Name: post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation
Uploaded: 2019-08-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation at JoVE.com

Dette arbejde er en del af de nationale kooperative omprogrammerede celle forskningsgrupper (NCRCRG) for at studere psykisk sygdom og blev støttet af NIH Grant U19MH1 2015-0644. Det oprindelige arbejde blev også støttet af NIH Grant NS070297. Vi takker DRs. Carol Marchetto og fred Gage, Salk Institute, for at levere WT 126 linje af neurale stamceller, og DRS. Eugene Yeo og Lawrence Goldstein, UC San Diego for at levere CVB WT24 linje af neurale stamceller. Vi takker Deborah pre i laboratoriet af Dr. Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, for nyttige diskussioner.

1. differentierings periode før Replating
<ol><li>Differentiere neuroner på 10 cm retter, ved hjælp af en protokol af valg7,8 indtil neuroner har dannet et tykt netværk med deres processer og udtrykke ikke kun tidlige neuronal markører såsom MAP2 eller TuJ1, men også sene markører såsom Neun.</li>
	<li>
Skift halvdelen af valget hver 4 dage under neuronal differentierings processen. Bemærk: mere omfattende eller hyppige medium ænd...

<ol>
	<li>Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+pitfalls+of+stem+cell+differentiation:+a+guide+to+improving+protocols+for+neurodegenerative+disease+models+and+research.">Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).</li><li>Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD.">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).</li><li>Amin, N. D., Pa&#351;ca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+Models+of+Brain+Disorders+with+Three-Dimensional+Organoids.">Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids.</a> Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).</li><li>Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Passaging+Cells.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cancer Cell Culture. , (2010).</li><li>Picot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. 107, (2005).</li><li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+neuronal+cell+culture.">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).</li><li>Calabrese, B., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+the+PKC+target+MARCKS+in+maintaining+dendritic+spine+morphology.">Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology.</a> Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).</li><li>Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuN,+a+neuronal+specific+nuclear+protein+in+vertebrates.">NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates.</a> Development. 116 (1), 201-211 (1992).</li><li>Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+shrinkage+and+growth+involve+downregulation+of+cofilin+via+distinct+mechanisms.">Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms.</a> PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+Dorsal+Spinal+Sensory+Interneurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).</li><li>Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+induction+of+dorsal,+intermediate+and+ventral+spinal+cord+tissues+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Playne, R., Jones, K., Connor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dopamine+neuronal-like+cells+from+induced+neural+precursors+derived+from+adult+human+cells+by+non-viral+expression+of+lineage+factors.">Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors.</a> Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).</li><li>Rao, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustrating+the+potency+of+current+Good+Manufacturing+Practice-compliant+induced+pluripotent+stem+cell+lines+as+a+source+of+multiple+cell+lineages+using+standardized+protocols.">Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols.</a> Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).</li><li>Suga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+hypothalamic+and+pituitary+cells.">Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells.</a> Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).</li><li>Endaya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+dividing+neural+and+brain+tumour+cells+for+gene+expression+profiling.">Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).</li><li>Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+activated+cell+sorting+(FACS):+a+rapid+and+reliable+method+to+estimate+the+number+of+neurons+in+a+mixed+population.">Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population.</a> Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).</li><li>Frega, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Neuronal+Differentiation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Measuring+Network+Activity+on+Micro-electrode+Arrays.">Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).</li><li>Grainger, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+for+Seizure-Liability+Testing+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).</li><li>Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+of+primary+neurons:+ready+for+prime+time.">High-content screening of primary neurons: ready for prime time.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).</li></ol>

Vi har demonstreret en straight-Forward procedure for opblanding og plader af menneskelige neuronal kulturer, der optimerer levedygtighed, differentiering succes, og subcellulære Imaging på en måde, der er kompatibel med højt indhold screening platforme, og andre analyser, som er relevante for lægemiddel opdagelsen. Figur 6 illustrerer den overordnede arbejdsgang og eksempler på sådanne applikationer.
Selv om vi her fokuserede på hiPSC-afledte neuroner, de...

