Name: post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation
Uploaded: 2019-08-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation at JoVE.com

Diese Arbeit ist Bestandteil der National Cooperative Reprogrammed Cell Research Groups (NCRCRG) zur Untersuchung psychischer Erkrankungen und wurde durch das NIH-Stipendium U19MH1 2015-0644 unterstützt. Die ersten Arbeiten wurden auch durch den NIH-Zuschuss NS070297 unterstützt. Wir danken Dr. Carol Marchetto und Fred Gage, The Salk Institute, für die Bereitstellung der WT 126 Linie von neuronalen Vorläuferzellen, und Dr. Eugene Yeo und Lawrence Goldstein, UC San Diego für die Bereitstellung der CVB WT24 Linie von neuronalen Vorläuferzellen. Wir danken Deborah Pre im Labor von Dr. Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, für nützliche Diskussionen.

1. Differenzierungszeitraum vor dem Replatieren
<ol><li>Unterscheiden Sie Neuronen auf 10 cm Geschirr, mit einem Protokoll der Wahl7,8 bis Neuronen haben ein dickes Netzwerk mit ihren Prozessen gebildet und drücken Nicht nur frühe neuronale Marker wie MAP2 oder TuJ1, sondern auch späte Marker wie NeuN.</li>
	<li>
Ändern Sie die Hälfte des Mediums der Wahl alle 4 Tage während des neuronalen Differenzierungsprozesses. HINWEIS: Umfangreic...

<ol>
	<li>Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+pitfalls+of+stem+cell+differentiation:+a+guide+to+improving+protocols+for+neurodegenerative+disease+models+and+research.">Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).</li><li>Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD.">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).</li><li>Amin, N. D., Pa&#351;ca, S. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustrating+the+potency+of+current+Good+Manufacturing+Practice-compliant+induced+pluripotent+stem+cell+lines+as+a+source+of+multiple+cell+lineages+using+standardized+protocols.">Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols.</a> Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).</li><li>Suga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+hypothalamic+and+pituitary+cells.">Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells.</a> Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).</li><li>Endaya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+dividing+neural+and+brain+tumour+cells+for+gene+expression+profiling.">Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).</li><li>Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+activated+cell+sorting+(FACS):+a+rapid+and+reliable+method+to+estimate+the+number+of+neurons+in+a+mixed+population.">Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population.</a> Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).</li><li>Frega, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Neuronal+Differentiation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Measuring+Network+Activity+on+Micro-electrode+Arrays.">Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).</li><li>Grainger, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+for+Seizure-Liability+Testing+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).</li><li>Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+of+primary+neurons:+ready+for+prime+time.">High-content screening of primary neurons: ready for prime time.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).</li></ol>

Wir haben ein geradliniges Verfahren zur Resuspension und Replatierung menschlicher neuronaler Kulturen demonstriert, das die Lebensfähigkeit, den Differenzierungserfolg und die subzelluläre Bildgebung in einer Weise optimiert, die mit Screening-Plattformen mit hohem Inhalt kompatibel ist. und andere Assays, die für die Entdeckung von Arzneimitteln relevant sind. Abbildung 6 zeigt den gesamten Workflow und Beispiele für solche Anwendungen.
Obwohl wir uns hier ...

