Name: post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation
Uploaded: 2019-08-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation at JoVE.com

Dit werk is een onderdeel van de nationale coöperatieve geherprogrammeerde Celonderzoeksgroepen (NCRCRG) om psychische aandoeningen te bestuderen en werd ondersteund door NIH Grant U19MH1 2015-0644. Het initiële werk werd ook ondersteund door NIH Grant NS070297. We bedanken drs. Carol Marchetto en Fred Gage, het Salk Institute, voor het leveren van de WT 126 lijn van neurale voorlopercellen, en Drs. Eugene Yeo en Lawrence Goldstein, UC San Diego voor het verstrekken van de CVB WT24 lijn van neurale voorlopercellen. We bedanken Deborah pre in het laboratorium van Dr. Anne bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, voor nuttige discussies.

1. differentiatie periode voorafgaand aan de Herbeplating
<ol><li>Differentiëren neuronen op 10 cm gerechten, met behulp van een protocol van keuze7,8 totdat neuronen een dik netwerk met hun processen hebben gevormd en uiten niet alleen vroege neuronale markers zoals map2 of TuJ1, maar ook late markers zoals neun.</li>
	<li>
Verander de helft van het medium naar keuze elke 4 dagen tijdens het neuronale differentiatieproces. Opmerking: meer ...

<ol>
	<li>Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+pitfalls+of+stem+cell+differentiation:+a+guide+to+improving+protocols+for+neurodegenerative+disease+models+and+research.">Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).</li><li>Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD.">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).</li><li>Amin, N. D., Pa&#351;ca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+Models+of+Brain+Disorders+with+Three-Dimensional+Organoids.">Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids.</a> Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).</li><li>Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Passaging+Cells.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cancer Cell Culture. , (2010).</li><li>Picot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. 107, (2005).</li><li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+neuronal+cell+culture.">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).</li><li>Calabrese, B., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+the+PKC+target+MARCKS+in+maintaining+dendritic+spine+morphology.">Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology.</a> Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).</li><li>Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuN,+a+neuronal+specific+nuclear+protein+in+vertebrates.">NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates.</a> Development. 116 (1), 201-211 (1992).</li><li>Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+shrinkage+and+growth+involve+downregulation+of+cofilin+via+distinct+mechanisms.">Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms.</a> PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+Dorsal+Spinal+Sensory+Interneurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).</li><li>Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+induction+of+dorsal,+intermediate+and+ventral+spinal+cord+tissues+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Playne, R., Jones, K., Connor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dopamine+neuronal-like+cells+from+induced+neural+precursors+derived+from+adult+human+cells+by+non-viral+expression+of+lineage+factors.">Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors.</a> Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).</li><li>Rao, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustrating+the+potency+of+current+Good+Manufacturing+Practice-compliant+induced+pluripotent+stem+cell+lines+as+a+source+of+multiple+cell+lineages+using+standardized+protocols.">Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols.</a> Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).</li><li>Suga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+hypothalamic+and+pituitary+cells.">Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells.</a> Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).</li><li>Endaya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+dividing+neural+and+brain+tumour+cells+for+gene+expression+profiling.">Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).</li><li>Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+activated+cell+sorting+(FACS):+a+rapid+and+reliable+method+to+estimate+the+number+of+neurons+in+a+mixed+population.">Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population.</a> Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).</li><li>Frega, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Neuronal+Differentiation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Measuring+Network+Activity+on+Micro-electrode+Arrays.">Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).</li><li>Grainger, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+for+Seizure-Liability+Testing+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).</li><li>Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+of+primary+neurons:+ready+for+prime+time.">High-content screening of primary neurons: ready for prime time.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).</li></ol>

Wij hebben blijk gegeven van een rechtlijnig proces voor de resuspensie en herbeplating van menselijke neuronale culturen die de levensvatbaarheid, het succes van differentiatie en de subcellulaire beeldvorming optimaliseren op een manier die verenigbaar is met platforms voor het screenen van hoge inhoud, en andere assays die relevant zijn voor de opsporing van geneesmiddelen. Figuur 6 illustreert de algemene workflow en voorbeelden van dergelijke toepassingen.
Ho...

