Name: post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation
Uploaded: 2019-08-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation at JoVE.com

Ce travail est une composante des National Cooperative Reprogrammed Cell Research Groups (NCRCRG) pour étudier la maladie mentale et a été soutenu par la subvention des NIH U19MH1 2015-0644. Les travaux initiaux ont également été soutenus par la subvention des NIH NS070297. Nous remercions les Drs Carol Marchetto et Fred Gage, de l'Institut Salk, d'avoir fourni la ligne WT 126 de cellules progénitrices neurales, et les Drs Eugene Yeo et Lawrence Goldstein, UC San Diego, d'avoir fourni la gamme DE cellules progénitrices neurales CVB WT24. Nous remercions Deborah Pre dans le laboratoire de la Dre Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, pour des discussions utiles.

1. Période de différenciation avant le replaquage
<ol><li>Différencier les neurones sur les plats de 10 cm, en utilisant un protocole de choix7,8 jusqu'à ce que les neurones ont formé un réseau épais avec leurs processus et d'exprimer non seulement les premiers marqueurs neuronaux tels que MAP2 ou TuJ1, mais aussi des marqueurs tardifs tels que NeuN.</li>
	<li>
Changez la moitié du milieu de choix tous les 4 jours pendant le processus de différ...

<ol>
	<li>Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+pitfalls+of+stem+cell+differentiation:+a+guide+to+improving+protocols+for+neurodegenerative+disease+models+and+research.">Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).</li><li>Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD.">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).</li><li>Amin, N. D., Pa&#351;ca, S. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustrating+the+potency+of+current+Good+Manufacturing+Practice-compliant+induced+pluripotent+stem+cell+lines+as+a+source+of+multiple+cell+lineages+using+standardized+protocols.">Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols.</a> Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).</li><li>Suga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+hypothalamic+and+pituitary+cells.">Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells.</a> Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).</li><li>Endaya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+dividing+neural+and+brain+tumour+cells+for+gene+expression+profiling.">Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).</li><li>Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+activated+cell+sorting+(FACS):+a+rapid+and+reliable+method+to+estimate+the+number+of+neurons+in+a+mixed+population.">Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population.</a> Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).</li><li>Frega, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Neuronal+Differentiation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Measuring+Network+Activity+on+Micro-electrode+Arrays.">Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays.</a> Journal of Visualized Experiments. 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Nous avons démontré une procédure directe pour la resuspension et le replaquage des cultures neuronales humaines qui optimise la viabilité, le succès de différenciation, et l'imagerie subcellulaire d'une manière qui est compatible avec les plates-formes de criblage à haute teneur, et d'autres essais pertinents à la découverte de médicaments. La figure 6 illustre le flux de travail global et les exemples de ces applications.
Bien qu'ici nous nous sommes ...

