Name: post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation
Uploaded: 2019-08-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation at JoVE.com

هذا العمل هو عنصر من عناصر مجموعات أبحاث الخلايا المعاد برمجتها التعاونية الوطنية (NCRCRG) لدراسة الأمراض العقلية، وكان مدعوما ً بمنحة المعهد الوطني للصحة U19MH1 2015-0644. كما تم دعم العمل الأولي من قبل المعهد الوطني للصحة منحة NS070297. نشكر الدكتوركارول ماركيتو وفريد غيج، معهد سالك، على توفير خط WT 126 من خلايا السلف العصبية، والدكتورين يوجين يو ولورانس غولدشتاين، جامعة كاليفورنيا في سان دييغو لتوفير خط CVB WT24 من خلايا السلف العصبية. نشكر ديبورا بري في مختبر الدكتورة آن بانغ، معهد سانفورد بورنهام بريبيس للاكتشافات الطبية، على المناقشات المفيدة.

1. فترة التمايز قبل إعادة الطلاء
<ol><li>تمييز الخلايا العصبية على أطباق 10 سم، وذلك باستخدام بروتوكول من اختيار7،8 حتى شكلت الخلايا العصبية شبكة سميكة مع عملياتها والتعبير ليس فقط علامات الخلايا العصبية في وقت مبكر مثل MAP2 أو TuJ1، ولكن أيضا علامات في وقت متأخر مث...

<ol>
	<li>Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+pitfalls+of+stem+cell+differentiation:+a+guide+to+improving+protocols+for+neurodegenerative+disease+models+and+research.">Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).</li><li>Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD.">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).</li><li>Amin, N. D., Pa&#351;ca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+Models+of+Brain+Disorders+with+Three-Dimensional+Organoids.">Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids.</a> Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).</li><li>Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Passaging+Cells.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cancer Cell Culture. , (2010).</li><li>Picot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. 107, (2005).</li><li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+neuronal+cell+culture.">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).</li><li>Calabrese, B., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+the+PKC+target+MARCKS+in+maintaining+dendritic+spine+morphology.">Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology.</a> Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).</li><li>Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuN,+a+neuronal+specific+nuclear+protein+in+vertebrates.">NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates.</a> Development. 116 (1), 201-211 (1992).</li><li>Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+shrinkage+and+growth+involve+downregulation+of+cofilin+via+distinct+mechanisms.">Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms.</a> PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+Dorsal+Spinal+Sensory+Interneurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).</li><li>Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+induction+of+dorsal,+intermediate+and+ventral+spinal+cord+tissues+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Playne, R., Jones, K., Connor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dopamine+neuronal-like+cells+from+induced+neural+precursors+derived+from+adult+human+cells+by+non-viral+expression+of+lineage+factors.">Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors.</a> Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).</li><li>Rao, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustrating+the+potency+of+current+Good+Manufacturing+Practice-compliant+induced+pluripotent+stem+cell+lines+as+a+source+of+multiple+cell+lineages+using+standardized+protocols.">Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols.</a> Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).</li><li>Suga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+hypothalamic+and+pituitary+cells.">Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells.</a> Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).</li><li>Endaya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+dividing+neural+and+brain+tumour+cells+for+gene+expression+profiling.">Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).</li><li>Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+activated+cell+sorting+(FACS):+a+rapid+and+reliable+method+to+estimate+the+number+of+neurons+in+a+mixed+population.">Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population.</a> Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).</li><li>Frega, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Neuronal+Differentiation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Measuring+Network+Activity+on+Micro-electrode+Arrays.">Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).</li><li>Grainger, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+for+Seizure-Liability+Testing+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).</li><li>Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+of+primary+neurons:+ready+for+prime+time.">High-content screening of primary neurons: ready for prime time.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).</li></ol>

لقد أظهرنا إجراء ً مباشراً لإعادة تعليق وإعادة طلاء الثقافات العصبية البشرية التي تعمل على تحسين الجدوى، ونجاح التمايز، والتصوير دون الخلوي بطريقة متوافقة مع منصات فحص المحتوى العالي، وغيرها من الاختبارات ذات الصلة لاكتشاف المخدرات. ويبين الشكل 6 سير العمل العام والأمثل...

الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى (hiPSC) الخلايا العصبية المشتقة من أهمية متزايدة في مجالات البحوث الأساسية، وتطوير المخدرات، والطب التجديدي. سير العمل والإجراءات لتحسين ثقافتهم وصيانتها، وتحسين كفاءة التمايز في أنواع فرعية عصبية محددة، تتطور بسرعة1،2. لتحسين فائدة وفعالية التكلفة للخلايا العصبية المستمدة من الخلايا الجذعية البشرية كأنظمة نموذجية قابلة للتحليلات عالية المحتوى في اكتشاف المخدرات والتحقق من الهدف، فمن المفيد تقليل الوقت التركيب اللازم لتوليد ناضجة، وظيفية الخلايا العصبية، مع الحفاظ على أقصى قدر من المتانة، واستنساخ، وأهمية النمط الظاهري. على الرغم من أن الثقافات العضوية ثلاثية الأبعاد تقود اختراقات في أبحاث تطوير الأعصاب3،إلا أن الثقافات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد متوافقة بشكل خاص مع التطبيقات الآلية القائمة على التصوير بسبب الحد الأدنى من سمك الأنسجة.
ومع ذلك، فإن تكييف أساليب الفحص القائم على التصوير مع نماذج الأمراض العصبية والعصبية والتنموية البشرية يواجه تحدياً كبيراً. الإطار الزمني المطول الذي ينضج الجهاز العصبي البشري في الجسم الحي يتطلب وقتا طويلا في الثقافة لاستيعاب البرامج الطبيعية للتعبير الجيني وتحقيق النضج العصبي.
إحدى النتائج العملية لبرنامج التمايز العصبي الطويل هو أن الحفاظ على الثقافات أحادية الطبقة المشتقة من hiPSC يجب أن تستمر لعدة أسابيع لتحقيق النضج متشابك كافية. خلال هذا الوقت، لا تزال الذرية العصبية التي لا تزال غير متمايزة الانقسام. هذه يمكن أن تزيد بسرعة من الثقافة واغتصاب المحتوى الغذائي المطلوب للحفاظ على الخلايا العصبية ما بعد الولادة قابلة للحياة. تقسيم بقوة الخلايا السلف العصبية (NPCs) يمكن أيضا أن تتنافس مع الخلايا العصبية لالركيزة النمو. وهذا يمكن أن يجعل هذه الثقافات عرضة لمشاكل التصاق ضعيف، وهو شرط غير مناسب للفحص القائم على التصوير. وعلاوة على ذلك، يجد العديد من المحققين أنه كلما كان حجم الثقافة أصغر، كلما زادت صعوبة الحفاظ على السكان الأصحاء من الخلايا العصبية المتمايزة لفترة كافية لمراقبة المراحل المتأخرة من التمايز العصبي. وبعبارة أخرى، يمكن أن تكون الاختبارات من نضج متشابك باستخدام نهج فحص المحتوى العالي (HCS) تحديا كبيرا للخلايا العصبية المستمدة من الإنسان.
للتحايل على بعض هذه المشاكل، تم استخدام إجراء لإعادة تعليق وإعادة طلاء الخلايا العصبية المستمدة من hiPSC المتمايزة سابقا. أولا، فإنه يسمح بدراسة نمو نيورايت (أو، على نحو أكثر دقة، تجديد النيورايت) في مجموعة من الخلايا العصبية ملتزمة تماما. ثانيا، إعادة طلاء الخلايا العصبية المتمايزة سابقا من شكل حجم كبير (مثل لوحات 10 سم أو أكبر)، وصولا إلى تنسيقات حجم صغيرة (مثل لوحات متوافقة مع HCS 96- أو 384 جيدا microtiter) تمكن من انخفاض كبير في مجموع وقت الزراعة في حالة حجم صغير. وهذا يسهل دراسة تجميع المشبك والنضج على مدى الأسابيع اللاحقة في المختبر.
ومع ذلك، فإن إعادة طلاء الخلايا العصبية الناضجة التي أنشأت بالفعل النيوريتات الطويلة وشبكة اتصال معقدة يطرح العديد من التحديات، واحدة منها هو معدل عالية ومتغيرة في بعض الأحيان من موت الخلايا. هنا، ونحن نصف إجراء replating التي تؤدي إلى البقاء على قيد الحياة الخلية ممتازة واستنساخ. عادة، تتعرض الخلايا العصبية للإنزيمات البروتيوليتيك لفترات حضانة قصيرة (عادة ~ 3-10 دقيقة) من أجل فصل الخلايا عن الركيزة قبل الثلاثية. يتم استخدام هذا الوقت البروتيوليسي وجيزة عادة لإعادة تعليق وتمرير العديد من أنواع الخلايا القسمة، بما في ذلك الخلايا غير العصبية والprogenitors غير متمايزة4،5،6. ومع ذلك، بالنسبة للخلايا العصبية المتمايزة التي تحمل النيوريتيات طويلة ومترابطة، فمن الضروري ليس فقط لفصل الخلايا عن الركيزة ولكن أيضا لتعطيل الشبكة الجذعية والإبطية من أجل عزل الخلايا الفردية مع تقليل الضرر. في الواقع، شبكة سميكة من الخلايا العصبية عادة ما يميل إلى فصل من الركيزة كورقة واحدة، بدلا من الخلايا الفردية. إذا لم يتم اتخاذ العناية لتخفيف شبكة سميكة من النيورايتات، الخلايا العصبية لا تصبح فقط تضررت لا رجعة فيه أثناء trituration، ولكن العديد منهم تفشل في تمرير من خلال مرشح المستخدمة لإزالة كتل، مما أدى إلى ضعف العائد الخلوي. فيما يلي وصف تعديل بسيط لإجراء حضانة البروتياز المستخدمة على نطاق واسع لمواجهة هذه الصعوبات.
