, и ЭфБ регулировать дендритное образование филоподии5,8,9 ,10,11, в то время как метод не был разработан для всестороннего анализа молекул, присутствующих в дендритной филоподии.
TLCN (ICAM-5) специально выражается колючими нейронами в самом ростральном сегменте мозга, теленефалионе12. TLCN имеет 9 Ig-подобных доменов в внеклеточной области, трансмембранной области, и цитоплазмический хвост13. TLCN связывается с витронектином (VN) и lfA-1 в его внеклеточной области, пресенилином в трансмембранной области, а также с фосфо-ЭРМ и А-актинином в его цитоплазменской области5,8,14,15 ,16. TLCN связывается с актином цитоскелетом через фосфо-ЭРМ на кончиках дендритной филоподии и актинина в шипах и дендритных валах8,16.
Мы показали, что переэкспрессия TLCN расширенной дендритной филоподии формирования и индуцированных реверсии шипов к филоподии10. Консилитативная активная форма эзрина связана с цитоплазменным регионом TLCN и усиленным дендритным образованием филоподия8. Таким образом, TLCN регулирует образование дендритного филоподии с помощью актиносвязных белков. Esselens et al. продемонстрировали, что микробусы индуцированные накопления TLCN на культурных нейронах17. Мы показали, что фагоцитные структуры чашки были сформированы на нейрональных дендритов вокруг VN покрытием микробусы в TLCN-зависимым образом15. Компоненты дендритной филоподии аналогичны фагоцитарной чашке. Трудно собрать дендритную филоподию, но собрать фагоцитарную чашку с помощью магнитных микробусов относительно легче. Таким образом, мы разработали метод очистки фагоцитарной чашки вместо дендритной филоподии18. Здесь мы описываем метод очищения дендритной фракции, богатой филоподией.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 ml Low Binding MCT</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>39640T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic cell culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-Actinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-9026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ezrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone3C12, SAB4200806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Galphaq</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>sc-393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>clone AP20, MAB3418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Moesin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>clone 38/87, M7060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLCbeta1</td>
			<td>Santacuz</td>
			<td>sc-5291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PSD95</td>
			<td>MA2</td>
			<td>ABR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Spectrin beta</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>0080085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08122.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chrolide, hydrous</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-19735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-6645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-T520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>i-Inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>Fuji Film</td>
			<td>LAS-1000 mini</td>
			<td>For detection of luminescence from WB membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic polystyrene microbeads</td>
			<td>Sperotech</td>
			<td>PM-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acid solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11130-051</td>
			<td>30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-slab size electrophoresis system</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>AE-6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin / Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Nacali</td>
			<td>28360-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R9504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain 2 Kit wako</td>
			<td>Wako</td>
			<td>291-5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1703940JA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>For production of ultra pure water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of the dendritic filopodia-rich fraction

Дендритная филоподия тонкие и длинные выступы на основе нити актина, и они расширяются и убираются, как будто ища целевой аксон. Когда дендритная филоподия устанавливает контакт с аксоном-мишенью, они начинают созревать в шипы, что приводит к образованию синапса. Теленцефин (ТЛКН) обильно локализован в дендритной филоподии и постепенно исключается из шипов. Переэкспрессия TLCN в культивированных гиппокампальных нейронов вызывает дендритное образование филоподии. Мы показали, что теленцефин сильно связывается с внеклеточной молекулой матрицы, витронэктином. Микрошарики с покрытием витронектина индуцированные фагоцитарные чаши на нейрональных дендритов. В фагоцитической чашке, TLCN, TLCN-связывающих белков, таких как фосфорилированный эзрин/ Радисин / Моезин (фосфо-ERM), и F-актин накапливаются, что свидетельствует о том, что компоненты фагоцитарной чашки похожи на дендритный филоподия. Таким образом, мы разработали метод очистки фагоцитарной чашки вместо дендритной филоподии. Магнитные бусы полистирола были покрыты витронектином, который обильно присутствует в культуре среды гиппокампа нейронов и который вызывает формирование фагоцитарной чашки на нейрональных дендритов. После 24 ч инкубации, фагоцитарные чашки были слегка растворимы с моющим средством и собраны с помощью магнитного сепаратора. После мытья бисера, связывающие белки были eluted и проанализированы серебра окрашивания и западного blotting. В связывающей фракции, TLCN и актин были обильно присутствуют. Кроме того, многие белки, идентифицированные из фракции, были локализованы в дендритную филоподию; Таким образом, мы назвали связывающую фракцию дендритной филоподией богатой фракцией. В этой статье описаны детали относительно метода очистки для дендритной фракции, богатой филоподией.

В культивированных гиппокампе нейронов, TLCN был обильно локализован дендритной филоподии, вала, и сома и colocalized с F-актин(Рисунок 1A, B). Когда полистирол микробусы были добавлены в культивированные гиппокампа нейронов, бисер были автоматически п?...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction at JoVE.com

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

В этом протоколе мы внедряем метод очистки дендритной филоподии богатой фракцией от фагоцитарной структуры выступа на культивированных гиппокампальных нейронах, воспользовавшись специфической и сильной близостью между дендритным филоподиалом молекула адгезии, TLCN и внеклеточная матричная молекула, витронектин.