Les neurones dérivés des cellules souches pluripotentes humaines (hiPSC) sont de plus en plus pertinents dans les domaines de la recherche fondamentale, du développement de médicaments et de la médecine régénérative. Les workflows et les procédures pour optimiser leur culture et leur entretien, et améliorer l'efficacité de la différenciation en sous-types neuronaux spécifiques, évoluent rapidement1,2. Afin d'améliorer l'utilité et la rentabilité des neurones dérivés des cellules souches humaines en tant que systèmes modèles propices à des analyses à haute teneur en matière de découverte de médicaments et de validation de cibles, il est utile de réduire le temps de culture requis pour générer des neurones, tout en conservant la robustesse maximale, la reproductibilité, et la pertinence de phénotype. Bien que les cultures organoïdes tridimensionnelles soient à l'origine de percées dans la recherche sur le neurodéveloppement3, les cultures monocouches bidimensionnelles sont particulièrement compatibles avec les applications automatisées basées sur l'imagerie en raison de leur épaisseur minimale des tissus.
Cependant, l'adaptation des méthodes de dépistage basées sur l'imagerie aux modèles de maladies neurologiques et neurodéveloppementales humaines fait face à un défi majeur. Le délai prolongé sur lequel le système nerveux humain mûrit in vivo nécessite un temps prolongé dans la culture pour accueillir les programmes naturels d'expression génique et atteindre la maturation neuronale.
Une conséquence pratique du long programme de différenciation neuronale est que le maintien des cultures de monocouches dérivées de hiPSC doit être soutenu pendant de nombreuses semaines pour atteindre la maturité synapse adéquate. Pendant ce temps, les progéniteurs neuronaux qui restent indifférenciés continuent de se diviser. Ceux-ci peuvent rapidement dépasser la culture et usurper la teneur en nutriments nécessaires pour maintenir des neurones postmitotiques viables. La division vigoureuse des cellules progénitrices neurales (PNJ) peut également rivaliser avec les neurones pour le substrat de croissance. Cela peut rendre ces cultures sujettes à des problèmes de mauvaise adhérence, une condition impropre aux essais basés sur l'imagerie. En outre, beaucoup d'investigateurs constatent que plus le volume de culture est petit, plus la difficulté à maintenir des populations saines de neurones différenciés assez longtemps pour observer les derniers stades de la différenciation neuronale est grande. En d'autres termes, les essais de maturation des synapses à l'aide d'approches de dépistage à haute teneur (HCS) peuvent être très difficiles pour les neurones d'origine humaine.
Pour contourner certains de ces problèmes, une procédure de re-suspension et de replaquage des neurones dérivés de hiPSC précédemment différenciés a été utilisée. Tout d'abord, il permet l'étude de la croissance neurite (ou, plus exactement, la régénération neurite) dans une population de neurones pleinement engagés. Deuxièmement, le replaquage de neurones précédemment différenciés d'un format de grand volume (comme des plaques de 10 cm ou plus), jusqu'à de petits formats de volume (comme les plaques de microtiter 96 ou 384 puits compatibles Avec le HCS) permet une réduction significative du temps total de culture dans l'état du petit volume. Ceci facilite l'étude de l'assemblage et de la maturation de synapse au cours des semaines suivantes in vitro.
Cependant, le replaquage des neurones matures qui ont déjà établi de longues neurites et un réseau de connectivité complexe présente plusieurs défis, dont l'un est le taux parfois élevé et variable de la mort cellulaire. Ici, nous décrivons une procédure de replating qui a comme conséquence la survie et la reproductibilité excellentes de cellules. Généralement, les neurones sont exposés à des enzymes protéolytiques pendant de courtes périodes d'incubation (généralement de 3 à 10 minutes) afin de détacher les cellules du substrat avant la trituration. Ce bref temps de protéolyse est habituellement utilisé pour resuspendre et transmettre de nombreux types de cellules de division, y compris les cellules non neuronales et les progéniteurs indifférenciés4,5,6. Cependant, pour les neurones différenciés portant de longues néurites interconnectées, il est essentiel non seulement de détacher les cellules du substrat, mais aussi de perturber le réseau dendritique et axonal afin d'isoler les cellules individuelles tout en minimisant les dommages. En effet, un maillage épais de neurones tend généralement à se détacher du substrat comme une seule feuille, plutôt que comme des cellules individuelles. Si l'on ne fait pas attention à desserrer l'épais réseau de neurites, les neurones deviennent non seulement irrémédiablement endommagés pendant la trituration, mais beaucoup d'entre eux ne parviennent pas à passer à travers le filtre utilisé pour enlever les amas, ce qui entraîne un faible rendement cellulaire. Ci-dessous nous décrivons une modification simple à une procédure d'incubation de protéase largement utilisée pour contrer ces difficultés.
Dans le protocole décrit ci-dessous, les neurones sont incubés pendant 40-45 min avec une protéase douce, comme l'enzyme protéolytique (par exemple, Accutase). Pendant les 5-10 premières min après l'ajout de l'enzyme, le réseau neuronal se soulève du substrat comme une feuille. L'incubation avec la protéase se poursuit pendant 30-40 minutes supplémentaires avant de procéder à une trituration douce et au filtrage. Ce temps d'incubation supplémentaire permet de s'assurer que la digestion du matériau détend le réseau intercellulaire, assurant ainsi que la trituration ultérieure produit une suspension des cellules individuelles. Cette procédure maximise l'uniformité de la distribution cellulaire lors du replaquage tout en minimisant la mort cellulaire. Nous avons appliqué avec succès cette méthode de replaquage aux cultures neuronales hiPSC-dérivées générées par divers protocoles de différenciation7,8 et de diverses lignes de hiPSCs. La procédure est nominalement appropriée pour une utilisation avec la plupart ou toutes les lignes de neurones dérivés de cellules souches. Nous avons observé qu'un temps d'incubation prolongé du protéase n'est pas absolument essentiel pour replaquer les cultures à partir de plaques de petit format (p. ex., 35 mm de diamètre); cependant, comme nous le montrons ici, il offre un avantage significatif lors du replatage des plaques de grand diamètre (par exemple, 10 cm de diamètre ou plus), probablement parce que les neurites dans ces plaques peuvent prolonger les processus très longs et former un tableau densément interconnecté.