في البروتوكول الموضح أدناه، يتم احتضان الخلايا العصبية لمدة 40-45 دقيقة مع البروتياز خفيفة، مثل الإنزيم البروتيوليتيك (على سبيل المثال، Accutase). خلال أول 5-10 دقيقة بعد إضافة الإنزيم، والشبكة العصبية يرفع قبالة من الركيزة كورقة. الحضانة مع البروتياز يستمر لمدة 30-40 دقيقة إضافية قبل المضي قدما مع trituration لطيف وتصفية. يساعد هذا الوقت الإضافي للحضانة على ضمان أن هضم المادة يرتاح الشبكة بين الخلايا، مما يضمن أن التتثّة اللاحقة تنتج تعليق الخلايا الفردية. هذا الإجراء يزيد من توحيد توزيع الخلايا عند إعادة الطلاء مع تقليل موت الخلايا. لقد طبقنا بنجاح هذه الطريقة replating إلى الثقافات العصبية المستمدة hiPSC التي تم إنشاؤها بواسطة بروتوكولات التمايز المختلفة7و8 ومن خطوط مختلفة من hiPSCs. الإجراء هو مناسبة اسميا للاستخدام مع معظم أو كل خطوط الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية. وقد لاحظنا أن تمديد فترة حضانة البروتياز ليس ضروريا ً تماماً لإعادة طلاء الثقافات من لوحات صغيرة الشكل (على سبيل المثال، قطر 35 مم)؛ ومع ذلك، كما نعرض هنا، فإنه يوفر فائدة كبيرة عند replating من لوحات قطرها كبير (على سبيل المثال، 10 سم قطرها أو أكبر)، ربما لأن neurites في مثل هذه اللوحات يمكن أن تمتد عمليات طويلة جدا وتشكل مجموعة مترابطة بشكل كثيف.
هنا نقوم بتوضيح هذه الطريقة ونوضح بإيجاز تطبيقها في الاختبارات لتكوين النيوريتوجينيس المبكر ونضج المشبك، والذي ينطوي على تجميع البروتينات قبل وpostsynaptic على طول dendrites وaxons، تليها في وقت لاحق التعريب المشترك في مواقع متشابك. وتبرز الأمثلة المزايا التي يوفرها هذا البروتوكول في الحفاظ على صلاحية الخلايا وإمكانية استنساخها. أولا، فإنه يسمح للمحققين لدراسة الخطوات المبكرة في تكوين النييوريات البشرية. يشبه الإعداد التجريبي الثقافات الأولية الشائعة الاستخدام للخلايا العصبية القشرية أو فرس النهر، حيث يتم استخراج الخلايا من الدماغ الجنيني المتأخر أو في وقت مبكر بعد الولادة، وينفصل عن طريق التريتوريشن بعد العلاج البروتياز لطيف، ويسمح ل بدء النيوريت أو لتجديد النيوريت اتى في الإجراء9،10. على غرار هذه الخلايا العصبية الأولية القوارض، الخلايا العصبية المستمدة من hiPSC تبدأ في تشكيل أو تجديد النيورايتات في غضون ساعات بعد إعادة الطلاء، مما يسمح بتصوير المخاريط النمو ومورفولوجيا النيورايت في بيئة الأمثل للتصوير الفناءي عالية مع أقل المحيطة الخلايا غير المتمايزة. وقد لاحظنا أن نمو نيورايت هو أكثر تزامنا بالمقارنة مع التأخيرات المتغيرة ومعدلات النمو المختلفة التي ينظر إليها عندما تبدأ الخلايا العصبية لأول مرة في التمييز بين السكان السلف. وبالإضافة إلى ذلك، يتيح replating اختبار الخلايا العصبية التي تعبر عن علامات النوع الفرعي العصبي التي تظهر عادة في وقت لاحق في التطور العصبي، مثل طبقة القشرية 5/6 عامل النسخ CTIP2 (الدجاج ovalbumin النسخ المروج المنبع عامل التفاعل البروتين 2)، أو علامة عموم الخلايا العصبية NeuN11. ومن السمات المفيدة بشكل خاص لنهج إعادة الطلاء أن عملية تكوين المشبك تمضي ضمن إطار زمني متوافق مع HCS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1076px;" width="1076">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Post Replating Media</td>
			<td style="width:276px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:377px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dibutyryl-cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>Add 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human BDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">450-02</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td>Add 20 ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DMEM/F12 with Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>31331093</td>
			<td>Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human GDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 100 &#181;l to 50 mL N2B27</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11140035</td>
			<td>Add 5ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">N2 (100X) Supplement</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Add 5ml to 500mL media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal A Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>for WT126 cells; neural basal media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SM1 Supplement</td>
			<td style="width:276px;">StemCell Technologies</td>
			<td>5711</td>
			<td>Add 1:50 to media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>25080-094</td>
			<td>Add 10ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Plate Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10cm Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08772-E</td>