Menselijke pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleide neuronen worden steeds relevanter op het gebied van fundamenteel onderzoek, Geneesmiddelenontwikkeling en regeneratieve geneeskunde. Workflows en procedures om hun cultuur en onderhoud te optimaliseren en de efficiëntie van differentiatie in specifieke neuronale subtypen te verbeteren, evolueren snel1,2. Om het nut en de kosteneffectiviteit van menselijke stamcel afkomstige neuronen te verbeteren als modelsystemen die vatbaar zijn voor analyses met een hoog gehalte in geneesmiddelen ontdekking en doel validatie, is het nuttig om de kweektijd te verlagen die nodig is voor het genereren van volwassen, functionele neuronen, met behoud van maximale robuustheid, reproduceerbaarheid en fenotype relevantie. Hoewel 3-dimensionale organoïde-culturen doorbraken in neuroontwikkelingsonderzoek rijden, zijn 2-dimensionale monolaag-culturen met name compatibel met geautomatiseerde beeldvormings toepassingen vanwege hun minimale weefsel dikte.
Echter, de aanpassing van Imaging-gebaseerde screeningmethoden aan modellen van menselijke neurologische en neuroontwikkelingsziekte wordt geconfronteerd met een grote uitdaging. Het langdurige tijdsbestek waarover het menselijk zenuwstelsel in vivo rijpt, vereist uitgebreide tijd in cultuur om tegemoet te komen aan natuurlijke Programma's van genexpressie en neuronale rijping te bereiken.
Een praktisch gevolg van het lange neuronale differentiatie programma is dat het onderhoud van de met hipsc afgeleide monolaag culturen gedurende vele weken moet worden gehandhaafd om een adequate Synapse maturiteit te bereiken. Gedurende deze tijd, neurale voor ouders die ongedifferentieerde blijven blijven verdelen. Deze kunnen de cultuur snel overgroeien en de nutriënten-inhoud die nodig is om levensvatbare postmitotische neuronen te behouden. Krachtig verdelen neurale voorlopercellen (Npc's) kan ook concurreren met neuronen voor de groei substraat. Hierdoor kunnen dergelijke culturen worden onderworpen aan problemen met een slechte hechting, een aandoening die ongeschikt is voor op beeldvorming gebaseerde assays. Bovendien vinden veel onderzoekers dat hoe kleiner het cultuur volume, hoe groter de moeilijkheid bij het handhaven van gezonde populaties van gedifferentieerde neuronen lang genoeg om de late stadia van neuronale differentiatie te observeren. Met andere woorden, assays van Synapse rijping met behulp van High content screening (HCS) benaderingen kunnen zeer uitdagend voor menselijke-afgeleide neuronen.
Om sommige van deze problemen te omzeilen, is een procedure voor het opnieuw opschorten en replating van eerder gedifferentieerde hiPSC-afgeleide neuronen gebruikt. Ten eerste, het maakt de studie van neuriet uitgroei (of, nauwkeuriger, neuriet regeneratie) in een populatie van volledig betrokken neuronen. Ten tweede, de herbeplating van eerder gedifferentieerde neuronen uit een groot volume formaat (zoals 10 cm platen of groter), tot kleine volume formaten (zoals HCS-compatibele 96-of 384-well microtiterplaten) maakt een significante reductie in de totale kweektijd in de kleine volume conditie. Dit vergemakkelijkt de studie van Synapse assemblage en rijping in de daaropvolgende weken in vitro.
Echter, de replating van volwassen neuronen die al hebben vastgesteld lange neurites en een complex connectiviteits netwerk presenteert verschillende uitdagingen, waarvan één is de soms hoge en variabele snelheid van celdood. Hier beschrijven we een replating procedure die resulteert in uitstekende celoverleving en reproduceerbaarheid. Gewoonlijk worden neuronen blootgesteld aan Proteolytische enzymen voor korte incubatie perioden (meestal ~ 3-10 min) om cellen los te maken van het substraat voorafgaand aan de trituratie. Deze korte proteolyse tijd wordt gewoonlijk gebruikt voor het resuspenderen en doorvoeren van vele soorten scheidings cellen, waaronder niet-neuronale cellen en ongedifferentieerde voor ouders4,5,6. Echter, voor gedifferentieerde neuronen met lange, onderling verbonden neurites, is het essentieel niet alleen om cellen los te koppelen van het substraat, maar ook om het dendritische en axonale netwerk te verstoren om individuele cellen te isoleren terwijl de schade wordt geminimaliseerd. Inderdaad, een dik gevlochten van neuronen meestal de neiging om los te koppelen van het substraat als een enkel blad, in plaats van als individuele cellen. Als er geen zorg wordt genomen om het dikke netwerk van neurites los te maken, worden neuronen niet alleen onomkeerbaar beschadigd tijdens de trituratie, maar velen van hen verzuimen het filter te passeren dat wordt gebruikt om klonten te verwijderen, wat resulteert in een slechte celopbrengst. Hieronder beschrijven we een eenvoudige wijziging van een veelgebruikte incubatie procedure voor protease om deze moeilijkheden tegen te gaan.
In het hieronder beschreven protocol worden neuronen gedurende 40-45 minuten geïnnobeerd met een milde protease, zoals het Proteolytische enzym (bijv. Accutase). Tijdens de eerste 5-10 min na het toevoegen van het enzym, het neuronale netwerk Tilt van de ondergrond als een blad. De incubatie met de protease gaat nog 30-40 minuten mee voordat de zachte trituratie en filtering wordt voortgezet. Deze extra incubatietijd zorgt ervoor dat de vertering van het materiaal het intercellulaire netwerk ontspant, zodat de daaropvolgende trituratie een suspensie van individuele cellen oplevert. Deze procedure maximaliseert de uniformiteit van de celverdeling bij het replating, terwijl de celdood wordt geminimaliseerd. We hebben deze replating methode met succes toegepast op door hipsc afgeleide neuronale culturen, gegenereerd door verschillende differentiatie protocollen7,8 en verschillende lijnen van hipscs. De procedure is nominaal geschikt voor gebruik met de meeste of alle lijnen van stamcel afgeleide neuronen. We hebben geconstateerd dat een verlengde incubatietijd van de protease niet absoluut noodzakelijk is voor het replating van culturen uit kleine formaat platen (bijv. 35 mm diameter); echter, zoals we hier laten zien, biedt het een significant voordeel bij het replating van platen met grote diameter (bijv. 10 cm diameter of groter), waarschijnlijk omdat neurites in dergelijke platen zeer lange processen kunnen verlengen en een dicht met elkaar verbonden array vormen.