Humane pluripotente Stammzell (hiPSC)-abgeleitete Neuronen sind zunehmend relevant in den Bereichen Grundlagenforschung, Arzneimittelentwicklung und regenerative Medizin. Workflows und Verfahren zur Optimierung ihrer Kultur und Wartung und zur Verbesserung der Effizienz der Differenzierung in bestimmte neuronale Subtypen entwickeln sich schnell1,2. Um den Nutzen und die Kostenwirksamkeit menschlicher Stammzellen-abgeleiteter Neuronen als Modellsysteme zu verbessern, die für hochklassige Analysen in der Arzneimittelentdeckung und Zielvalidierung geeignet sind, ist es sinnvoll, die Kultivierungszeit zu verringern, die erforderlich ist, um ausgereifte, funktionelle Unter Beibehaltung maximaler Robustheit, Reproduzierbarkeit und Phänotyprelevanz. Obwohl dreidimensionale organoide Kulturen den Durchbruch inder Neuroentwicklungsforschung vorantreiben 3, sind 2-dimensionale Monolayer-Kulturen aufgrund ihrer minimalen Gewebedicke besonders kompatibel mit automatisierten bildgebenden Anwendungen.
Die Anpassung bildgebender Screening-Methoden an Modelle menschlicher neurologischer und neuroentwicklungsbasierter Erkrankungen steht jedoch vor einer großen Herausforderung. Der lange Zeitrahmen, über den das menschliche Nervensystem in vivo reift, erfordert eine längere Zeit in der Kultur, um natürliche Programme der Genexpression aufzunehmen und eine neuronale Reifung zu erreichen.
Eine praktische Folge des langwierigen neuronalen Differenzierungsprogramms ist, dass die Aufrechterhaltung von hiPSC-abgeleiteten Monolayer-Kulturen für viele Wochen aufrechterhalten werden muss, um eine angemessene Synapsenreife zu erreichen. Während dieser Zeit, neuronale Vorläufer, die undifferenziert bleiben weiterhin zu teilen. Diese können schnell die Kultur überwuchern und den Nährstoffgehalt an sich reißen, der erforderlich ist, um lebensfähige postmitotische Neuronen aufrechtzuerhalten. Kräftig trennende neuronale Vorläuferzellen (NPCs) können auch mit Neuronen um das Wachstumssubstrat konkurrieren. Dies kann solche Kulturen Zufall von Problemen der schlechten Haftung machen, eine Bedingung, die für bildgebende Assays ungeeignet ist. Darüber hinaus stellen viele Forscher fest, dass je kleiner das Kulturvolumen, desto größer die Schwierigkeit bei der Aufrechterhaltung gesunder Populationen von differenzierten Neuronen lange genug, um die späten Stadien der neuronalen Differenzierung zu beobachten. Mit anderen Worten, Assays der Synapsenreifung mit HIGH-Content-Screening -Ansätzen (HCS) können für vom Menschen abgeleitete Neuronen eine große Herausforderung darstellen.
Um einige dieser Probleme zu umgehen, wurde ein Verfahren zum Resuspendieren und Replatieren von zuvor differenzierten hiPSC-abgeleiteten Neuronen verwendet. Erstens ermöglicht es die Untersuchung des Neuritenwachstums (oder genauer gesagt der Neuritenregeneration) in einer Population voll engagierter Neuronen. Zweitens ermöglicht die Replatierung von zuvor differenzierten Neuronen von einem großvolumigen Format (z. B. 10 cm Platten oder größer) bis hin zu kleinen Volumenformaten (wie HCS-kompatible 96- oder 384-Well-Mikrotiterplatten) eine signifikante Reduzierung der Gesamtkultivierungszeit in die kleine Lautstärkebedingung. Dies erleichtert die Untersuchung der Synapsenmontage und Reifung in den folgenden Wochen in vitro.
Die Wiederherstellung von ausgereiften Neuronen, die bereits lange Neuriten und ein komplexes Konnektivitätsnetzwerk etabliert haben, stellt jedoch mehrere Herausforderungen dar, von denen eine die manchmal hohe und variable Rate des Zelltodes ist. Hier beschreiben wir ein Replating-Verfahren, das zu einem ausgezeichneten Zellüberleben und Reproduzierbarkeit führt. Üblicherweise sind Neuronen proteolytischen Enzymen für kurze Inkubationsperioden (in der Regel 3-10 min) ausgesetzt, um Zellen vor der Trituration vom Substrat zu lösen. Diese kurze Proteolysezeit wird üblicherweise für das Resuspendieren und Passieren vieler Arten von teilenden Zellen verwendet, einschließlich nicht-neuronaler Zellen und undifferenzierter Vorläufer4,5,6. Für differenzierte Neuronen mit langen, miteinander verbundenen Neuriten ist es jedoch wichtig, nicht nur Zellen vom Substrat zu lösen, sondern auch das dendritische und axonale Netzwerk zu stören, um einzelne Zellen zu isolieren und gleichzeitig Schäden zu minimieren. Tatsächlich neigt ein dickes Netz von Neuronen in der Regel dazu, sich als einzelnes Blatt vom Substrat zu lösen, anstatt als einzelne Zellen. Wenn nicht darauf geachtet wird, das dicke Netz von Neuriten zu lösen, werden Neuronen nicht nur während der Trituration irreversibel geschädigt, sondern viele von ihnen passieren nicht den Filter, der verwendet wird, um Klumpen zu entfernen, was zu einer schlechten Zellausbeute führt. Im Folgenden beschreiben wir eine einfache Änderung an einem weit verbreiteten Protease-Inkubationsverfahren, um diesen Schwierigkeiten entgegenzuwirken.
In dem unten beschriebenen Protokoll werden Neuronen für 40-45 min mit einer milden Protease, wie dem proteolytischen Enzym (z. B. Accutase), inkubiert. Während der ersten 5-10 min nach Zugabe des Enzyms hebt sich das neuronale Netzwerk als Blatt vom Substrat ab. Die Inkubation mit der Protease erfolgt für weitere 30-40 min, bevor es mit sanfter Triturierung und Filterung geht. Diese zusätzliche Inkubationszeit trägt dazu bei, dass die Verdauung des Materials das interzelluläre Netzwerk entspannt und somit sicherstellt, dass die nachfolgende Trituration zu einer Suspension einzelner Zellen führt. Dieses Verfahren maximiert die Gleichmäßigkeit der Zellverteilung beim Replatieren bei gleichzeitiger Minimierung des Zelltodes. Wir haben diese Replating-Methode erfolgreich auf hiPSC-abgeleitete neuronale Kulturen angewendet, die durch verschiedene Differenzierungsprotokolle7,8 und aus verschiedenen Zeilen von hiPSCs erzeugt werden. Das Verfahren ist nominell für die Verwendung mit den meisten oder allen Linien von Stammzell-abgeleiteten Neuronen geeignet. Wir haben festgestellt, dass eine verlängerte Protease-Inkubationszeit für die Replatierung von Kulturen aus Kleinformatplatten (z. B. 35 mm Durchmesser) nicht unbedingt erforderlich ist; Wie wir hier zeigen, bietet es jedoch einen erheblichen Vorteil bei der Replatierung von Platten mit großem Durchmesser (z.B. 10 cm Durchmesser oder größer), wahrscheinlich weil Neuriten in solchen Platten sehr lange Prozesse ausdehnen und ein dicht miteinander verbundenes Array bilden können.