Humane pluripotente stamceller (hiPSC)-afledte neuroner er i stigende grad relevante inden for grundforskning, narkotika udvikling, og regenerativ medicin. Arbejdsprocesser og procedurer til at optimere deres kultur og vedligeholdelse, og forbedre effektiviteten af differentiering i specifikke neuronal undertyper, udvikler sig hurtigt1,2. For at forbedre nytten og omkostningseffektiviteten af menneskelige stamcelle-afledte neuroner som modelsystemer, der kan anvendes til højt indhold analyser i Drug Discovery og Target validering, er det nyttigt at mindske dyrknings tiden kræves for at generere modne, funktionelle neuroner, samtidig med at maksimal robusthed, reproducerbarhed og fænotype relevans bevares. Selv om 3-dimensionelle organoid kulturer kører gennembrud i Neuro udvikling forskning3, 2-dimensionelle enkeltlags kulturer er især kompatible med automatiserede Imaging-baserede applikationer på grund af deres minimal vævs tykkelse.
Men tilpasningen af billedbehandlings baserede screeningsmetoder til modeller af menneskelig neurologisk og neuroudviklingsmæssige sygdom står over for en stor udfordring. Den langvarige tidsramme, som det menneskelige nervesystem modnes in vivo nødvendiggør forlænget tid i kulturen til at rumme naturlige programmer for genekspression og opnå neuronal modning.
En praktisk konsekvens af den langvarige neuronal differentiering program er, at vedligeholdelsen af hipsc-afledte enkeltlags kulturer skal opretholdes i mange uger for at opnå tilstrækkelig synapse modenhed. I løbet af denne tid, neurale afkom, der forbliver udifferentieret fortsætte med at opdele. Disse kan hurtigt over vokse kulturen og tilrane sig det næringsstofindhold, der kræves for at opretholde levedygtige postmitotiske neuroner. Kraftigt dividere neurale progenitorceller (NPCs) kan også konkurrere med neuroner for vækst substrat. Dette kan gøre sådanne kulturer underlagt problemer med dårlig vedhæftning, en tilstand uegnet til billedbehandlings baserede assays. Desuden finder mange efterforskere, at jo mindre kultur volumen, jo større er vanskeligheden med at opretholde sunde populationer af differentierede neuroner længe nok til at observere de sene stadier af neuronal differentiering. Med andre ord, assays af synapse modning ved hjælp af højt indhold screening (HCS) tilgange kan være meget udfordrende for menneskelige-afledte neuroner.
For at omgå nogle af disse problemer er der blevet anvendt en procedure for tilbage suspension og plader af tidligere differentierede hipsc-afledte neuroner. For det første giver det mulighed for studiet af neurite udvækst (eller mere præcist neurite regenerering) i en population af fuldt engagerede neuroner. For det andet, at plader af tidligere differentierede neuroner fra et stort volumen format (som 10 cm plader eller større), ned til små volumen formater (som HCs-kompatible 96-eller 384-brønd mikrotiterplader) muliggør en signifikant reduktion i den samlede kultieringstid i den lille volumen tilstand. Dette letter studiet af synapse samling og modning over de efterfølgende uger in vitro.
Men, den plader af modne neuroner, der allerede har etableret lange neurites og en kompleks konnektivitet netværk præsenterer flere udfordringer, hvoraf den ene er den undertiden høj og variabel hastighed af celledød. Her beskriver vi en plader procedure, der resulterer i fremragende celle overlevelse og reproducerbarhed. Almindeligvis er neuroner eksponeret for Proteolytiske enzymer for korte inkubations perioder (typisk ~ 3-10 min) for at frigøre celler fra substratet før trituration. Denne korte proteolyse tid bruges sædvanligvis til at opsuspendere og passaging mange typer af skille celler, herunder ikke-neuronal celler og udifferentierede progenitorer4,5,6. Men for differentierede neuroner, der bærer lange, indbyrdes forbundne neuritter, er det vigtigt ikke blot at frigøre celler fra substratet, men også at forstyrre det dendritiske og axonal netværk for at isolere individuelle celler, samtidig med at skaden minimeres. Faktisk en tyk meshwork af neuroner normalt har tendens til at løsne sig fra substratet som et enkelt ark, snarere end som individuelle celler. Hvis der ikke udvises forsigtighed for at løsne det tykke netværk af neuritter, bliver neuroner ikke kun uopretteligt beskadiget under trituration, men mange af dem undlader at passere gennem filteret, der bruges til at fjerne klumper, hvilket resulterer i dårlig celle udbytte. Nedenfor beskriver vi en simpel modifikation til en bredt anvendt proteaseinkubations procedure for at imødegå disse vanskeligheder.
I den nedenfor beskrevne protokol inkuberet neuroner i 40-45 min med en mild protease, såsom det proteolytiske enzym (f. eks. Accutase). I løbet af de første 5-10 min efter tilsætning af enzymet, det neuronal netværk løfter fra substratet som et ark. Inkubation med proteasehæmmere provenuet for yderligere 30-40 min før du fortsætter med blid formalings og filtrering. Denne ekstra inkubationstid hjælper med at sikre, at fordøjelsen af materialet slapper af det intercellulære netværk, hvilket sikrer, at efterfølgende formalings giver en suspension af individuelle celler. Denne procedure maksimerer ensartetheden af celle fordelingen ved at plader, samtidig med at celledød minimeres. Vi har med succes anvendt denne plader metode til hipsc-afledte neuronal kulturer genereret af forskellige differentiering protokoller7,8 og fra forskellige linjer af hipscs. Proceduren er nominelt egnet til brug med de fleste eller alle linjer af stamcelle-afledte neuroner. Vi har observeret, at en forlænget proteaseinkubationstid ikke er absolut nødvendig for at udfylde kulturer fra små format plader (f. eks. 35 mm diameter); men som vi viser her, det giver en betydelig fordel, når plader fra store diameter plader (f. eks, 10 cm diameter eller større), sandsynligvis fordi neurites i sådanne plader kan forlænge meget lange processer og danne en tæt sammenkoblede array.