Ici, nous démontrons cette méthode et illustrent brièvement son application dans les essais pour la néuritogénèse précoce et pour la maturation de synapse, qui implique le regroupement des protéines pré- et postsynaptic le long des dendrites et des axones, suivis par leurs plus tard colocalisation sur les sites synaptiques. Les exemples mettent en évidence les avantages que ce protocole offre dans la préservation de la viabilité et de la reproductibilité cellulaires. Tout d'abord, il permet aux chercheurs d'étudier les premières étapes de la néuritogénèse humaine. Le cadre expérimental est similaire aux cultures primaires couramment utilisées des neurones corticaux ou hippocampiques de rongeurs, où les cellules sont extraites du cerveau foetal tardif ou postnatal précoce, dissociées par trituration après le traitement doux de protéase, et ont permis de initier des neurites ou régénérer les névrites qui ont été sectionnées dans la procédure9,10. Semblable à ces neurones primaires de rongeur, les neurones hiPSC-dérivés commencent à former ou régénérer leurs neurites dans les heures suivant le replaquage, permettant l'imagerie des cônes de croissance et de la morphologie neurite dans un environnement optimal pour l'imagerie spatiotemporal élevée avec moins de cellules indifférenciées. Nous avons observé que la croissance neurite est plus synchronisée par rapport aux retards variables et aux différents taux de croissance observés lorsque les neurones commencent à se différencier d'une population progénitrice. En outre, le replaquage permet d'évaluer les neurones exprimant des marqueurs de sous-type neuronaux qui apparaissent généralement plus tard dans le développement neuronal, tels que la couche corticale 5/6 facteur de transcription CTIP2 (Chicken ovalbumin upstream promoter transcription protéine d'interaction de facteur 2), ou le marqueur pan-neuronal NeuN11. Une caractéristique particulièrement utile de l'approche de replaquage est que la synaptogénèse se déroule dans un délai compatible avec HCS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1076px;" width="1076">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Post Replating Media</td>
			<td style="width:276px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:377px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dibutyryl-cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>Add 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human BDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">450-02</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td>Add 20 ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DMEM/F12 with Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>31331093</td>
			<td>Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human GDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 100 &#181;l to 50 mL N2B27</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11140035</td>
			<td>Add 5ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">N2 (100X) Supplement</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Add 5ml to 500mL media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal A Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>for WT126 cells; neural basal media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SM1 Supplement</td>
			<td style="width:276px;">StemCell Technologies</td>
			<td>5711</td>
			<td>Add 1:50 to media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>25080-094</td>
			<td>Add 10ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Plate Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10cm Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08772-E</td>
			<td>Plastic TC-treated dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">6-well Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Thomas Scientific</td>
			<td>1194Y80</td>
			<td>NEST plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Add 1:400 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-Ornithine</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 1:1000 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td>To dilute Poly-L-Ornithine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Replating Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">100mM Cell Strainer</td>
			<td style="width:276px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431752</td>
			<td>Sterile, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">384-well plate, uncoated</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6007550</td>
			<td>Coat with PLO and Laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DPBS</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190144</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6057500</td>
			<td>Rinse before coating with laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fixation Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F79-1</td>
			<td>Dissolved in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sucrose</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S5-12</td>
			<td>0.8 g per 10 ml of fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Immunostaining Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11041</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21449</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 561 Goat anti-rat</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11077</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DAPI</td>
			<td style="width:276px;">Biotium</td>
			<td>40043</td>
			<td>visualizes DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1)</td>
			<td style="width:276px;">Neuromics</td>
			<td>MO15013</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rat antibody against CTIP2</td>
			<td style="width:276px;">Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>layer 5/6 cortical neurons</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">LifeSpan Biosciences</td>
			<td>LS-B290</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against NeuN</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>ABN91</td>
			<td>late stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">Shelley Halpain</td>
			<td>N/A</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against PSD-95</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P-246</td>
			<td>post-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against Synapsin 1</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>AB1543</td>
			<td>pre-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:276px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30574.02</td>
			<td>10% in PBS for blocking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Titon X-100</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9002931</td>
			<td>Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Viability Markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Vivafix 649/660</td>
			<td style="width:276px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">135-1118</td>
			<td>cell death marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Calcium Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:276px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE</td>
			<td>THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>calcium reporter in a viral delivery system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">hiPSC-derived NPCs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">WT 126 (Y2610)</td>
			<td style="width:276px;">Gage lab</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Marchetto et al., 2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">CVB WT24</td>
			<td style="width:276px;">Yeo and Goldstein labs</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>unpublished</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation

Les neurones différenciés en deux dimensions de cellules progénitrices neurales (PNJ) dérivées de cellules souches humaines représentent un système modèle puissant pour explorer les mécanismes de la maladie et effectuer un dépistage à haute teneur (HCS) pour interroger le composé bibliothèques ou identifier les phénotypes de mutation génétique. Cependant, avec les cellules humaines, la transition du PNJ au neurone fonctionnel et mature nécessite plusieurs semaines. Les synapses commencent généralement à se former après 3 semaines de différenciation dans la culture monocouche, et plusieurs protéines spécifiques aux neurones, par exemple le marqueur pan-neuronal exprimant plus tard NeuN, ou la couche 5/6 cérébrale marqueur de neurone cortical CTIP2, commencent à exprimer environ 4-5 semaines après la différiliation. Ce temps de différenciation prolongé peut être incompatible avec les conditions de culture optimales utilisées pour les plates-formes HCS à petit volume et multi-puits. Parmi les nombreux défis, il y a la nécessité de cellules bien respectées et distribuées uniformément avec un amas cellulaire minimal, et des procédures de culture qui favorisent la viabilité à long terme et la maturation des synapses fonctionnelles. Une approche consiste à différencier les neurones dans un format grand volume, puis les replaquer à un moment ultérieur dans hCS compatible multi-puits. Certains défis majeurs lors de l'utilisation de cette approche de replaquage concernent la reproductibilité et la viabilité cellulaire, en raison de la perturbation stressante du réseau dendritique et axonal. Ici nous démontrons une procédure détaillée et fiable pour enzymatiquement resuspendre les neurones de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) après leur différenciation pendant 4-8 semaines dans un format de grand volume, les transférant au microtiter de 384 puits plaques, et les cultiver pendant 1-3 semaines supplémentaires avec une excellente survie cellulaire. Ce replaquage des neurones humains permet non seulement l'étude de l'assemblage et de la maturation de synapse dans les deux semaines suivant le replaquage, mais permet également des études des caractéristiques de la régénération de neurite et du cône de croissance. Nous fournissons des exemples d'essais évolutifs pour la néuritogénèse et la synaptogénèse à l'aide d'une plate-forme de 384 puits.

