Name: post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation
Uploaded: 2019-08-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation at JoVE.com

Dette arbeidet er en del av National Cooperative omprogrammeres Cell Research groups (NCRCRG) for å studere psykiske lidelser og ble støttet av NIH stipend U19MH1 2015-0644. Innledende arbeid ble også støttet av NIH Grant NS070297. Vi takker DRS. Carol Marchetto og fred Gage, The Salk Institute, for å gi den WT 126 linje av nevrale stamceller, og DRS. Eugene Yeo og Lawrence Goldstein, UC San Diego for å gi CVB WT24 linje med nevrale stamceller. Vi takker Deborah pre i laboratoriet av Dr. Anne bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, for nyttige diskusjoner.

1. differensiering periode før Replating
<ol><li>Differensiere neurons på 10 cm retter, ved hjelp av en protokoll av valget7,8 til neurons har dannet et tykt nettverk med sine prosesser og uttrykker ikke bare tidlig neuronal markører som MAP2 eller TuJ1, men også sene markører som NeuN.</li>
	<li>
Endre halvparten av valget hver 4 dager i løpet av neuronal differensiering prosessen. Merk: mer omfattende eller hyppige medium endringer f...

<ol>
	<li>Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+pitfalls+of+stem+cell+differentiation:+a+guide+to+improving+protocols+for+neurodegenerative+disease+models+and+research.">Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).</li><li>Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD.">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).</li><li>Amin, N. D., Pa&#351;ca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+Models+of+Brain+Disorders+with+Three-Dimensional+Organoids.">Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids.</a> Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).</li><li>Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Passaging+Cells.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cancer Cell Culture. , (2010).</li><li>Picot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. 107, (2005).</li><li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+neuronal+cell+culture.">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).</li><li>Calabrese, B., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+the+PKC+target+MARCKS+in+maintaining+dendritic+spine+morphology.">Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology.</a> Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).</li><li>Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuN,+a+neuronal+specific+nuclear+protein+in+vertebrates.">NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates.</a> Development. 116 (1), 201-211 (1992).</li><li>Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+shrinkage+and+growth+involve+downregulation+of+cofilin+via+distinct+mechanisms.">Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms.</a> PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+Dorsal+Spinal+Sensory+Interneurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).</li><li>Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+induction+of+dorsal,+intermediate+and+ventral+spinal+cord+tissues+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Playne, R., Jones, K., Connor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dopamine+neuronal-like+cells+from+induced+neural+precursors+derived+from+adult+human+cells+by+non-viral+expression+of+lineage+factors.">Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors.</a> Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).</li><li>Rao, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustrating+the+potency+of+current+Good+Manufacturing+Practice-compliant+induced+pluripotent+stem+cell+lines+as+a+source+of+multiple+cell+lineages+using+standardized+protocols.">Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols.</a> Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).</li><li>Suga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+hypothalamic+and+pituitary+cells.">Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells.</a> Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).</li><li>Endaya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+dividing+neural+and+brain+tumour+cells+for+gene+expression+profiling.">Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).</li><li>Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+activated+cell+sorting+(FACS):+a+rapid+and+reliable+method+to+estimate+the+number+of+neurons+in+a+mixed+population.">Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population.</a> Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).</li><li>Frega, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Neuronal+Differentiation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Measuring+Network+Activity+on+Micro-electrode+Arrays.">Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).</li><li>Grainger, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+for+Seizure-Liability+Testing+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).</li><li>Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+of+primary+neurons:+ready+for+prime+time.">High-content screening of primary neurons: ready for prime time.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).</li></ol>

Vi har vist en rett frem prosedyre for blanding og replating av menneskelig neuronal kulturer som optimaliserer levedyktighet, differensiering suksess, og subcellulære Imaging på en måte som er kompatibel med høyt innhold screening plattformer, og andre analyser som er relevante for legemiddel funn. Figur 6 illustrerer den generelle arbeidsflyten og eksempler på slike programmer.
Selv om her har vi fokusert på hiPSC-avledet neurons som er rettet mot en korti...