Hier zeigen wir diese Methode und veranschaulichen kurz ihre Anwendung in Assays für die frühe Neuritogenese und für die Synapsenreifung, die das Clustern von prä- und postsynaptischen Proteinen entlang der Dendriten und Axone beinhaltet, gefolgt von deren späteren Kolokalisierung an synaptischen Standorten. Die Beispiele zeigen die Vorteile dieses Protokolls bei der Erhaltung der Zelllebensfähigkeit und Reproduzierbarkeit. Erstens erlaubt es den Forschern, frühe Schritte in der menschlichen Neuritogenese zu untersuchen. Die experimentelle Umgebung ähnelt den häufig verwendeten Primärkulturen von Nagetierkortikal- oder Hippocampus-Neuronen, bei denen Zellen aus dem späten fetalen oder frühen postnatalen Gehirn extrahiert, durch Trituration nach sanfter Proteasebehandlung dissoziiert und erlaubt werden, Neuriten initiieren oder Neuriten regenerieren, die im Verfahren9,10abgetrennt wurden. Ähnlich wie solche Nagetier-Primärneuronen beginnen hiPSC-abgeleitete Neuronen ihre Neuriten innerhalb von Stunden nach der Replatierung zu bilden oder zu regenerieren, was die Abbildung von Wachstumskegeln und Neuritenmorphologie in einer Umgebung ermöglicht, die für eine hohe raumzeitliche Bildgebung mit weniger umsiebende undifferenzierte Zellen. Wir haben beobachtet, dass das Neuritenwachstum im Vergleich zu den variablen Verzögerungen und unterschiedlichen Auswuchsraten, die beobachtet werden, wenn Neuronen zum ersten Mal beginnen, sich von einer Vorläuferpopulation zu unterscheiden, stärker synchronisiert ist. Darüber hinaus ermöglicht die Replatierung Assays von Neuronen, die neuronale Subtypmarker exemiten, die typischerweise später in der neuronalen Entwicklung auftreten, wie z. B. der kortikale Schicht 5/6 Transkriptionsfaktor CTIP2 (Chicken ovalbumin upstream promoter transcription Faktor-interagierendes Protein 2) oder den pan-neuronalen Marker NeuN11. Ein besonders nützliches Merkmal des Replating-Ansatzes ist, dass die Synaptogenese innerhalb eines mit HCS kompatiblen Zeitrahmens verläuft.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1076px;" width="1076">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Post Replating Media</td>
			<td style="width:276px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:377px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dibutyryl-cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>Add 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human BDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">450-02</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td>Add 20 ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DMEM/F12 with Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>31331093</td>
			<td>Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human GDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 100 &#181;l to 50 mL N2B27</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11140035</td>
			<td>Add 5ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">N2 (100X) Supplement</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Add 5ml to 500mL media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal A Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>for WT126 cells; neural basal media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SM1 Supplement</td>
			<td style="width:276px;">StemCell Technologies</td>
			<td>5711</td>
			<td>Add 1:50 to media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>25080-094</td>
			<td>Add 10ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Plate Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10cm Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08772-E</td>
			<td>Plastic TC-treated dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">6-well Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Thomas Scientific</td>
			<td>1194Y80</td>
			<td>NEST plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Add 1:400 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-Ornithine</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 1:1000 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td>To dilute Poly-L-Ornithine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Replating Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">100mM Cell Strainer</td>
			<td style="width:276px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431752</td>
			<td>Sterile, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">384-well plate, uncoated</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6007550</td>
			<td>Coat with PLO and Laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DPBS</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190144</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6057500</td>
			<td>Rinse before coating with laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fixation Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F79-1</td>
			<td>Dissolved in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sucrose</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S5-12</td>
			<td>0.8 g per 10 ml of fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Immunostaining Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11041</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21449</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 561 Goat anti-rat</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11077</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DAPI</td>
			<td style="width:276px;">Biotium</td>
			<td>40043</td>
			<td>visualizes DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1)</td>
			<td style="width:276px;">Neuromics</td>
			<td>MO15013</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rat antibody against CTIP2</td>
			<td style="width:276px;">Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>layer 5/6 cortical neurons</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">LifeSpan Biosciences</td>
			<td>LS-B290</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against NeuN</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>ABN91</td>
			<td>late stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">Shelley Halpain</td>
			<td>N/A</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against PSD-95</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P-246</td>
			<td>post-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against Synapsin 1</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>AB1543</td>
			<td>pre-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:276px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30574.02</td>
			<td>10% in PBS for blocking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Titon X-100</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9002931</td>
			<td>Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Viability Markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Vivafix 649/660</td>
			<td style="width:276px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">135-1118</td>
			<td>cell death marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Calcium Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:276px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE</td>
			<td>THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>calcium reporter in a viral delivery system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">hiPSC-derived NPCs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">WT 126 (Y2610)</td>
			<td style="width:276px;">Gage lab</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Marchetto et al., 2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">CVB WT24</td>
			<td style="width:276px;">Yeo and Goldstein labs</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>unpublished</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation

Neuronen, die in der zweidimensionalen Kultur von menschlichen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen (NPCs) unterschieden werden, stellen ein leistungsfähiges Modellsystem dar, um Krankheitsmechanismen zu erforschen und ein hochgehaltiges Screening (HCS) durchzuführen, um Verbindungen zu verhören. oder Genmutationsphänotypen zu identifizieren. Bei menschlichen Zellen dauert der Übergang vom NPC zum funktionellen, reifen Neuron jedoch mehrere Wochen. Synapsen beginnen sich in der Regel nach 3 Wochen Differenzierung in der Monolayer-Kultur zu bilden, und mehrere neuronspezifische Proteine, z. B. der später exprimierende panneuronale Marker NeuN, oder die Schicht 5/6 zerebralen kortikalen Neuronenmarker CTIP2, beginnen auszudrücken ca. 4-5 Wochen nach der Differenzierung. Diese lange Differenzierungszeit kann mit optimalen Kulturbedingungen für kleine, multi-well-HCS-Plattformen nicht kompatibel sein. Zu den vielen Herausforderungen gehören die Notwendigkeit gut haftender, gleichmäßig verteilter Zellen mit minimalem Zellclustering und Kulturverfahren, die die langfristige Lebensfähigkeit und die funktionelle Synapsenreifung fördern. Ein Ansatz besteht darin, Neuronen in einem großen Volumenformat zu differenzieren und sie dann zu einem späteren Zeitpunkt in HCS-kompatiblen Multi-Wells neu zu zeichnen. Einige der Hauptherausforderungen bei der Verwendung dieses Replating-Ansatzes betreffen die Reproduzierbarkeit und Zelllebensfähigkeit aufgrund der belastenden Störung des dendritischen und axonalen Netzwerks. Hier zeigen wir ein detailliertes und zuverlässiges Verfahren zur enzymatischen Suspendierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell (hiPSC)-abgeleiteten Neuronen nach ihrer Differenzierung für 4-8 Wochen in einem großvolumigen Format und übertragen sie auf 384-Well-Mikrotiter und kultivieren sie für weitere 1-3 Wochen mit ausgezeichnetem Zellüberleben. Diese Replatierung menschlicher Neuronen ermöglicht nicht nur die Untersuchung der Synapsenmontage und Reifung innerhalb von zwei Wochen nach der Replatierung, sondern ermöglicht auch Studien zur Neuritregeneration und Wachstumskegeleigenschaften. Wir liefern Beispiele für skalierbare Assays für Neuritogenese und Synaptogenese mit einer 384-Well-Plattform.