Her demonstrerer vi denne metode og illustrerer kort dens anvendelse i assays for tidlig neuritogenesis og for synapse modning, som involverer klyngedannelse af præ-og postsynaptiske proteiner langs dendritter og axoner, efterfulgt af deres senere samlokalisering på synaptisk sites. Eksemplerne fremhæver de fordele, som denne protokol giver for at bevare cellernes levedygtighed og reproducerbarhed. For det første, det tillader efterforskere at studere tidlige trin i human neuritogenesis. Den eksperimentelle indstilling svarer til de almindeligt anvendte primære kulturer af gnaver kortikale eller hippocampus neuroner, hvor cellerne udvindes fra sen føtal eller tidlig postnatale hjerne, dissocieret ved formalings efter blid proteasebehandling, og lov til at initiere neuritter eller regenerere neuritter, der blev afbrudt i proceduren9,10. På samme måde som sådanne gnaver primære neuroner begynder hiPSC-afledte neuroner at danne eller regenerere deres neuriter inden for timer efter replating, hvilket muliggør billeddannelse af vækst kegler og neurite morfologi i et miljø, der er optimalt til høj spatiotemporale billeddannelse med færre omgivende udifferentierede celler. Vi har observeret, at neurite udvækst er mere synkroniseret i forhold til de variable forsinkelser og forskellige udvækst satser set, når neuroner først begynder at skelne fra en stamcelle befolkning. Hertil kommer, at plader muliggør assays af neuroner udtrykker neuronal subtype markører, der typisk optræder senere i neurale udvikling, såsom den kortikale lag 5/6 transkriptionsfaktor CTIP2 (kylling ægalbumin upstream promotor transkription faktor-interagerende protein 2) eller den panneuronale markør NeuN11. En særlig nyttig funktion af den plader tilgang er, at synaptogenesis provenuet inden for en tidsramme kompatibel med HCs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1076px;" width="1076">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Post Replating Media</td>
			<td style="width:276px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:377px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dibutyryl-cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>Add 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human BDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">450-02</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td>Add 20 ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DMEM/F12 with Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>31331093</td>
			<td>Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human GDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 100 &#181;l to 50 mL N2B27</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11140035</td>
			<td>Add 5ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">N2 (100X) Supplement</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Add 5ml to 500mL media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal A Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>for WT126 cells; neural basal media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SM1 Supplement</td>
			<td style="width:276px;">StemCell Technologies</td>
			<td>5711</td>
			<td>Add 1:50 to media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>25080-094</td>
			<td>Add 10ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Plate Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10cm Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08772-E</td>
			<td>Plastic TC-treated dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">6-well Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Thomas Scientific</td>
			<td>1194Y80</td>
			<td>NEST plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Add 1:400 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-Ornithine</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 1:1000 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td>To dilute Poly-L-Ornithine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Replating Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">100mM Cell Strainer</td>
			<td style="width:276px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431752</td>
			<td>Sterile, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">384-well plate, uncoated</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6007550</td>
			<td>Coat with PLO and Laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DPBS</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190144</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6057500</td>
			<td>Rinse before coating with laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fixation Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F79-1</td>
			<td>Dissolved in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sucrose</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S5-12</td>
			<td>0.8 g per 10 ml of fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Immunostaining Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11041</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21449</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 561 Goat anti-rat</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11077</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DAPI</td>
			<td style="width:276px;">Biotium</td>
			<td>40043</td>
			<td>visualizes DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1)</td>
			<td style="width:276px;">Neuromics</td>
			<td>MO15013</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rat antibody against CTIP2</td>
			<td style="width:276px;">Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>layer 5/6 cortical neurons</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">LifeSpan Biosciences</td>
			<td>LS-B290</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against NeuN</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>ABN91</td>
			<td>late stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">Shelley Halpain</td>
			<td>N/A</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against PSD-95</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P-246</td>
			<td>post-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against Synapsin 1</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>AB1543</td>
			<td>pre-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:276px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30574.02</td>
			<td>10% in PBS for blocking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Titon X-100</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9002931</td>
			<td>Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Viability Markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Vivafix 649/660</td>
			<td style="width:276px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">135-1118</td>
			<td>cell death marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Calcium Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:276px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE</td>
			<td>THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>calcium reporter in a viral delivery system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">hiPSC-derived NPCs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">WT 126 (Y2610)</td>
			<td style="width:276px;">Gage lab</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Marchetto et al., 2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">CVB WT24</td>
			<td style="width:276px;">Yeo and Goldstein labs</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>unpublished</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation

Neuroner differentieret i to-dimensionelle kultur fra humane pluripotente stamcelle-afledte neurale stamceller (NPCs) repræsenterer en kraftfuld model system til at udforske sygdomsmekanismer og udføre høj indholds screening (HCS) at afhøre sammensatte biblioteker eller identificere genmutations fænotyper. Men, med humane celler overgangen fra NPC til funktionelle, modne neuron kræver flere uger. Synapser typisk begynder at danne efter 3 ugers differentiering i enkeltlags kultur, og flere neuron-specifikke proteiner, for eksempel den senere udtrykker pan-neuronal markør Neun, eller lag 5/6 cerebral kortikale neuron markør CTIP2, begynde at udtrykke omkring 4-5 uger efter differentiering. Denne lange differentierings periode kan være uforenelig med optimale dyrkningsbetingelser, der anvendes til små, multi-Well HCS-platforme. Blandt de mange udfordringer er behovet for godt overholdt, ensartet fordelte celler med minimal celle klyngedannelse, og kultur procedurer, der fremmer langsigtet levedygtighed og funktionel synapse modning. En tilgang er at differentiere neuroner i et stort volumen format, derefter replate dem på et senere tidspunkt i HCS-kompatible multi-brønde. Nogle af de vigtigste udfordringer ved anvendelse af denne plader-metode vedrører reproducerbarhed og cellelevedygtighed på grund af den stressende forstyrrelse af det dendritiske og axonale netværk. Her viser vi en detaljeret og pålidelig procedure for enzymatisk resuspension af menneskeskabte pluripotente stamceller (hipsc)-afledte neuroner efter deres differentiering for 4-8 uger i et stort volumen format, overføre dem til 384-brønd mikrotiterpladestrimler og dyrkning af dem i yderligere 1-3 uger med fremragende celle overlevelse. Denne plader af menneskelige neuroner giver ikke kun mulighed for studiet af synapse samling og modning inden for to uger fra plader, men også muliggør undersøgelser af neurite regenerering og vækst kegle egenskaber. Vi giver eksempler på skalerbare assays for neuritogenesis og synaptogenesis ved hjælp af en 384-Well platform.