Hier demonstreren we deze methode en illustreren kort de toepassing ervan in assays voor vroege neuritogenesis en voor Synapse rijping, waarbij clustering van pre-en postsynaptisch eiwitten langs de dendrieten en axonen, gevolgd door hun latere colokalisatie op synaptische sites. De voorbeelden wijzen op de voordelen die dit protocol biedt bij het behoud van de levensvatbaarheid en reproduceerbaarheid van cellen. Ten eerste staat het onderzoekers toe om vroege stappen in menselijke neuritogenese te bestuderen. De experimentele instelling is vergelijkbaar met de veelgebruikte primaire culturen van knaagdieren corticale of hippocampal neuronen, waar cellen worden geëxtraheerd uit de late foetale of vroege postnatale hersenen, gezien door trituratie na milde protease behandeling, en toegestaan om te initieert neurites of regenereren neurites die in de procedure9,10werden verbroken. Vergelijkbaar met dergelijke knaagdieren primaire neuronen, hiPSC-afgeleide neuronen beginnen te vormen of hun neurites regenereren binnen enkele uren na het replating, waardoor Imaging van groei kegels en neuriet morfologie in een omgeving die optimaal is voor hoge spatiotemporele beeldvorming met minder Omringende ongedifferentieerde cellen. We hebben geconstateerd dat neuriet uitgroei is meer gesynchroniseerd in vergelijking met de variabele vertragingen en verschillende uitgroei percentages gezien wanneer neuronen beginnen te onderscheiden van een voorlopercellen populatie. Bovendien, replating maakt assays van neuronen die neuronale subtype markeringen die meestal verschijnen later in neurale ontwikkeling, zoals de corticale laag 5/6 transcriptiefactor CTIP2 (kip ovalbumine upstream Promoter transcriptie factor-interactie eiwit 2), of de pan-neuronale marker NeuN11. Een bijzonder nuttig kenmerk van de replating aanpak is dat synaptogenese verloopt binnen een tijdsbestek compatibel met HCS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1076px;" width="1076">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Post Replating Media</td>
			<td style="width:276px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:377px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dibutyryl-cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>Add 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human BDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">450-02</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td>Add 20 ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DMEM/F12 with Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>31331093</td>
			<td>Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human GDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 100 &#181;l to 50 mL N2B27</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11140035</td>
			<td>Add 5ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">N2 (100X) Supplement</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Add 5ml to 500mL media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal A Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>for WT126 cells; neural basal media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SM1 Supplement</td>
			<td style="width:276px;">StemCell Technologies</td>
			<td>5711</td>
			<td>Add 1:50 to media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>25080-094</td>
			<td>Add 10ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Plate Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10cm Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08772-E</td>
			<td>Plastic TC-treated dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">6-well Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Thomas Scientific</td>
			<td>1194Y80</td>
			<td>NEST plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Add 1:400 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-Ornithine</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 1:1000 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td>To dilute Poly-L-Ornithine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Replating Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">100mM Cell Strainer</td>
			<td style="width:276px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431752</td>
			<td>Sterile, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">384-well plate, uncoated</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6007550</td>
			<td>Coat with PLO and Laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DPBS</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190144</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6057500</td>
			<td>Rinse before coating with laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fixation Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F79-1</td>
			<td>Dissolved in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sucrose</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S5-12</td>
			<td>0.8 g per 10 ml of fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Immunostaining Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11041</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21449</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 561 Goat anti-rat</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11077</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DAPI</td>
			<td style="width:276px;">Biotium</td>
			<td>40043</td>
			<td>visualizes DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1)</td>
			<td style="width:276px;">Neuromics</td>
			<td>MO15013</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rat antibody against CTIP2</td>
			<td style="width:276px;">Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>layer 5/6 cortical neurons</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">LifeSpan Biosciences</td>
			<td>LS-B290</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against NeuN</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>ABN91</td>
			<td>late stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">Shelley Halpain</td>
			<td>N/A</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against PSD-95</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P-246</td>
			<td>post-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against Synapsin 1</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>AB1543</td>
			<td>pre-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:276px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30574.02</td>
			<td>10% in PBS for blocking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Titon X-100</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9002931</td>
			<td>Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Viability Markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Vivafix 649/660</td>
			<td style="width:276px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">135-1118</td>
			<td>cell death marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Calcium Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:276px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE</td>
			<td>THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>calcium reporter in a viral delivery system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">hiPSC-derived NPCs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">WT 126 (Y2610)</td>
			<td style="width:276px;">Gage lab</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Marchetto et al., 2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">CVB WT24</td>
			<td style="width:276px;">Yeo and Goldstein labs</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>unpublished</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation

Neuronen onderscheiden in tweedimensionale cultuur van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide neurale voorlopercellen (Npc's) vormen een krachtig modelsysteem om ziekte mechanismen te onderzoeken en High content screening (HC'S) uit te voeren voor interrogaat verbinding bibliotheken of Identificeer genmutatie fenotypes. Echter, met menselijke cellen de overgang van NPC naar functioneel, volwassen neuron vereist enkele weken. Synapsen beginnen meestal te vormen na 3 weken van differentiatie in monolaag cultuur, en verschillende neuron-specifieke eiwitten, bijvoorbeeld de later uitdrukken pan-neuronale marker neun, of de laag 5/6 cerebrale corticale neuron marker CTIP2, beginnen te uiten ongeveer 4-5 weken na differentiatie. Deze lange differentiatie tijd kan onverenigbaar zijn met optimale cultuuromstandigheden die worden gebruikt voor kleine volumes, multi-well HCS-platformen. Onder de vele uitdagingen zijn de behoefte aan goed-nageleefd, uniform verdeelde cellen met minimale celclustering, en cultuur procedures die lange termijn levensvatbaarheid en functionele Synapse rijping bevorderen. Een benadering is het differentiëren van neuronen in een groot volume formaat, en ze vervolgens opnieuw op een later tijdstip in HCS-compatibele multi-Wells. Enkele belangrijke uitdagingen bij het gebruik van deze replating aanpak betreffen reproduceerbaarheid en de levensvatbaarheid van de cel, als gevolg van de stressvolle verstoring van het dendritische en axonale netwerk. Hier demonstreren we een gedetailleerde en betrouwbare procedure voor enzymatisch resuspenderende menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleide neuronen na hun differentiatie voor 4-8 weken in een groot volume formaat, overbrengen naar 384-well micro titer platen, en kweek ze voor nog eens 1-3 weken met uitstekende overleving van de cel. Deze replating van menselijke neuronen kan niet alleen de studie van Synapse assemblage en rijping binnen twee weken na het replating, maar maakt ook studies van neuriet regeneratie en groei kegel kenmerken. We bieden voorbeelden van schaalbare assays voor neuritogenesis en synaptogenese met behulp van een 384-well platform.