Human pluripotent stilk cellen (hiPSC)-avledet neurons blir stadig mer relevant i de områdene av grunnleggende forskning, narkotika utvikling, og regenererende medisin. Arbeidsflyter og prosedyrer for å optimalisere deres kultur og vedlikehold, og forbedre effektiviteten av differensiering i bestemte neuronal under typer, utvikler seg raskt1,2. For å forbedre nytte og kostnadseffektivitet av menneskelig stilk cellen-avledet neurons som modellsystemer mottagelig for høyt innhold analyser i legemiddel funnet og mål validering, er det nyttig å redusere dyrking tiden som kreves for å generere modne, funksjonelle og samtidig beholde maksimal robusthet, reproduserbarhet og fenotype relevans. Selv om 3-dimensjonale organoid kulturer kjører gjennombrudd i neurodevelopment forskning3, 2-dimensjonale monolag kulturer er spesielt kompatible med automatiserte Imaging-baserte applikasjoner på grunn av deres minimale vev tykkelse.
Men tilpasningen av Imaging-baserte screening metoder til modeller av menneskelig nevrologisk og neurodevelopmental sykdom står overfor en stor utfordring. Den langvarige tidsrammen over hvor det menneskelige nervesystemet modnes i vivo nødvendiggjør utvidet tid i kulturen for å imøtekomme naturlige programmer av genuttrykk og oppnå neuronal modning.
En praktisk konsekvens av den langvarige neuronal differensiering programmet er at vedlikehold av hiPSC-avledet monolag kulturer må opprettholdes i mange uker for å oppnå tilstrekkelig synapse modenhet. I løpet av denne tiden, nevrale forfedre som forblir udifferensierte fortsette å dele. Disse kan raskt overgrow kulturen og tilrive næringsinnholdet som kreves for å opprettholde levedyktige postmitotic neurons. Kraftig dele nevrale stamceller (NPCer) kan også konkurrere med neurons for vekst underlaget. Dette kan gjøre slike kulturer utsatt for problemer med dårlig vedheft, en tilstand uegnet for Imaging-baserte analyser. Videre mange etterforskere finner at jo mindre kulturen volum, jo større vanskeligheter med å opprettholde sunne populasjoner av differensiert neurons lenge nok til å observere den sene stadier av neuronal differensiering. Med andre ord kan analyser av synapse modning ved hjelp av høyt innhold screening (HCS) tilnærminger være svært utfordrende for menneskeskapte neurons.
For å omgå noen av disse problemene, en prosedyre for blanding og replating tidligere differensiert hiPSC-avledet neurons har blitt brukt. For det første tillater det studiet av neurite utvekst (eller, mer presist, neurite regenerering) i en populasjon av fullt engasjerte neurons. For det andre, replating av tidligere differensiert neurons fra et stort volum format (som 10 cm plater eller større), ned til små volum formater (som HCS-kompatible 96-eller 384-vel mikrotiterbrønnene plater) gir en betydelig reduksjon i total dyrking tid i den lille volum tilstanden. Dette forenkler studiet av synapse forsamling og modning over påfølgende uker in vitro.
Men replating av modne neurons som allerede har etablert lange neurites og en kompleks tilkobling nettverk presenterer flere utfordringer, hvorav den ene er noen ganger høy og variabel hastighet på celle død. Her beskriver vi en replating prosedyre som resulterer i utmerket celle overlevelse og reproduserbarhet. Vanligvis er neurons eksponert for proteolytiske enzymer for korte inkubasjons perioder (vanligvis ~ 3-10 min) for å løsne celler fra underlaget før trituration. Denne korte proteinolyse tiden brukes vanligvis for blanding og passaging mange typer dele celler, inkludert ikke-neuronal celler og udifferensierte forfedre4,5,6. Men for differensiert neurons bærende lange, sammenkoblede neurites, er det viktig ikke bare å løsne celler fra underlaget, men også for å forstyrre dendrittiske og axonal nettverk for å isolere enkelte celler samtidig minimere skade. Faktisk, en tykk meshwork av neurons vanligvis en tendens til å løsne fra underlaget som et enkelt ark, snarere enn som individuelle celler. Hvis omsorg ikke er tatt for å løsne den tykke nettverk av neurites, neurons ikke bare bli irreversibelt skadet under trituration, men mange av dem ikke klarer å passere gjennom filteret som brukes til å fjerne klumper, noe som resulterer i dårlig celle yield. Nedenfor beskriver vi en enkel modifikasjon til en mye brukt protease inkubasjons prosedyre for å motvirke disse vanskelighetene.
I protokollen beskrevet nedenfor, neurons er inkubert for 40-45 min med en mild protease, slik som proteolytiske enzym (f. eks, Accutase). I løpet av de første 5-10 min etter å ha lagt enzymet, neuronal nettverket heiser ut fra underlaget som et ark. Inkubasjons med protease provenyet for ytterligere 30-40 min før du fortsetter med skånsom trituration og filtrering. Denne ekstra inkubasjonstiden bidrar til å sikre at fordøyelsen av materialet slapper av intercellulære nettverket, og dermed sikre at påfølgende trituration produserer en suspensjon av individuelle celler. Denne prosedyren maksimerer ensartethet av celle distribusjon ved replating mens minimere celle død. Vi har med hell brukt denne replating metoden til hiPSC-avledet neuronal kulturer generert av ulike differensiering protokoller7,8 og fra ulike linjer av hiPSCs. Prosedyren er nominelt egnet for bruk med de fleste eller alle linjer med stilk cellen-avledet neurons. Vi har observert at en utvidet protease inkubasjonstid ikke er helt nødvendig for replating kulturer fra små format plater (f. eks, 35 mm diameter); men som vi viser her, gir det en betydelig fordel når replating fra stor diameter plater (f. eks, 10 cm diameter eller større), sannsynligvis fordi neurites i slike plater kan forlenge svært lange prosesser og danner et tett sammenvevd array.