Die Replatierung von hiPSCs-abgeleiteten Neuronen, die seit mehreren Wochen differenziert wurden, bietet mehrere Vorteile. Das Lösen und Replatieren differenzierter Neuronen, die lange, miteinander verbundene Dendriten und Axone haben (Abbildung 1A) kann jedoch zu einem hohen Anteil irreversibel geschädigter Neuronen führen.
Wie im Protokollabschnitt beschrieben, verwendeten wir die Inkubation mit einem proteolytischen Enzym, um die Neuronen vo...

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Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Aussetzung und Kultivierung von neuronen menschlichen Stammzellen, die zuvor mehrere Wochen lang von neuronalen Vorläufern in vitro unterschieden wurden. Das Verfahren erleichtert bildgebende Assays von Neuriten, Synapsen und spät exemitten neuronalen Markern in einem Format, das mit Lichtmikroskopie und High-Content-Screening kompatibel ist.

Post-Differenzierung Replating von Human Pluripotent Stem Cell abgeleiteten Neuronen für High-Content Screening von Neuritogenese und Synapse Reifung

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Dieses Protokoll erleichtert die Verwendung von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten Neuronen für Hochgehalt-Screening-Anwendungen. Es eignet sich besonders gut für die Aussage von Synapsen, die in menschlichen Neuronen lange Kulturperioden erfordern. Wir zeigen die Replating von Neuronen von großformatigen Gerichten in HCS-kompatible Multibrunnen in einer Weise, die ihre Lebensfähigkeit bewahrt.Gegen-intuitiv zeigen wir, dass die Verlängerung der Protease-Inkubation vor der Resuspendation und Replatierung ein verbessertes neuronales Überleben ergibt. Menschliche pluripotente Stammzell-abgeleitete Neuronen sind zunehmend relevant in den Bereichen Grundlagenforschung, Arzneimittelentwicklung und degenerative Medizin. Diese sanfte Titrationsmethode kann verwendet werden, um jede große Monoschicht von Zellen mit einem dicken Netzwerk von Prozessen wieder aufzuhängen.Zusätzlich zu menschlichen iPSCs kann es verwendet werden, um die Kultur der primären Neuronen neu zu plädienen oder sie für die Faktensortierung oder Einzelzellsequenzierung wieder auszusetzen. Es ist wichtig, die Protokolle Schritte sorgfältig zu folgen und häufig überwachen die Protease vermittelte Ablösung der Neuronen von der Platte. Die optimale Inkubationszeit kann je nach Kultur variieren.Visuelle Demonstration ermöglicht es auch unerfahrenen Forschern, dieses Verfahren zu reproduzieren. Beginnen Sie mit dem sanften Spülen der Platte von differenzierten Neuronen mit PBS. Dispergieren Sie die PBS an der Wand der Platte und nicht direkt auf die Zellen, um sie nicht zu stören.Aspirieren Sie die PBS vom Rand der Schale, während Sie sie kippen, wobei Sie darauf achten, die Zellen nicht zu berühren. Tragen Sie mindestens einen Milliliter proteolytischer Enzyme pro 10-Zentimeter-Platte auf. Und geben Sie die Zellen für 40 bis 45 Minuten in den Inkubator zurück.Während der Inkubation überprüfen Sie Neuronen auf einem phasenweisen Kontrastmikroskop und setzen die Protease-Behandlung fort, bis sich das neuronale Netzwerk vollständig von der Platte löst und zu brechen beginnt. Wenn sich die Neuronen gelöst haben, stoppen Sie die Verdauung, indem Sie fünf Milliliter frische DEMEM-Medien für jeden Milliliter Protease hinzufügen. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um die Zellen fünf- bis achtmal sanft gegen die Platte zu tittieren, um sicherzustellen, dass nicht zu viel Druck ausgeübt wird.Die Zellen durch ein 100-Mikrometer-Netz in ein 50 Milliliter konisches Rohr abtropfenlassen. Und spülen Sie das Sieb mit zusätzlich fünf Milliliter frischen DMEM-Medien. Verwenden Sie eine Tischzentrifuge, um die Zellen fünf Minuten lang bei 1000-fachm G nach unten zu drehen.Nach der Zentrifugation, geben Sie die konische Röhre in den Biosicherheitsschrank zurück und aspirieren Sie die meisten Medien, so dass 250 Mikroliter übrig bleiben, um die Zellen feucht zu halten. Die Zellen in zwei Millilitern frischer DMEM-Medien vorsichtig wieder aufhängen und dann durch das Ende einer fünf Milliliter serologischen Pipette