De replating van de hiPSCs-afgeleide neuronen die zijn gedifferentieerd voor meerdere weken biedt verschillende voordelen. Echter, loskoppelen en replating gedifferentieerde neuronen die lange, onderling verbonden dendrites en axonen hebben (Figuur 1A) kan resulteren in een hoge Fractie van onomkeerbaar beschadigde neuronen.
Zoals beschreven in het protocol gedeelte gebruikten we incubatie met een proteolytisch enzym om de neuronen los te maken va...

Watch this Scientific Journal Video about Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation at JoVE.com

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde procedure voor het resuspenderen en kweken van menselijke stamcel afgeleide neuronen die eerder werden onderscheiden van neurale voorlopercellen in vitro voor meerdere weken. De procedure vergemakkelijkt op beeld gebaseerde assays van neurites, synapsen, en laat-uitdrukken neuronale markers in een formaat dat compatibel is met lichte microscopie en High-content screening.

Na differentiatie Herbeplating van menselijke pluripotente stamcel afkomstige neuronen voor het screenen van hoge inhoud van Neuritogenese en Synapse rijping

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Dit protocol vergemakkelijkt het gebruik van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide neuronen voor hoge inhoud screening toepassingen. Het is bijzonder geschikt voor het testen van synapsen, die in menselijke neuronen vereisen lange cultuurperiodes. We tonen de replating van neuronen van groot formaat gerechten in HCS-compatibele multi putten op een manier die hun levensvatbaarheid behoudt.Contra-intuïtief, tonen we aan dat de uitbreiding van protease incubatie voorafgaand aan resuspending en replating opbrengsten verbeterde neuronale overleving. Menselijke pluripotente stamcel-afgeleide neuronen zijn steeds relevanter op het gebied van fundamenteel onderzoek, ontwikkeling van geneesmiddelen, en degeneratieve geneeskunde. Deze zachte titratiemethode kan worden gebruikt om elke grote monolaag van cellen met een dik netwerk van processen opnieuw op te zetten.Naast menselijke iPSCs, kan het worden gebruikt om de cultuur van primaire neuronen te replate of om ze opnieuw op te stellen voor fact sortering of single cell sequencing. Het is belangrijk om de protocollen stappen zorgvuldig te volgen en vaak toezicht op de protease bemiddelde onthechting van de neuronen van de plaat. De optimale incubatietijd kan variëren, afhankelijk van de cultuur.Visuele demonstratie stelt zelfs onervaren onderzoekers in staat om deze procedure te reproduceren. Begin met het voorzichtig spoelen van de plaat van gedifferentieerde neuronen met PBS. Verspreid de PBS langs de wand van de plaat en niet direct op de cellen om te voorkomen dat ze verstoren.Aspirate de PBS vanaf de rand van de schotel tijdens het kantelen, zorg ervoor dat de cellen niet aan te raken. Breng ten minste een milliliter proteolytisch enzym per 10-centimeter plaat. En breng de cellen 40 tot 45 minuten terug naar de couveuse.Controleer tijdens de incubatie neuronen op een gefaseerde contrastmicroscoop en zet de proteasebehandeling voort totdat het neurale netwerk zich volledig losmaakt van de plaat en begint uit elkaar te vallen. Wanneer de neuronen zijn losgemaakt, stoppen met de spijsvertering door het toevoegen van vijf milliliter verse DEMEM media voor elke milliliter protease. Gebruik een serologische pipet om de cellen vijf tot acht keer tegen de plaat te titreren, om ervoor te zorgen dat er niet te veel druk wordt uitgeoefend.Zeef de cellen door een 100 micrometer gaas in een 50 milliliter conische buis, druppel voor druppel. En spoel de zeef met nog eens vijf milliliter verse DMEM media. Gebruik een bench-top centrifuge om de cellen vijf minuten op 1000 keer G te draaien.Na centrifugatie, breng de conische buis terug naar de bioveiligheidskast en aspirate het grootste deel van de media, waardoor 250 microliters om de cellen vochtig te houden. Voorzichtig resuspend de cellen in twee milliliter verse DMEM media dan passeren ze door het einde van een vijf milliliter serologische pipet. Ten slotte, omkeren