Her demonstrerer vi denne metoden og illustrerer kort dens anvendelse i analyser for tidlig neuritogenesis og for synapse modning, som innebærer gruppering av pre-og postsynaptic proteiner langs dendrites og axons, etterfulgt av deres senere colocalization på Synaptic nettsteder. Eksemplene fremhever fordelene denne protokollen tilbyr for å bevare celle levedyktighet og reproduserbarhet. For det første tillater etterforskerne å studere tidlige skritt i menneskets neuritogenesis. Det eksperimentelle innfatning er analog med det vanligvis anvendt primære kulturen av gnager kortikale eller hippocampus neurons, der hvor celler er utdraget fra sen Foster eller tidlig postnatal hjerne, dissosiert av trituration etter mild protease handling, og innrømmet å initiere neurites eller regenerere neurites som var kuttet i prosedyren9,10. I likhet med slike gnager primære neurons, hiPSC-avledet neurons begynner å danne eller regenerere sine neurites innen timer etter replating, slik at bildebehandling av vekst kjegler og neurite morfologi i et miljø optimal for høy spatiotemporal Imaging med færre omkringliggende udifferensierte celler. Vi har observert at neurite utvekst er mer synkronisert i forhold til variable forsinkelser og ulike utvekst rater sett når neurons første begynner å skille fra en stamfar befolkning. I tillegg replating muliggjør analyser av neurons uttrykke neuronal under type markører som vanligvis vises senere i neural utvikling, for eksempel kortikale lag 5/6 transkripsjon faktor CTIP2 (Chicken ovalbumin oppstrøms promoter transkripsjon faktor-samspill protein 2), eller Pan-neuronal markør NeuN11. En særlig nyttig ansiktstrekk av det replating adgang er det alt synaptogenesis utbytte innen en tid rammen forenlig med HCS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1076px;" width="1076">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Post Replating Media</td>
			<td style="width:276px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:377px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dibutyryl-cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>Add 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human BDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">450-02</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td>Add 20 ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DMEM/F12 with Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>31331093</td>
			<td>Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human GDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 100 &#181;l to 50 mL N2B27</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11140035</td>
			<td>Add 5ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">N2 (100X) Supplement</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Add 5ml to 500mL media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal A Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>for WT126 cells; neural basal media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SM1 Supplement</td>
			<td style="width:276px;">StemCell Technologies</td>
			<td>5711</td>
			<td>Add 1:50 to media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>25080-094</td>
			<td>Add 10ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Plate Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10cm Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08772-E</td>
			<td>Plastic TC-treated dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">6-well Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Thomas Scientific</td>
			<td>1194Y80</td>
			<td>NEST plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Add 1:400 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-Ornithine</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 1:1000 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td>To dilute Poly-L-Ornithine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Replating Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">100mM Cell Strainer</td>
			<td style="width:276px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431752</td>
			<td>Sterile, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">384-well plate, uncoated</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6007550</td>
			<td>Coat with PLO and Laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DPBS</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190144</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6057500</td>
			<td>Rinse before coating with laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fixation Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F79-1</td>
			<td>Dissolved in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sucrose</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S5-12</td>
			<td>0.8 g per 10 ml of fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Immunostaining Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11041</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21449</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 561 Goat anti-rat</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11077</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DAPI</td>
			<td style="width:276px;">Biotium</td>
			<td>40043</td>
			<td>visualizes DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1)</td>
			<td style="width:276px;">Neuromics</td>
			<td>MO15013</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rat antibody against CTIP2</td>
			<td style="width:276px;">Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>layer 5/6 cortical neurons</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">LifeSpan Biosciences</td>
			<td>LS-B290</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against NeuN</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>ABN91</td>
			<td>late stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">Shelley Halpain</td>
			<td>N/A</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against PSD-95</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P-246</td>
			<td>post-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against Synapsin 1</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>AB1543</td>
			<td>pre-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:276px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30574.02</td>
			<td>10% in PBS for blocking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Titon X-100</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9002931</td>
			<td>Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Viability Markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Vivafix 649/660</td>
			<td style="width:276px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">135-1118</td>
			<td>cell death marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Calcium Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:276px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE</td>
			<td>THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>calcium reporter in a viral delivery system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">hiPSC-derived NPCs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">WT 126 (Y2610)</td>
			<td style="width:276px;">Gage lab</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Marchetto et al., 2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">CVB WT24</td>
			<td style="width:276px;">Yeo and Goldstein labs</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>unpublished</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation

Neurons differensiert i to-dimensjonal kultur fra menneskelige pluripotent stilk-cellen-avledet nevrale stamceller (NPCer) representerer en kraftig modell system for å utforske sykdoms mekanismer og utføre høyt innhold screening (HCS) å forhøre sammensatte biblioteker eller identifisere genmutasjon fenotyper. Men med menneskelige celler overgangen fra NPC til funksjonell, krever eldre Nevron flere uker. Synapser vanligvis begynner å danne etter 3 uker med differensiering i monolag kultur, og flere Nevron-spesifikke proteiner, for eksempel senere uttrykker Pan-neuronal markør NeuN, eller laget 5/6 cerebral kortikale Nevron markør CTIP2, begynner å uttrykke rundt 4-5 uker etter differensiering. Denne lange differensiering tid kan være uforenlig med optimal kultur forhold som brukes for små volum, multi-brønn HCS plattformer. Blant de mange utfordringene er behovet for godt overholdt, jevnt fordelt celler med minimal celle Clustering, og kultur prosedyrer som fremmer langsiktig levedyktighet og funksjonell synapse modning. En tilnærming er å skille neurons i et stort volum format, så replate dem på et senere tidspunkt i HCS-kompatible multi-brønner. Noen viktige utfordringer når du bruker denne replating tilnærmingen bekymring reproduserbarhet og celle levedyktighet, på grunn av stressende avbrudd i dendrittiske og axonal nettverk. Her viser vi en detaljert og pålitelig prosedyre for enzymatisk blanding humant indusert pluripotent stilk cellen (hiPSC)-avledet neurons etter deres differensiering for 4-8 uker i et stort volum format, overføre dem til 384-vel mikrotiterbrønnene plater, og dyrking dem for ytterligere 1-3 uker med utmerket celle overlevelse. Denne replating av menneskelige neurons ikke bare tillater studiet av synapse montering og modning innen to uker fra replating, men også muliggjør studier av neurite regenerering og vekst membran egenskaper. Vi gir eksempler på skalerbare analyser for neuritogenesis og synaptogenesis ved bruk av en 384-brønn plattform.