			<td>Plastic TC-treated dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">6-well Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Thomas Scientific</td>
			<td>1194Y80</td>
			<td>NEST plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Add 1:400 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-Ornithine</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 1:1000 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td>To dilute Poly-L-Ornithine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Replating Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">100mM Cell Strainer</td>
			<td style="width:276px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431752</td>
			<td>Sterile, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">384-well plate, uncoated</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6007550</td>
			<td>Coat with PLO and Laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DPBS</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190144</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6057500</td>
			<td>Rinse before coating with laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fixation Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F79-1</td>
			<td>Dissolved in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sucrose</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S5-12</td>
			<td>0.8 g per 10 ml of fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Immunostaining Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11041</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21449</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 561 Goat anti-rat</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11077</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DAPI</td>
			<td style="width:276px;">Biotium</td>
			<td>40043</td>
			<td>visualizes DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1)</td>
			<td style="width:276px;">Neuromics</td>
			<td>MO15013</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rat antibody against CTIP2</td>
			<td style="width:276px;">Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>layer 5/6 cortical neurons</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">LifeSpan Biosciences</td>
			<td>LS-B290</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against NeuN</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>ABN91</td>
			<td>late stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">Shelley Halpain</td>
			<td>N/A</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against PSD-95</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P-246</td>
			<td>post-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against Synapsin 1</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>AB1543</td>
			<td>pre-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:276px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30574.02</td>
			<td>10% in PBS for blocking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Titon X-100</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9002931</td>
			<td>Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Viability Markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Vivafix 649/660</td>
			<td style="width:276px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">135-1118</td>
			<td>cell death marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Calcium Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:276px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE</td>
			<td>THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>calcium reporter in a viral delivery system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">hiPSC-derived NPCs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">WT 126 (Y2610)</td>
			<td style="width:276px;">Gage lab</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Marchetto et al., 2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">CVB WT24</td>
			<td style="width:276px;">Yeo and Goldstein labs</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>unpublished</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation

تمثل الخلايا العصبية المتمايزة في الثقافة ثنائية الأبعاد من الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القوى خلايا السلف العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية (NPCs) نظام نموذج قوي لاستكشاف آليات المرض وإجراء فحص المحتوى العالي (HCS) لاستجواب المركب المكتبات أو تحديد الأنماط الظاهرية للطفرة الجينية. ومع ذلك، مع الخلايا البشرية الانتقال من المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني إلى وظيفية، الخلايا العصبية الناضجة يتطلب عدة أسابيع. عادة ما تبدأ نقاط الاشتباك العصبي في تشكيل بعد 3 أسابيع من التمايز في ثقافة الطبقة الأحادية، والعديد من البروتينات الخاصة بالخلايا العصبية، على سبيل المثال في وقت لاحق التعبير عن علامة عموم الخلايا العصبية NeuN، أو طبقة 5/6 الدماغ علامة الخلايا العصبية القشرية CTIP2، تبدأ في التعبير عن حوالي 4-5 أسابيع بعد التمايز. يمكن أن يكون هذا الوقت التمايز طويلة غير متوافقة مع ظروف الثقافة المثلى المستخدمة لأحجام صغيرة، منصات HCS متعددة الآبار. ومن بين التحديات العديدة الحاجة إلى خلايا مُتقيدة بشكل جيد وموزعة بشكل موحد مع الحد الأدنى من تجميع الخلايا، والإجراءات الثقافية التي تعزز القدرة على البقاء على المدى الطويل والنضج الوظيفي للمشبك. نهج واحد هو التمييز بين الخلايا العصبية في شكل حجم كبير، ثم لوحة لهم في وقت لاحق نقطة في سداسي كلورو البنزين متوافقة مع الآبار المتعددة. بعض التحديات الرئيسية عند استخدام هذا النهج replating تتعلق استنساخ وجدوى الخلية، وذلك بسبب تعطيل المجهدة للشبكة التقشرية وaxonal. هنا نقوم بتوضيح إجراء مفصل وموثوق به لإعادة تعليق الخلايا العصبية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان (hiPSC) بعد تمايزها لمدة 4-8 أسابيع في شكل كبير الحجم، ونقلها إلى ميكروتيدر 384-well لوحات ، وزراعة لهم لمدة 1-3 أسابيع أخرى مع بقاء الخلية ممتازة. هذا replating من الخلايا العصبية البشرية لا يسمح فقط دراسة التجميع متشابك والنضج في غضون أسبوعين من replating، ولكن أيضا تمكن دراسات تجديد النيورايت وخصائص مخروط النمو. نحن نقدم أمثلة على الاختبارات القابلة للتحجيم لنشأة النُشَع ومتشابك باستخدام منصة 384-well.