Le replaquage des neurones dérivés des hiPSCs qui ont été différenciés pendant plusieurs semaines offre plusieurs avantages. Cependant, le détachage et le replaquage des neurones différenciés qui ont de longs dendrites et axones interconnectés (Figure 1A) peuvent entraîner une fraction élevée de neurones irrémédiablement endommagés.
Comme décrit dans la section de protocole, nous avons employé l'incubation avec une enzyme protéo...

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Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Ce protocole décrit une procédure détaillée pour resuspendre et cultiver les neurones dérivés de cellules souches humaines qui étaient précédemment différenciés des progéniteurs neuronaux in vitro pendant plusieurs semaines. La procédure facilite les essais basés sur l'imagerie des neurites, des synapses et des marqueurs neuronaux à expression tardive dans un format compatible avec la microscopie légère et le dépistage à haute teneur.

Post-différenciation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Ce protocole facilite l’utilisation de neurones pluripotents humains dérivés de cellules souches pour des applications de dépistage à haute teneur. Il est particulièrement bien adapté pour les synapses d’analyse, qui dans les neurones humains nécessitent de longues périodes de culture. Nous démontrons le replacage des neurones des plats grand format en puits multi compatibles HCS d’une manière qui préserve leur viabilité.Contre-intuitivement, nous montrons que l’extension de l’incubation de la protéase avant la réépendance et le replacage donne une meilleure survie neuronale. Les neurones pluripotents humains dérivés des cellules souches sont de plus en plus pertinents dans les domaines de la recherche fondamentale, du développement de médicaments et de la médecine dégénérative. Cette méthode de titration douce peut être utilisée pour résuspendre toute grande monocposition de cellules ayant un réseau épais de processus.En plus des iPSCs humains, il peut être utilisé pour replater la culture des neurones primaires ou pour les résuspendre pour le tri des faits ou le séquençage à cellule unique. Il est important de suivre attentivement les étapes des protocoles et de surveiller fréquemment le détachement médiatisé de la protéase des neurones de la plaque. Le temps d’incubation optimal peut varier selon la culture.La démonstration visuelle permet même aux enquêteurs inexpérimentés de reproduire cette procédure. Commencez par rincer doucement la plaque des neurones différenciés avec PBS. Dispersez le PBS sur le mur de la plaque et non directement sur les cellules pour éviter de les perturber.Aspirez le PBS du bord du plat tout en le faisant basculer, en prenant soin de ne pas toucher les cellules. Appliquer au moins un millilitre d’enzyme protéolytique par plaque de 10 centimètres. Et retourner les cellules à l’incubateur pendant 40 à 45 minutes.Pendant l’incubation, vérifiez les neurones sur un microscope à contraste progressive et continuez le traitement par protéase jusqu’à ce que le réseau neuronal se détache complètement de la plaque et commence à se briser. Lorsque les neurones se sont détachés, arrêter la digestion en ajoutant cinq millilitres de médias DEMEM frais pour chaque millilitre de protéase. Utilisez une pipette sérologique pour titiller doucement les cellules contre la plaque cinq à huit fois, en vous assurant de ne pas appliquer trop de pression.Filtrer les cellules à travers un maillage de 100 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres, goutte par goutte. Et rincez la passoire avec cinq millilitres supplémentaires de médias DMEM frais. Utilisez une centrifugeuse banc-dessus pour faire tourner les cellules vers le bas à 1000 fois G pendant cinq minutes.Après centrifugation, retourner le tube conique à l’armoire de biosécurité et aspirer la plupart des médias, laissant 250 microlitres pour garder les cellules humides. Resuspendez doucement les cellules en deux millilitres de médias DMEM frais, puis passez-les à travers l’extrémité d’une pipette sérologique de cinq millilitres. Enfin, inverser le tube deux à trois fois.Utilisez un hémocytomètre et un bleu tripan pour compter les cellules viables. Et puis DMEM à la concentration désirée. Ajoutez des suppléments appropriés au tube, selon les exigences de la lignée cellulaire spécifique et mélangez doucement les cellules en inclinant le