Очистка дендритной филоподии богатой фракцией

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

По сравнению с PSD фракции, можно определить синаптический белок, действующий на незрелые синапс вокруг дендритных филоподия богатых фракции. Мы использовали живой нейрон, чтобы вызвать образование фагоцитовой крышки. Основным преимуществом этой техники является то, что активный белок в искусственном генезисе может быть идентифицирован из дендритной филоподии богатой фракции.Для начала приготовьте 200x витаминную смесь путем растворения 100 мг витамина B5, 100 мг холина хлорида, 100 мг фолиевой кислоты, 180 мг I-инозитол, 100 мг витамина В3, 100 мг соляного хлорида витамина В6 и 100 мг гидрохлорида тиамина в 500 мл ультрапурной воды с помощью магнитного мешалки. Тщательно перемешайте aliquot в 50 мл трубок и хранить его при 20 градусах по Цельсию. Чтобы подготовить раствор рибофлавина, растворите 100 мг рибофлавина в 500 мг ультрачистой воды с помощью магнитного мешалки.Аккуратно перемешайте алицит в 50 мл трубок и храните при 20 градусах по Цельсию. Для приготовления одного молярного дихлорида кальция растворяют 7,35 грамма дигидрата хлорида кальция в 50 мл ультрапурной воды с помощью магнитного мешалки. Для минимального необходимого среднего препарата растворяют 400 мг хлорида калия 6, 800 мг хлорида содума, 2 200 мг бикарбоната натрия, 158 мг фосфатного дигидрата натрия, 7000 мг D-глюкозы и 200 мг гептагидрата сульфата магния и 950 мл ультрапурной воды с использованием магнитного мешалки.Далее используйте 1 мл пипетки с постоянным возбуждением на магнитном мешалки, чтобы добавить 1,8 мл 1 дихлорида молярного кальция в MEM в капле образом. Затем добавьте соляную кислоту, чтобы настроить рН MEM до рН 7,25. Затем добавьте в MEM 5 мл витаминной смеси 200x и 200 микролитров раствора рибофлавина.Отрегулируйте объем раствора до 1000 мл с помощью ультрачистой воды. Фильтровать раствор с помощью системы фильтрации 0,22 микрона и хранить его при 4 градусах цельсия. Для приготовления 10x DNase-1 растворение бульона растворяет 100 мг Dnase-1 в 12,5 мл HBSS.Фильтр через фильтр 0,22 микрона, aliquot в 1,5 мл труб, и хранить трубки при 20 градусов по Цельсию. Для препарата бульона Ara-C растворяют 25 мг Ара-С в 8,93 мл ультрапурной воды. Фильтр через фильтр 0,22 микрона, aliquot в 1,5 мл труб, и хранить при 20 градусов по Цельсию.Чтобы подготовить Plating Medium, смешать 1 мл аминокислотного раствора MEM, 750 микролитров 1 молярного HEPES, 1 мл B27, 125 микролитров 200 миллимолярный глутамин, 250 микролитров пенициллина-стрептомицина, 2,5 мл сыворотки плода крупного рогатого скота и 44,375 мл MEM в 50 мл трубки. Для приготовления стоп-среды смешайте 1 мл аминокислотного раствора MEM, 750 микролитров 1 моляра HEPES, 5 мл FBS и 43,25 мл MEM в 50 мл трубки. Для приготовления HBSS, дополненный 15 миллимолярной HEPES, смешайте 49,25 мл HBSS и 750 микролитров 1 молар hePES.Для приготовления блюд с покрытием поли-л-лизина в течение одного дня при 25 градусах Цельсия высасыв 35 мм пластиковых клеток культуры блюд по 0,2 мг на мл гидробромида поли-л-лизина. Затем промойте посуду 2 мл ультрачистой воды три раза и инкубировать их 1,5 мл Stop Medium при 25 градусах по Цельсию до использования. Инкубировать расчлененный гиппокамп в смеси, содержащей 500 микролитров каждый из 2,5%трипсина и 10X Dnase-1 в HBSS дополняется 15 миллимолейных HEPES, рН 7,2, при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут с возбуждением каждые 3 минуты.Затем перенесите гиппокамп на 10 мл стоп-медиума и инкубировать при 4 градусах по Цельсию в течение 5 минут, чтобы инактивировать трипсин. Затем инкубировать расчлененный гиппокамп в 10 мл свежей остановки среды при 4 градусах по Цельсию в течение 5 минут. Перемести гиппокампи в 10 мл свежей стоп-среды и инкубировать при 4 градусах по Цельсию еще 5 минут.Затем перемести гиппокамп в 900 микролитров стоп-среды и 100 микролитров 10X Dnase-1 в 15 мл трубки. Используйте 1 мл пипетки, чтобы разобщить гиппокампа в изолированные нейроны путем пипетки 20 раз. Добавьте 9 мл покрытия среды и процедите через 70 микрон-клеточный ситечко в трубку 50 мл.Подсчитайте количество клеток, использующих гемоцитометр, и отрегулируйте до 3,5 раз от 10 до четвертой клетки на миллилитр в среде покрытия. Далее, аспирировать стоп-среды из поли-л-лизин покрытием блюд. Плита 2 мл на тарелку клеток на покрытые посудой и инкубировать под 5%carbon диоксида при 37 градусах по Цельсию в течение 60-64 часов.После инкубации добавьте 2 микролитера раствора бульона Ara-C в нейроны и встряхните блюдо медленно. Храните блюда культуры в увлажненной коробке без изменения среды культуры под 5%carbon dioxide при 37 градусах по Цельсию. Очистить дендритной филоподии богатой фракции после 13 дней в пробирке, сначала добавив три миллиона магнитных микробусов полистирола на блюдо до 20 блюд, содержащих культурные нейроны.