van de buis twee tot drie keer.Gebruik een hemocytometer en tripan blauw om de levensvatbare cellen te tellen. En dan DMEM naar de gewenste concentratie. Voeg de juiste supplementen aan de buis, afhankelijk van de eisen van de specifieke cellijn en meng voorzichtig de cellen door het kantelen van de conische buis twee tot drie keer.Aspirate laminine coating van een 24-well plaat en spoel het een keer met PBS. De PBS aanzuigen. En toepassing van cel oplossing voor elke put in een figuur acht beweging om te voorkomen dat klonteren.Wanneer u klaar bent met het platbeteren van de cellen, breng de plaat terug naar de incubator set op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide. Kortvortex de voorraadoplossing van de vroege verslaggever van de celdood en voeg het aan de putten volgens de manuscriptrichting toe. Wacht 20 minuten.En dan beeld de levende en dode cellen op glazen bodem multi putten. Het verlengen van de protease incubatie maakt het mogelijk los te maken van het neuronale netwerk binnen het opgeheven blad van cellen. Dit resulteert in verminderde celdood op het moment van dissociatie en resulteert in een efficiënter herstel in de volgende dagen.Met behulp van de uitgebreide enzym incubatieprocedure vertonen de culturen een geschatte verdubbeling van de cel levensvatbaarheid tijdens de dagen na het replating en een lagere dichtheid van dode of stervende cellen. De overgangsfase van neuronale differentiatie vindt plaats over meerdere dagen, waarbij de cellen geleidelijk late neuronale markers uitdrukken. Deze markers worden onmiddellijk gedetecteerd in culturen die na vier weken van pre-differentiatie werden gereplateerd.De uitgebreide protease protocol ook matig verbetert neuride uitgroei. Zowel de totale neuridelengte als de denddrite groei worden verbeterd. Replating is ook handig voor het bestuderen van synapsen.Slechts een week na het replating werden markers voor pre- en post-synaptische eiwitten waargenomen. Bovendien is elektrische activiteit van spontane depolarisatie en synaptisch aangedreven stromen detecteerbaar met behulp van calciumbeeldvorming of multi-elektrodenarrays. Deze replating procedure kan worden aangepast aan vele soorten toepassingen.Naast screening met een hoog gehalte om potentiële therapeutische verbindingen te identificeren, kan het worden gebruikt voor het beeldvorming van groeikegels of multi-elektrodenarray-opnames. Mechanische dissociatie van neuronen die al lange processen hebben gevormd is stressvol. Langwerpige enzymatische incubatie en zachte titratie van cellen zijn essentiële stappen voor het succes van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

De Specificatie van Telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Zika Virus infectie van de ontwikkelende hersenen In Vitro met behulp van stamcel modellering afgeleid cerebrale Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay ontwikkeling voor hoge inhoud kwantificering van Sod1 Mutant eiwit statistische vorming in levende cellen

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Methode voor hoge snelheid Stretch letsel van mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige neuronen in een 96-Wells-indeling

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Compartimenlise ring van menselijke stamcel-afgeleide neuronen in voorgemonteerde kunststof Microfluïdische chips

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in functionele spinale en craniale motor neuronen met behulp van PiggyBac vectoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migratie, Chemo-Attraction, en Co-Culture Assays voor menselijke stamcel-afgeleide endotheelcellen en GABAergic Neuronen

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analyseren van mitochondrial transport en morfologie in de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in erfelijke Spastische dwarslaesie

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Generatie van menselijke neuronen en oligodendrocyten uit pluripotente stamcellen voor het modelleren van neuron-oligodendrocyteninteracties

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...