passieren. Schließlich invertieren Sie die Röhre zwei- bis dreimal.Verwenden Sie ein Hämozytometer und Tripanblau, um die lebensfähigen Zellen zu zählen. Und dann DMEM zur gewünschten Konzentration. Fügen Sie dem Rohr je nach den Anforderungen der spezifischen Zelllinie geeignete Ergänzungen hinzu und mischen Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie das konische Rohr zwei- bis dreimal kippen.Aspirieren Sie Dielamininbeschichtung aus einer 24-Well-Platte und spülen Sie sie einmal mit PBS ab. Aspirieren Sie die PBS. Und wenden Sie Zelllösung auf jeden Brunnen in einer Figur acht Bewegung, um Klumpen zu vermeiden.Wenn die Zellen plattiert sind, geben Sie die Platte an den Inkubator zurück, der auf 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid eingestellt ist. Kurz wirbeln die Bestandslösung des frühen Zelltodreporters und fügen Sie sie den Brunnen entsprechend den Manuskriptanweisungen hinzu. Warten Sie 20 Minuten.Und dann bilden Sie die lebenden und toten Zellen auf Glasboden Multi-Brunnen. Die Verlängerung der Protease-Inkubation ermöglicht eine Lockerung des neuronalen Netzwerks innerhalb des angehobenen Zellblatts. Dies führt zu einem reduzierten Zelltod zum Zeitpunkt der Dissoziation sowie zu einer effizienteren Erholung in den folgenden Tagen.Mit Hilfe des erweiterten Enzyminkubationsverfahrens weisen die Kulturen eine ungefähre Verdoppelung der Zelllebensfähigkeit in den Tagen nach der Replatierung und eine geringere Dichte von abgestorbenen oder absterbenden Zellen auf. Die Übergangsphase der neuronalen Differenzierung findet über mehrere Tage statt, in der die Zellen nach und nach neuronale Marker im spätstadium exprimieren. Diese Marker werden sofort in Kulturen nachgewiesen, die nach vier Wochen Vordifferenzierung neu plattiert wurden.Das erweiterte Protease-Protokoll verbessert auch das Neurid-Auswuchs mäßig. Sowohl die Gesamtneuridlänge als auch das Dendritenwachstum werden verbessert. Replating ist auch nützlich für das Studium von Synapsen.Nur eine Woche nach der Replatierung wurden Marker für prä- und postsynaptische Proteine beobachtet. Darüber hinaus ist elektrische Aktivität durch spontane Depolarisation und synaptisch angetriebene Ströme mit Kalzium-Bildgebung oder Multielektroden-Arrays nachweisbar. Dieses Replating-Verfahren kann an viele Arten von Anwendungen angepasst werden.Zusätzlich zu high content Screening zur Identifizierung potenzieller therapeutischer Verbindungen könnte es für bildgebende Wachstumskegel oder Multielektroden-Array-Aufnahmen verwendet werden. Die mechanische Dissoziation von Neuronen, die bereits lange Prozesse gebildet haben, ist belastend. Eine längige enzymatische Inkubation und sanfte Titration von Zellen sind wesentliche Schritte für den Erfolg dieses Verfahrens.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Forschung

Neurowissenschaften

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Die Spezifikation der telencephalen glutamatergen Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellierung der Zika-Virus-Infektion des entwickelnden menschlichen Gehirns In Vitro mit Stammzellen abgeleitet zerebrale Organellen

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay-Entwicklung für hohe Content Quantifizierung der Sod1 mutierten Proteins Aggregatbildung in lebenden Zellen

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Methode für High-Speed Strecke Verletzungen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Neuronen in einem 96-Well-Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Unterteilung menschlicher Stammzellen-abgeleiteter Neuronen in vormontierte Mikrofluidchips aus Kunststoff

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migration, Chemo-Attraktion und Co-Culture-Assays für menschliche Stammzell-abgeleitete Endothelzellen und GABAerge Neuronen

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analyse von mitochondrialem Transport und Morphologie bei humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen bei erblicher spastischer Paraplegie

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Generierung humaner Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...