إعادة طلاء الخلايا العصبية المستمدة من hiPSCs التي تم تمييزها لعدة أسابيع يقدم العديد من المزايا. ومع ذلك، فصل وإعادة طلاء الخلايا العصبية المتمايزة التي لديها طويلة، مترابطة dendrites والمحاور (الشكل1A)يمكن أن يؤدي إلى جزء كبير من الخلايا العصبية التالفة لا رجعة فيه.
<...

Watch this Scientific Journal Video about Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation at JoVE.com

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

يصف هذا البروتوكول إجراء مفصل لإعادة تعليق وزراعة الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الخلايا العصبية التي كانت تختلف سابقا عن الذرية العصبية في المختبر لعدة أسابيع. يسهل هذا الإجراء الاختبارات المستندة إلى التصوير للنيوريت، ونقاط الاشتباك العصبي، وعلامات الخلايا العصبية التي يتم التعبير عنها في وقت متأخر في شكل متوافق مع الفحص المجهري الخفيف وفحص المحتوى العالي.

إعادة طلاء الخلايا العصبية البشرية المتعددة القوى المستمدة من الخلايا الجذعية من أجل فحص المحتوى العالي من تكوين النيونيتوجينيووووووين ونضج المشبك

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

يسهل هذا البروتوكول استخدام الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات البشرية لتطبيقات الفحص عالية المحتوى. وهي مناسبة بشكل خاص لمسايسة نقاط الاشتباك العصبي، والتي تتطلب في الخلايا العصبية البشرية فترات ثقافية طويلة. نحن نبرهن على إعادة طلاء الخلايا العصبية من أطباق التنسيق الكبيرة إلى آبار متعددة متوافقة مع HCS بطريقة تحافظ على قدرتها على البقاء.على نحو غير بديهي، نظهر أن توسيع حضانة البروتياز قبل إعادة الإنفاق وإعادة الطلاء يؤدي إلى تحسين البقاء على قيد الحياة العصبية. الخلايا العصبية البشرية متعددة القدرات المستمدة من الخلايا الجذعية هي ذات الصلة على نحو متزايد في مجالات البحوث الأساسية, تطوير المخدرات, والطب التنكسية. يمكن استخدام طريقة المعايرة اللطيفة هذه لإعادة تعليق أي طبقة أحادية كبيرة من الخلايا التي تحتوي على شبكة سميكة من العمليات.بالإضافة إلى iPSCs الإنسان، يمكن استخدامه لإعادة زراعة الخلايا العصبية الأولية أو لإعادة تعليق لهم لفرز الحقائق أو تسلسل خلية واحدة. من المهم اتباع الخطوات البروتوكولات بعناية وكثيرا ما ترصد مفرزة protease بوساطة من الخلايا العصبية من لوحة. قد تختلف فترة الحضانة المثلى، اعتمادا على الثقافة.مظاهرة بصرية تمكن حتى المحققين عديمي الخبرة لإعادة إنتاج هذا الإجراء. ابدأ بشطف طبق الخلايا العصبية المتمايزة مع برنامج تلفزيوني. تفريق برنامج تلفزيوني أسفل جدار لوحة وليس مباشرة على الخلايا لتجنب تعطيل لهم.التعرق في برنامج تلفزيوني من حافة الطبق في حين البقشيش، مع الحرص على عدم لمس الخلايا. تطبيق ما لا يقل عن ملليلتر من انزيم البروتيوليتيك لكل لوحة 10 سم. وإرجاع الخلايا إلى الحاضنة لمدة 40 إلى 45 دقيقة.أثناء الحضانة، والتحقق من الخلايا العصبية على مجهر التباين على مراحل ومواصلة علاج البروتياز حتى تنفصل الشبكة العصبية تماما من لوحة ويبدأ في كسر. عندما تكون الخلايا العصبية قد فصلت، ووقف الهضم عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام ديمي جديدة لكل ملليلتر واحد من protease. استخدام ماصة المصلية لتكهد الخلايا برفق ضد لوحة خمس إلى ثماني مرات، مع التأكد من عدم تطبيق الكثير من الضغط.سلالة الخلايا من خلال شبكة 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، قطرة قطرة. وشطف المصفاة مع خمسة ملليلتر إضافية من وسائل الإعلام DMEM الطازجة. استخدم جهاز طرد مركزي علوي لتدوير الخلايا بسرعة 1000 مرة G لمدة خمس دقائق.بعد الطرد المركزي، والعودة أنبوب مخروطي إلى مجلس الوزراء السلامة الحيوية وpirate معظم وسائل الإعلام، وترك 250 ميكرولترات للحفاظ على الخلايا رطبة. بلطف resuspend الخلايا في مليلتر اثنين من وسائل الإعلام DMEM الطازجة ثم تمريرها من خلال نهاية ماصة المصلية ملليلتر خمسة. أخيرا، عكس الأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات.استخدام مقياس للهيمواي والزرقاء ثلاثية لحساب الخلايا القابلة للحياة. ومن ثم DMEM إلى التركيز المطلوب. إضافة المكملات الغذائية المناسبة للأنبوب، اعتمادا على متطلبات خط الخلية محددة وخلط بلطف الخلايا عن طريق إمالة أنبوب مخروطي مرتين إلى ثلاث مرات.طلاء اللامينين السبيرات من لوحة 24-well وشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. الطامح برنامج تلفزيوني. وتطبيق حل الخلية على كل بئر في حركة الرقم ثمانية لتجنب تكتل.عند الانتهاء من طلاء الخلايا، والعودة لوحة إلى الحاضنة تعيين في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بإيجاز دوامة الأسهم حل من الخلية مبكّرة موت مراسلة وإضافته إلى الآبار وفقا ل المخطوطة توجيهات. انتظر 20 دقيقةثم صورة الخلايا الحية والميتة على الآبار الزجاجية متعددة القاع. إطالة حضانة protease يسمح تخفيف شبكة الخلايا العصبية داخل ورقة رفعت من الخلايا. وهذا يؤدي إلى انخفاض موت الخلايا في وقت الانفصام، فضلا عن النتائج في الانتعاش أكثر كفاءة خلال الأيام التالية.باستخدام إجراء حضانة الإنزيم الممتد ، تظهر الثقافات مضاعفة تقريبية لقابلية الخلية خلال الأيام التي تلت إعادة الطلاء وكثافة أقل للخلايا الميتة أو المحتضرة. المرحلة الانتقالية من التمايز العصبي تجري على مدى عدة أيام، خلالها الخلايا التعبير تدريجيا علامات الخلايا العصبية في مرحلة متأخرة. يتم الكشف عن هذه العلامات على الفور في الثقافات التي تم إعادة اِسْتِرْحها بعد أربعة أسابيع من التمايز المسبق.بروتوكول البروتياز الموسعة أيضا يعزز بشكل معتدل نوريميد الخروج. يتم تحسين كل من الطول الكلي النوريميد ونمو التشعب. إعادة الطلاء مفيد أيضا لدراسة نقاط الاشتباك العصبي.بعد أسبوع واحد فقط من إعادة الطلاء ، لوحظت علامات للبروتينات قبل وبعد متشابك. وعلاوة على ذلك، يمكن الكشف عن النشاط الكهربائي من إزالة القطب التلقائي والتيارات التي يحركها متشابك باستخدام تصوير الكالسيوم أو صفائف متعددة الأقطاب. يمكن تكييف هذا الإجراء إعادة طلاء إلى أنواع كثيرة من التطبيقات.بالإضافة إلى فحص المحتوى العالي لتحديد المركبات العلاجية المحتملة ، يمكن استخدامه لتصوير المخاريط النمو أو تسجيلات صفيف multielectrode. تفكك الميكانيكية من الخلايا العصبية التي شكلت بالفعل عمليات طويلة هو المجهدة. إن الحضانة الأنزيمية الممدودة والتكهّل اللطيف للخلايا هي خطوات أساسية لنجاح هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

