Name: post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation
Uploaded: 2019-08-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation at JoVE.com

Este trabalho é um componente dos grupos nacionais cooperativos reprogramados da pesquisa da pilha (NCRCRG) para estudar a doença mental e foi apoiado pela concessão de NIH U19MH1 2015-0644. O trabalho inicial também foi apoiado pelo NIH Grant NS070297. Agradecemos aos Drs. Carol Marchetto e Fred Gage, o Instituto Salk, por fornecer a linha WT 126 de células progenitoras neurais, e DRS. Eugene Yeo e Lawrence Goldstein, UC San Diego para fornecer a linha CVB WT24 de células progenitoras neurais. Agradecemos a Deborah pre no laboratório do Dr. Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, para discussões úteis.

1. período de diferenciação antes de responder
<ol><li>Diferencie os neurônios em pratos de 10 cm, usando um protocolo de escolha7,8até que os neurônios formaram uma rede espessa com seus processos e expressam não apenas marcadores neuronais precoces, como map2 ou TuJ1, mas também marcadores tardios, como Neun.</li>
	<li>
Mude metade do meio de escolha a cada 4 dias durante o processo de diferenciação neuronal. Nota: mudanças méd...

<ol>
	<li>Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+pitfalls+of+stem+cell+differentiation:+a+guide+to+improving+protocols+for+neurodegenerative+disease+models+and+research.">Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).</li><li>Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD.">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).</li><li>Amin, N. D., Pa&#351;ca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+Models+of+Brain+Disorders+with+Three-Dimensional+Organoids.">Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids.</a> Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).</li><li>Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Passaging+Cells.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cancer Cell Culture. , (2010).</li><li>Picot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. 107, (2005).</li><li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+neuronal+cell+culture.">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).</li><li>Calabrese, B., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+the+PKC+target+MARCKS+in+maintaining+dendritic+spine+morphology.">Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology.</a> Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).</li><li>Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuN,+a+neuronal+specific+nuclear+protein+in+vertebrates.">NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates.</a> Development. 116 (1), 201-211 (1992).</li><li>Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+shrinkage+and+growth+involve+downregulation+of+cofilin+via+distinct+mechanisms.">Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms.</a> PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+Dorsal+Spinal+Sensory+Interneurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).</li><li>Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+induction+of+dorsal,+intermediate+and+ventral+spinal+cord+tissues+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Playne, R., Jones, K., Connor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dopamine+neuronal-like+cells+from+induced+neural+precursors+derived+from+adult+human+cells+by+non-viral+expression+of+lineage+factors.">Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors.</a> Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).</li><li>Rao, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustrating+the+potency+of+current+Good+Manufacturing+Practice-compliant+induced+pluripotent+stem+cell+lines+as+a+source+of+multiple+cell+lineages+using+standardized+protocols.">Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols.</a> Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).</li><li>Suga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+hypothalamic+and+pituitary+cells.">Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells.</a> Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).</li><li>Endaya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+dividing+neural+and+brain+tumour+cells+for+gene+expression+profiling.">Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).</li><li>Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+activated+cell+sorting+(FACS):+a+rapid+and+reliable+method+to+estimate+the+number+of+neurons+in+a+mixed+population.">Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population.</a> Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).</li><li>Frega, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Neuronal+Differentiation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Measuring+Network+Activity+on+Micro-electrode+Arrays.">Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).</li><li>Grainger, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+for+Seizure-Liability+Testing+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).</li><li>Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+of+primary+neurons:+ready+for+prime+time.">High-content screening of primary neurons: ready for prime time.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).</li></ol>

Nós demonstramos um procedimento reto para a ressuscita e a resposta de culturas neuronal humanas que aperfeiçoa a viabilidade, o sucesso da diferenciação, e a imagem latente subcellular em uma maneira que seja compatível com as plataformas elevadas da seleção satisfeita, e outros ensaios relevantes para a descoberta de fármacos. A Figura 6 ilustra o fluxo de trabalho geral e exemplos de tais aplicativos.
Embora aqui nós nos concentramos em neurônios der...