Den plader af hipscs-afledte neuroner, der er blevet differentieret i flere uger tilbyder flere fordele. Imidlertid kan afmontering og plader af differentierede neuroner, der har lange, indbyrdes forbundne dendritter og axoner (figur 1A), resultere i en høj fraktion af irreversibelt beskadigede neuroner.
Som beskrevet i afsnittet protokol brugte vi inkubation med et proteolytisk enzym til at frigøre neuronerne fra substratet. Typisk, på grund a...

Watch this Scientific Journal Video about Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation at JoVE.com

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Denne protokol beskriver en detaljeret procedure for tilbage suspendering og dyrkning af humane stamcelle afledte neuroner, der tidligere var differentieret fra neurale progenitorer in vitro i flere uger. Proceduren letter Imaging-baserede assays af neurites, synapser, og sent-udtrykker neuronal markører i et format, der er kompatibelt med lys mikroskopi og høj-indhold screening.

Post-differentiering Replating af humane pluripotente stamcelle-afledte neuroner for højt indhold screening af Neuritogenesis og synapse modning

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Denne protokol letter brugen af humane pluripotente stamceller afledte neuroner til højt indhold screening applikationer. Det er især velegnet til at analysere synapser, som i menneskelige neuroner kræver lange kulturperioder. Vi demonstrerer replating af neuroner fra store format retter i HCS-kompatible multi brønde på en måde, der bevarer deres levedygtighed.Counter-intuitivt, vi viser, at udvide protease inkubation før resuspending og replating giver forbedret neuronal overlevelse. Humane pluripotente stamceller-afledte neuroner er i stigende grad relevante inden for grundforskning, udvikling af lægemidler, og degenerativ medicin. Denne blide titreringsmetode kan bruges til at opslænne ethvert stort monolag af celler, der har et tykt netværk af processer.Ud over menneskelige iPSCs, det kan bruges til at replate kultur af primære neuroner eller til at resuspendere dem for faktasortering eller enkelt celle sekventering. Det er vigtigt at følge protokollerne trin omhyggeligt og ofte overvåge protease medieret udstationering af neuroner fra pladen. Den optimale inkubationstid kan variere, afhængigt af kulturen.Visuel demonstration gør det muligt for selv uerfarne efterforskere at reproducere denne procedure. Start med forsigtigt at skylle pladen af differentierede neuroner med PBS. Disperger PBS ned ad pladens væg og ikke direkte på cellerne for at undgå at forstyrre dem.Indsugning PBS fra kanten af skålen, mens deponering det, passe på ikke at røre cellerne. Påfør mindst en milliliter proteolytisk enzym pr. 10-centimeter plade. Og returnere cellerne til kuvøsen i 40 til 45 minutter.Under inkubationen, kontrollere neuroner på en faset kontrast mikroskop og fortsætte protease behandling, indtil neurale netværk helt løsner sig fra pladen og begynder at bryde fra hinanden. Når neuronerne har løsrivet, stop fordøjelsen ved at tilføje fem milliliter friske DEMEM medier for hver en milliliter protease. Brug en serologisk pipette til forsigtigt at titrere cellerne mod pladen fem til otte gange, og sørg for ikke at anvende for meget tryk.Hæld cellerne gennem en 100 mikrometermaske i et konisk rør på 50 milliliter, dråbe for dråbe. Og skyl sien med yderligere fem milliliter friske DMEM medier. Brug en bænk-top centrifuge til at dreje cellerne ned på 1000 gange G i fem minutter.Efter centrifugering returneres det koniske rør til biosikkerhedsskabet og aspirerer de fleste medier, så 250 mikroliter holder cellerne fugtige. Forsigtigt resuspend cellerne i to milliliter friske DMEM medier derefter passere dem gennem enden af en fem milliliter serologisk pipette. Endelig vende røret to til tre gange.Brug et hæmocytometer og tripanblåt til at tælle de levedygtige celler. Og så DMEM til den ønskede koncentration. Tilføj