كفاءة اشتقاق أسلاف الإنسان متعلق بالخلايا العصبية والخلايا العصبية من افرة القوة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

مواصفات من الخلايا العصبية الجلوتاميرجي الدماغ الانتهائي من خلايا الجذعية المحفزة

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

نمذجة عدوى فيروس زكى من وضع الدماغ البشري في المختبر باستخدام الخلايا الجذعية المشتقة من أورجانويدس الدماغي

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

التنمية المقايسة للقياس الكمي المحتوى عالية Sod1 البروتين متحولة تشكيل التجميعية في الخلايا الحية

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

أسلوب لإصابة الإنسان تمتد عالية السرعة التي يسببها Pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا العصبية في شكل جيد 96

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

تقسيم الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية داخل رقائق Microfluidic البلاستيكية التي تم تجميعها مسبقًا

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

تحويل الخلايا الجذعية مستحث البشرية المستحثة (iPSCs) في العمود الفقري الوظيفي الشوكي والجمجمة الحركية باستخدام متجات البكالوريا

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

الهجرة، والجذب الكيميائي، ومقالات الثقافة المشتركة للخلايا الأنبوسلية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية والخلايا العصبية GABAergic

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

تحليل نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في الخلايا العصبية الجذعية المستحثة البشرية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية في الشلل النصفي التشنجي الوراثي

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

توليد الخلايا العصبية البشرية والخلايا قليلة التغصن من الخلايا الجذعية متعددة القدرات لنمذجة تفاعلات الخلايا العصبية قليلة التغصن

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...