Células-tronco pluripotentes humanas (hiPSC)-os neurônios derivados são cada vez mais relevantes nas áreas de pesquisa básica, desenvolvimento de fármacos e medicina regenerativa. Fluxos de trabalho e procedimentos para otimizar sua cultura e manutenção, e melhorar a eficiência da diferenciação em subtipos neuronais específicos, estão evoluindo rapidamente1,2. Para melhorar a utilidade e a relação custo-eficácia dos neurônios derivados de células-tronco humanas como sistemas modelo que permitem análises de alto conteúdo na descoberta de fármacos e na validação de alvos, é útil diminuir o tempo de cultivo necessário para gerar neurônios, mantendo a máxima robustez, reprodutibilidade e relevância do fenótipo. Embora as culturas organoid 3-dimensionais estejam conduzindo avanços na pesquisa do neurodesenvolvimento3, as culturas do monocamada 2-dimensional são especial compatíveis com as aplicações Imaging-based automatizadas devido a sua espessura mínima do tecido.
No entanto, a adaptação de métodos de triagem baseados em imagem para modelos de doença neurológica e neurodesenvolvimental humana enfrenta um grande desafio. O período prolongado sobre o qual o sistema nervoso humano amadurece in vivo necessita de tempo estendido na cultura para acomodar programas naturais de expressão gênica e alcançar a maturação neuronal.
Uma conseqüência prática do programa longo da diferenciação neuronal é que a manutenção de culturas monocamada hipsc-derivadas deve ser sustentada por muitas semanas para conseguir a maturidade adequada do sinapse. Durante esse tempo, os progenitores neurais que permanecem indiferenciados continuam a se dividir. Estes podem rapidamente overgrow a cultura e usurpar o índice nutriente exigido para manter neurônios células viáveis. A divisão vigorosamente de células progenitoras neurais (NPCs) também pode competir com neurônios para o substrato de crescimento. Isso pode tornar essas culturas sujeitas a problemas de má adesão, uma condição inadequada para ensaios baseados em imagem. Além disso, muitos investigadores acham que quanto menor o volume de cultura, maior a dificuldade em manter populações saudáveis de neurônios diferenciados tempo suficiente para observar os estágios tardios da diferenciação neuronal. Em outras palavras, os ensaios de maturação de sinapse usando abordagens de rastreamento de alto conteúdo (HCS) podem ser muito desafiadores para os neurônios derivados do ser humano.
Para contornar alguns desses problemas, foi utilizado um procedimento de ressuscito e replante de neurônios derivados de hiPSC previamente diferenciados. Em primeiro lugar, permite o estudo do crescimento do neurite (ou, mais precisamente, regeneração de neurite) em uma população de neurônios totalmente comprometidos. Em segundo lugar, a resposta de neurônios previamente diferenciados de um formato de grande volume (como placas de 10 cm ou maior), até formatos de volume pequeno (como placas de de microtitulação 96-ou 384-well compatíveis com HCS) permite uma redução significativa no tempo total de cultivo em a condição de pequeno volume. Isto facilita o estudo do conjunto e da maturação da sinapse sobre semanas subseqüentes in vitro.
No entanto, a resposta de neurônios maduros que já estabeleceram neuritos longos e uma complexa rede de conectividade apresenta vários desafios, um dos quais é a taxa às vezes alta e variável de morte celular. Aqui, nós descrevemos um procedimento de repique que resulte na sobrevivência e na reprodutibilidade excelentes da pilha. Comumente, os neurônios são expostos a enzimas proteolíticas para períodos curtos de incubação (tipicamente ~ 3-10 min), a fim de separar as células do substrato antes da trituração. Este breve tempo de proteólise é habitualmente utilizado para ressuscitar e de muitos tipos de células divisórias, incluindo células não-neuronais e progenitores indiferenciados4,5,6. No entanto, para neurônios diferenciados que carregam neuritos longos e interligados, é essencial não apenas separar as células do substrato, mas também interromper a rede dendrítica e axonal, a fim de isolar as células individuais, minimizando os danos. Na verdade, uma malha grossa de neurônios geralmente tende a se separar do substrato como uma única folha, em vez de células individuais. Se o cuidado não é tomado para afrouxar a rede grossa de neurites, os neurônios não somente tornam-se irreversivelmente danificados durante o trituration, mas muitos deles não conseguem passar através do filtro usado para remover os grupos, tendo por resultado o rendimento pobre da pilha. Abaixo descrevemos uma simples modificação em um procedimento de incubação de protease amplamente utilizado para contrariar essas dificuldades.
No protocolo descrito abaixo, os neurônios são incubados por 40-45 min com uma protease leve, como a enzima proteolítica (por exemplo, Accutase). Durante o primeiro 5-10 min após a adição da enzima, a rede neuronal levanta-se do substrato como uma folha. A incubação com a protease prossegue por um adicional de 30-40 min antes de prosseguir com trituração e filtração suaves. Este tempo extra da incubação ajuda a assegurar-se de que a digestão do material Relaxe a rede intercelular, assegurando desse modo que o trituration subseqüente produza uma suspensão de pilhas individuais. Este procedimento maximiza a uniformidade da distribuição da pilha em cima de repique ao minimizar a morte da pilha. Nós aplicamos com sucesso este método de repique às culturas neuronal hipsc-derivadas geradas por vários protocolos7,8 da diferenciação e das várias linhas de hipscs. O procedimento é nominalmente adequado para uso com a maioria ou todas as linhas de neurônios derivados de células-tronco. Observou-se que um tempo prolongado de incubação da protease não é absolutamente essencial para a resposta de culturas de placas de pequeno formato (por exemplo, 35 mm de diâmetro); Entretanto, como nós mostramos aqui, fornece um benefício significativo ao repique das placas do grande diâmetro (por exemplo, diâmetro de 10 cm ou maior), provavelmente porque os neuritos em tais placas podem estender processos muito longos e formar uma disposição densa interconectada.