passende kosttilskud til røret, afhængigt af kravene i den specifikke cellelinje og bland forsigtigt cellerne ved at vippe det koniske rør to til tre gange.Aspirate laminin belægning fra en 24-brønd plade og skyl det én gang med PBS. Aspirere PBS. Og anvende celle løsning til hver brønd i et tal otte bevægelse for at undgå sammenklumpning.Når du er færdig med at plating cellerne, returnere pladen til inkubatoren indstillet til 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Kort vortex bestanden løsning af den tidlige celle død reporter og tilføje det til brøndene i henhold til manuskriptet retninger. Vent 20 minutter.Og så billede de levende og døde celler på glasbund multi brønde. Forlængelse af protease inkubation giver mulighed for at løsne neuronal netværk inden for løftet ark af celler. Dette resulterer i nedsat celledød på tidspunktet for dissociation samt resulterer i mere effektiv genopretning i løbet af de følgende dage.Ved hjælp af den udvidede enzyminkubationsprocedure udviser kulturerne en omtrentlig fordobling af cellernes levedygtighed i dagene efter replating og en lavere tæthed af døde eller døende celler. Overgangsfasen af neuronal differentiering finder sted over flere dage, hvor cellerne gradvist udtrykker sene neuronale markører. Disse markører opdages straks i kulturer, der blev genindlæst efter fire ugers prædifferentiering.Den udvidede proteaseprotokol forstærker også moderat neurideudvækst. Både den samlede neuridelængde og dendritevæksten forbedres. Replating er også nyttig til at studere synapser.Bare en uge efter replating, markører for præ-og post-synaptiske proteiner blev observeret. Desuden kan elektrisk aktivitet fra spontan depolarisering og synaptisk-drevne strømme påvises ved hjælp af calcium billeddannelse eller multielektrode arrays. Denne replating procedure kan tilpasses til mange typer af applikationer.Ud over screening med højt indhold for at identificere potentielle terapeutiske forbindelser kan den bruges til billeddiagnostiske vækstkesler eller multielektrode arrayoptagelser. Mekanisk dissociation af neuroner, der allerede har dannet lange processer er stressende. Aflange enzymatisk inkubation og blid titrering af celler er afgørende skridt for en vellykket af denne procedure.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv derivering af humane Neuronal progenitorer og neuroner fra Pluripotente humane embryonale stamceller med småmolekyle Induktion

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Specifikationen af ​​Telencephalic glutamaterge neuroner fra humane pluripotente stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika Virus infektion i udviklingslandene menneskelige hjerne In Vitro ved hjælp af stamceller afledt Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay udvikling for høje indhold kvantificering af Sod1 Mutant Protein samlede dannelse i levende celler

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Metode for høj hastighed Stretch skade af menneskelig induceret pluripotente stamceller-afledt neuroner i en 96-brønds Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Opdeling af humane stamcelle-afledte neuroner inden for præ-monterede plastik Microfluidic chips

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Omdannelse af humane induceret pluripotente stamceller (iPSCs) til funktionel spinal og kraniel motor neuroner brug PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migration, Chemo-Attraction, og Co-Kultur Assays for Human Stem Cell-Afledt endotelceller og GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analyse mitokondriel transport og morfologi i Human Induceret pluripotente stamceller-afledte neuroner i arvelige spastiske paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Generering af humane neuroner og oligodendrocytter fra pluripotente stamceller til modellering af neuron-oligodendrocytinteraktioner

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...