tube conique deux à trois fois.Aspirer le revêtement de laminine à partir d’une plaque de 24 puits et rincer une fois avec PBS. Aspirez le PBS. Et appliquer la solution cellulaire à chaque puits dans un mouvement figure huit pour éviter de s’agglutiner.Une fois le placage fini des cellules, retourner la plaque à l’incubateur fixé à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Vortex brièvement la solution de stock du journaliste de mort de cellule tôt et l’ajoutez aux puits selon les directions manuscrites. Attends 20 minutes.Et puis l’image des cellules vivantes et mortes sur le fond de verre multi puits. Prolonger l’incubation de la protéase permet de desserrer le réseau neuronal dans la feuille de cellules soulevée. Il en résulte une réduction de la mort cellulaire au moment de la dissociation ainsi que des résultats dans une récupération plus efficace au cours des jours suivants.À l’aide de la procédure d’incubation prolongée des enzymes, les cultures présentent un doublement approximatif de la viabilité cellulaire au cours des jours qui ont après le replaqué et une densité plus faible de cellules mortes ou mourantes. La phase de transition de la différenciation neuronale se déroule sur plusieurs jours, au cours de laquelle les cellules expriment progressivement des marqueurs neuronaux à un stade avancé. Ces marqueurs sont immédiatement détectés dans les cultures qui ont été replacées après quatre semaines de pré-différenciation.Le protocole étendu de protéase améliore également modérément la excroissance de neuride. La longueur totale de neuride et la croissance de dendrite sont améliorées. Le replating est également utile pour étudier les synapses.Juste une semaine après le replacage, des marqueurs pour les protéines pré et post-synaptiques ont été observés. De plus, l’activité électrique provenant de la dépolarisation spontanée et des courants entraînés par synaptique est détectable à l’aide d’images calciques ou de tableaux multiélecrodés. Cette procédure de replaquement peut être adaptée à de nombreux types d’applications.En plus du criblage à contenu élevé pour identifier les composés thérapeutiques potentiels, il pourrait être utilisé pour l’imagerie des cônes de croissance ou des enregistrements de réseaux multiélecrodes. La dissociation mécanique des neurones qui ont déjà formé de longs processus est stressante. L’incubation enzymatique allongée et la titration douce des cellules sont des étapes essentielles pour le succès de cette procédure.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Dérivation efficace des ressources humaines progéniteurs neuronaux et des neurones à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Recherche

Neurosciences

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

La spécification des neurones glutamatergiques télencéphaliques de cellules souches pluripotentes humaines

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modélisation d’infection par le Virus de Zika du développement cerveau humain In Vitro à l’aide de cellules souches dérivées cérébrale organoïdes

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Développement de dosage pour une Quantification contenue élevée de Formation globale de protéine mutante Sod1 dans les cellules vivantes

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

PROCEDE de blessure extensibles haute vitesse de l’homme induite par des neurones de dérivés de cellules souches pluripotentes dans un Format 96 puits

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Compartmentalisation des neurones dérivés des cellules souches humaines dans des puces microfluidiques en plastique pré-assemblées

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs) en neurones moteurs spinaux et crânien fonctionnels utilisant des vecteurs PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migrations, Chemo-Attraction et Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons (en anglais)

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analyse du transport mitochondrial et de la morphologie dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans la paraplégie spastique héréditaire

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Génération de neurones humains et d’oligodendrocytes à partir de cellules souches pluripotentes pour la modélisation des interactions neurone-oligodendrocytes

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...