Aqui nós demonstramos este método e ilustram momentaneamente sua aplicação nos ensaios para o neuritogênese adiantado e para a maturação do sinapse, que envolve o agrupamento de proteínas pre-e pós-sináptica ao longo dos dendritos e dos axônios, seguidos por seu mais atrasado colocalização em sítios sinápticos. Os exemplos destacam as vantagens que este protocolo oferece na preservação da viabilidade celular e reprodutibilidade. Primeiramente, permite que os investigadores estudem etapas adiantadas no neuritogenesis humano. O cenário experimental é semelhante às culturas primárias comumente usadas de neurônios corticais ou hipocampais de roedores, onde as células são extraídas do cérebro pós-natal fetal ou precoce, dissociada pela trituração após tratamento suave da protease, e permitiu Iniciar neuritos ou regenerar neuritos que foram cortados no procedimento9,10. Semelhante a tais neurônios primários de roedores, neurónios derivados de hiPSC começam a formar ou regenerar seus neuritos dentro de horas após a resposta, permitindo a imagem de cones de crescimento e morfologia neurite em um ambiente ideal para imagens de alta espaciotemporal com menos células não diferenciadas circundantes. Nós observamos que o conseqüência do neurite é mais sincronizado comparado aos atrasos variáveis e às taxas diferentes do conseqüência consideradas quando os neurônios começam primeiramente a diferenciar-se de uma população do progenitor. Além disso, a resposta permite ensaios de neurônios expressando marcadores de subtipo neuronal que tipicamente aparecem mais tarde no desenvolvimento neural, como a camada cortical 5/6 fator de transcrição CTIP2 (frango ovalbumina transcrição promotor upstream fator-interagindo proteína 2), ou o marcador Pan-neuronal NeuN11. Uma característica especialmente útil da abordagem de resposta é que o sinaptogênese prossegue dentro de um período de tempo compatível com HCS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1076px;" width="1076">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Post Replating Media</td>
			<td style="width:276px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:377px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dibutyryl-cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>Add 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human BDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">450-02</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td>Add 20 ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DMEM/F12 with Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>31331093</td>
			<td>Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human GDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 100 &#181;l to 50 mL N2B27</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11140035</td>
			<td>Add 5ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">N2 (100X) Supplement</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Add 5ml to 500mL media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal A Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>for WT126 cells; neural basal media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SM1 Supplement</td>
			<td style="width:276px;">StemCell Technologies</td>
			<td>5711</td>
			<td>Add 1:50 to media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>25080-094</td>
			<td>Add 10ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Plate Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10cm Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08772-E</td>
			<td>Plastic TC-treated dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">6-well Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Thomas Scientific</td>
			<td>1194Y80</td>
			<td>NEST plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Add 1:400 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-Ornithine</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 1:1000 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td>To dilute Poly-L-Ornithine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Replating Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">100mM Cell Strainer</td>
			<td style="width:276px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431752</td>
			<td>Sterile, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">384-well plate, uncoated</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6007550</td>
			<td>Coat with PLO and Laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DPBS</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190144</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6057500</td>
			<td>Rinse before coating with laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fixation Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F79-1</td>
			<td>Dissolved in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sucrose</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S5-12</td>
			<td>0.8 g per 10 ml of fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Immunostaining Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11041</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21449</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 561 Goat anti-rat</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11077</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DAPI</td>
			<td style="width:276px;">Biotium</td>
			<td>40043</td>
			<td>visualizes DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1)</td>
			<td style="width:276px;">Neuromics</td>
			<td>MO15013</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rat antibody against CTIP2</td>
			<td style="width:276px;">Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>layer 5/6 cortical neurons</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">LifeSpan Biosciences</td>
			<td>LS-B290</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against NeuN</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>ABN91</td>
			<td>late stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">Shelley Halpain</td>
			<td>N/A</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against PSD-95</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P-246</td>
			<td>post-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against Synapsin 1</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>AB1543</td>
			<td>pre-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:276px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30574.02</td>
			<td>10% in PBS for blocking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Titon X-100</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9002931</td>
			<td>Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Viability Markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Vivafix 649/660</td>
			<td style="width:276px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">135-1118</td>
			<td>cell death marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Calcium Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:276px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE</td>
			<td>THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>calcium reporter in a viral delivery system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">hiPSC-derived NPCs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">WT 126 (Y2610)</td>
			<td style="width:276px;">Gage lab</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Marchetto et al., 2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">CVB WT24</td>
			<td style="width:276px;">Yeo and Goldstein labs</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>unpublished</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation

Os neurônios diferenciados na cultura bidimensional das células progenitoras neurais pluripotentes humanas (NPCs) representam um poderoso sistema modelo para explorar os mecanismos de doença e realizar a triagem de alto conteúdo (HCS) para interrogar o composto bibliotecas ou identificar fenótipos de mutação genética. Entretanto, com as pilhas humanas a transição do NPC ao neurônio funcional, maduro exige diversas semanas. As sinapses normalmente começam a se formar após 3 semanas de diferenciação na cultura monocamada, e várias proteínas neuronais específicas, por exemplo, o marcador Pan-neuronal mais tarde expressando Neun, ou a camada 5/6 neurônio cortical cerebral marcador CTIP2, começam a expressar cerca de 4-5 semanas após a diferenciação. Este tempo longo da diferenciação pode ser incompatível com as condições ideais da cultura usadas para o volume pequeno, plataformas multi-well do HCS. Entre os muitos desafios estão a necessidade de células bem aderidas e uniformemente distribuídas com o mínimo de aglomeração celular e procedimentos de cultura que promovem a viabilidade a longo prazo e a maturação funcional da sinapse. Uma abordagem é diferenciar os neurônios em um formato de grande volume, em seguida, mas-los em um ponto de tempo posterior em HCS-compatível com vários poços. Alguns dos principais desafios ao usar essa abordagem de resposta referem-se à reprodutibilidade e viabilidade celular, devido ao rompimento estressante da rede dendrítica e axonal. Aqui nós demonstramos um procedimento detalhado e de confiança para a célula de haste pluripotente induzida enzimaticamente ressuscitem os neurônios (hipsc)-derivado humanos após sua diferenciação por 4-8 semanas em um formato Large-volume, transferindo os ao de microtitulação 384-well placas, e cultivando-os para umas 1-3 semanas mais adicionais com sobrevivência excelente da pilha. Esta resposta de neurônios humanos não só permite o estudo do conjunto de sinapse e maturação dentro de duas semanas de repique, mas também permite estudos de regeneração neurite e características do cone de crescimento. Nós fornecemos exemplos de ensaios escalonáveis para neuritogênese e sinaptogênese usando uma plataforma 384-well.