После одного дня, мыть нейроны в 1 мл PBS с агиацией три раза, чтобы удалить средние и несвегие микробусы. После удаления PBS, подлизать нейроны с 500 микролитров на блюдо из буфера лиза. Затем соберите лизат с помощью клеточного скребка и перенесите лизат в 10 микротрубок с низким содержанием белка.Установите трубки на магнитный разделитель и подождите одну минуту. Соберите супернатант и использовать его в качестве несъегодной фракции для окрашивания серебра и западного анализа помарки. Затем перенесите шарики на новую микротрубку с низким содержанием белка и установите на магнитный отделитель на одну минуту.Полностью удалите супернатант и добавьте 500 микролитров буфера лиза. Вымойте бисер с помощью смесителя Vortex в течение 15 секунд. Повторите мытье бисера 10 раз и удалите супернатант.Elute белки вплоть до бисера путем добавления 50 микролитров 1X SDS образца буфера и варить трубку при 98 градусов по Цельсию в течение 5 минут. Центрифуга трубки при 860xG 3000 об/мин в течение 10 секунд и установить трубку на магнитный отделитель в течение одной минуты. Соберите супернатант и используйте его в качестве связанной фракции.Измерьте концентрации неслых и связанных белковых фракций с помощью анализа белка BCA. Визуализуйте протиен решения с бромофенил-синим цветом и отрегулируйте концентрацию до 5 нанограмм на микролитер для страницы SDS. Разделите связанные и неограниченные фракции на странице SDS с помощью геля 5-20%градиента.Серебряное пятно геля. Наконец, западная помарка использует соответствующие первичные и вторичные антитела согласно рукописи. В культурных гиппокампа нейронов, TLCN был обильно локализован в дендритных филоподии, вал, и сома и совместно локализованы с F-актина.Закодированные бусы были в основном связаны с дендритами и индуцировать образование фагоцитических чашек путем накопления TLCN и F-актина на нейрональных дендритов. Thorecense изображения показали, что фагоцитическое образование чашки в решающей степени зависит от присутствия TLCN в дендритов. Фагоцитные чашки были сформированы только на диких нейронов гиппокампа типа, но не на TLCN defficient гиппокампа нейронов.Результаты страницы SDS показали, что шаблоны белковой полосы были почти одинаковыми для неограниченных и связанных фракций, но интенсивности на уровне 50 и 70 килодальтон, в связанной фракции были ниже, чем в несыряемой фракции. Тем не менее, интенсивность полосы, очевидно, не отличается между неограниченными и связанными фракциями, подготовленными из гиппокампа TLCN defficient культуры нейронов. Западный анализ помарки несыхваченных и связанных фракций показал, что TLCN и VN были в основном обнаружены в связанной фракции.Actin, Ezrin, G alpha q, PLC beta 1, MAP-2 и Spectrin были обнаружены как в связанных, так и в неограниченных фракциях. Моэзин, PSD-95, альфа-актинин и альфа-тубулин были обнаружены в нессорной фракции. Если белок покрытия микробусов меняется, эта процедура может быть применена для определения взаимодействия анализа.Этот метод может определить белок, работающий на искусственных веществах. Таким образом, мы считаем, что механизм искусственного генезиса может быть количественно. Мы считаем, что новый белок, связанный с психическим расстройством, может быть идентифицирован из дендритной фильтродии богатой фракции.И может быть распространена на терапию.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Анализ морфологии Дендритные позвоночника в культуре нейронов ЦНС

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Вовлечение рост дендритов в культуре симпатических нейронов

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Анализ Пуркинье морфологии дендритных клеток в органотипической культур Slice

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Быстрый Micro-ионтофорезом глутамата и ГАМК: полезный инструмент по расследованию Synaptic интеграции

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Оценка ветвления дендритов в зубчатой ​​извилине гиппокампа области у мышей

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Очистка сосудов головного мозга мыши

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Анализ Дендритные Морфология в столбцах и слоях

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Оценка гиппокампальной дендритной сложности у пожилых мышей с использованием метода Гольджи-Кокса

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Ионтофорез в реальном времени с тетраметиламмонием для количественного определения объемной доли и торможности внеклеточного пространства мозга

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Количественный анализ сложности нейрональных дендритных арборизация у дрозофилы

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...