Replating av hiPSCs-avledede neurons som har vært differensiert i flere uker tilbyr flere fordeler. Men frakobling og replating differensiert neurons som har lange, sammenhengende dendrites og axons (figur 1A) kan resultere i en høy brøkdel av irreversibelt skadet neurons.
Som beskrevet i protokollen delen, brukte vi inkubasjons med et proteolytiske enzym for å løsne neurons fra underlaget. Vanligvis, på grunn av deres tykke meshwork av neur...

Watch this Scientific Journal Video about Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation at JoVE.com

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Denne protokollen beskriver en detaljert prosedyre for blanding og dyrking menneskelige stilk cellen avledet neurons som tidligere var differensiert fra neural forfedre in vitro for flere uker. Prosedyren forenkler Imaging-baserte analyser av neurites, synapser, og sen-uttrykker neuronal markører i et format som er kompatibelt med lys mikroskopi og høyt innhold screening.

Post-differensiering Replating av Human pluripotent Stem Cell-avledet neurons for High-Content screening av Neuritogenesis og synapse modning

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Denne protokollen forenkler bruk av menneskelige pluripotente stamcelleavledede nevroner for høyinnholdsscreeningsprogrammer. Det er spesielt godt egnet for analyse synapser, som i menneskelige nevroner krever lange kulturperioder. Vi demonstrerer replating av nevroner fra store format retter til HCS-kompatible multi brønner på en måte som bevarer deres levedyktighet.Motintuitivt viser vi at å utvide proteaseinkubasjonen før resuspending og replating gir bedre nevronal overlevelse. Humane pluripotente stamcelleavledede nevroner blir stadig mer relevante innen grunnleggende forskning, legemiddelutvikling og degenerativ medisin. Denne milde titreringsmetoden kan brukes til å gjenbruke ethvert stort monolag av celler som har et tykt nettverk av prosesser.I tillegg til menneskelige iPSCer, kan den brukes til å omplatee kultur av primære nevroner eller å gjenbruke dem for faktasortering eller enkeltcellesekvensering. Det er viktig å følge protokollene trinnene nøye og ofte overvåke protease mediert løsrivelse av nevronene fra platen. Den optimale inkubasjonstiden kan variere, avhengig av kulturen.Visuell demonstrasjon gjør det mulig for selv uerfarne etterforskere å reprodusere denne prosedyren. Start med å skylle platen av differensierte nevroner med PBS forsiktig. Spre PBS ned veggen av platen og ikke direkte på cellene for å unngå å forstyrre dem.Aspirer PBS fra kanten av parabolen mens du tipser den, og ikke rør cellene. Påfør minst en milliliter proteolytisk enzym per 10-centimeter plate. Og returner cellene til inkubatoren i 40 til 45 minutter.Under inkubasjonen, sjekk nevroner på et faset kontrastmikroskop og fortsett proteasebehandlingen til det nevrale nettverket løsner helt fra platen og begynner å bryte fra hverandre. Når nevronene har løsnet, stopp fordøyelsen ved å legge til fem milliliter friske DEMEM-medier for hver eneste milliliter protease. Bruk en serologisk pipette til å forsiktig titrere cellene mot platen fem til åtte ganger, og sørg for å ikke bruke for mye trykk.Sil cellene gjennom et 100 mikrometernett inn i et 50 milliliter konisk rør, dråpe for dråpe. Og skyll silen med ytterligere fem milliliter friske DMEM-medier. Bruk en sentrifuge på benken til å spinne cellene ned ved 1000 ganger G i fem minutter.Etter sentrifugering, returner det koniske røret til biosikkerhetsskapet og aspirerer det meste av media, slik at 250 mikroliter holder cellene fuktige. Forsiktig resuspend cellene i to milliliter av friske DMEM media deretter passere dem gjennom slutten av en fem milliliter serologisk pipette. Til slutt, inverter røret to til tre ganger.Bruk et hemocytometer og tripan blå for å telle levedyktige celler. Og så DMEM til ønsket konsentrasjon. Legg til passende kosttilskudd til røret, avhengig av kravene til den spesifikke cellelinjen og bland forsiktig cellene ved å vippe det koniske røret to til tre ganger.Aspirer lamininbelegg fra en 24-brønns plate og skyll det en gang med PBS. Aspirer PBS. Og bruk celleløsning på hver brønn i en figur åtte bevegelse for å unngå klumping.Når du er ferdig med å plating cellene, returnere platen til inkubatoren satt til 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Kort virvel lagerløsningen til den tidlige celledødsreporteren og legg den til brønnene i henhold til manuskriptets retninger. Vent i 20 minutter.Og så bilde levende og døde celler på glass bunn multi brønner. Forlengelse av protease inkubasjonen gjør det mulig å løsne det nevronale nettverket i det løftede cellearket. Dette resulterer i redusert celledød på tidspunktet for dissosiasjon, samt resulterer i mer effektiv utvinning i løpet av de følgende dagene.Ved hjelp av den utvidede inkubasjonsprosedyren viser kulturene en omtrentlig dobling av celle levedyktighet i løpet av dagene etter replating og en lavere tetthet av døde eller døende celler. Overgangsfasen av nevronal differensiering finner sted over flere dager, hvor cellene gradvis uttrykker sene nevronale markører. Disse markørene oppdages umiddelbart i kulturer som ble replated etter fire uker med pre-differensiering.Den utvidede proteaseprotokollen forbedrer også moderat neuride utvekst. Både total neuridlengde og dendrittvekst er forbedret. Replating er også nyttig for å studere synapser.Bare en uke etter replating ble markører for pre-og post-synaptiske proteiner observert. Videre er elektrisk aktivitet fra spontan depolarisering og synaptisk drevne strømmer påviselig ved hjelp av kalsiumavbildning eller multielekrodarrayer. Denne omplating prosedyren kan tilpasses mange typer applikasjoner.I tillegg til screening av høyt innhold for å identifisere potensielle terapeutiske forbindelser, kan den brukes til bildevekstkoner eller multielektrodarrayopptak. Mekanisk dissosiasjon av nevroner som allerede har dannet lange prosesser er stressende. Langstrakt enzymatisk inkubasjon og mild titrering av celler er viktige skritt for å lykkes med denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Utledning av Human nevrale stamceller og nevroner fra pluripotent humane embryonale stamceller med lite molekyl Induksjon

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Spesifikasjonen av Telencephalic glutamatergic Neurons fra menneskelige pluripotente stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika virusinfeksjon på utvikle menneskelige hjerne In Vitro bruke stilk cellen avledet Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Analysen utvikling for høy innhold kvantifisering av Sod1 Mutant Protein samlet formasjon i levende celler

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Metode for høyhastighets strekk skade av menneskelige indusert Pluripotent Stamcelle-avledet Neurons i 96-brønnen Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Compartmentalization av Human Stem Cell-avledet neurons innen pre-monterte plast Mikrovæskebasert chips

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Konvertering av Human indusert pluripotent Stem Cells (iPSCs) i funksjonell spinal og skallen motor neurons bruke PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migrasjon, kjemo-attraksjon og co-kultur analyser for menneskelige stamcelle-avledet endotelceller og GABAergic Nevroner

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analysere mitokondrietransport og morfologi i humant indusert pluripotente stamcelleavledede nevroner i arvelig spastisk paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Generering av humane nevroner og oligodendrocytter fra pluripotente stamceller for modellering av neuron-oligodendrococyttinteraksjoner

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...