A resposta de neurônios derivados de hiPSCs que foram diferenciadas por várias semanas oferece várias vantagens. No entanto, a desanexação e A resposta de neurônios diferenciados que têm dendritos e axônios longos e interligados (Figura 1a) podem resultar em uma fração alta de neurônios irreversivelmente danificados.
Como descrito na seção do protocolo, nós usamos a incubação com uma enzima proteolíticas para separar os neurônios...

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Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Este protocolo descreve um procedimento detalhado para ressusciar e cultivar os neurônios derivados humanos da pilha de haste que foram diferenciados previamente dos progenitores neural in vitro por semanas múltiplas. O procedimento facilita os ensaios com base em imagens de neuritos, sinapses e marcadores neuronais de expressão tardia em um formato compatível com microscopia de luz e triagem de alto conteúdo.

Resposta pós-diferenciação de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas para triagem de alto conteúdo de Neuritogênese e maturação de sinapse

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Este protocolo facilita o uso de neurônios pluripotentes humanos derivados de células-tronco para aplicações de triagem de alto conteúdo. É particularmente adequado para avaliar sinapses, que em neurônios humanos requerem longos períodos de cultura. Demonstramos a replação de neurônios de pratos de grande formato em multi-poços compatíveis com HCS de forma a preservar sua viabilidade.Contra-intuitivamente, mostramos que estender a incubação de protease antes de resuscupar e replacar produz melhor sobrevida neuronal. Os neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanos são cada vez mais relevantes nas áreas de pesquisa básica, desenvolvimento de medicamentos e medicina degenerativa. Este método de titulação suave pode ser usado para resuspensar qualquer grande mono-camada de células com uma rede espessa de processos.Além dos iPSCs humanos, ele pode ser usado para repelar a cultura dos neurônios primários ou para resuspensá-los para classificação de fato ou sequenciamento de células únicas. É importante seguir os protocolos com cuidado e frequência monitorar o destacamento mediado protease dos neurônios da placa. O tempo ideal de incubação pode variar, dependendo da cultura.A demonstração visual permite que até mesmo investigadores inexperientes reproduzam esse procedimento. Comece enxaguando suavemente a placa de neurônios diferenciados com PBS. Disperse o PBS pela parede da placa e não diretamente nas células para evitar interrompê-los.Aspire o PBS da borda do prato enquanto o derruba, tomando cuidado para não tocar nas células. Aplique pelo menos um mililitro de enzima proteolítica por placa de 10 centímetros. E devolva as células à incubadora por 40 a 45 minutos.Durante a incubação, verifique os neurônios em um microscópio de contraste em fases e continue o tratamento de protease até que a rede neural se desprende completamente da placa e comece a se quebrar. Quando os neurônios se separarem, parem a digestão adicionando cinco mililitros de mídia DEMEM fresca para cada mililitro de protease. Use uma pipeta sorológica para titular suavemente as células contra a placa cinco a oito vezes, certificando-se de não aplicar muita pressão.Coe as células através de uma malha de 100 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros, gota a gota. E enxágue o coador com mais cinco mililitros de mídia DMEM fresca. Use uma centrífuga de bancada para girar as células a 1000 vezes G durante cinco minutos.Após a centrifugação, devolva o tubo cônico ao armário de biossegurança e aspire a maior parte da mídia, deixando 250 microliters para manter as células úmidas. Levemente resuspenque as células em dois mililitros de mídia DMEM fresca e passe-as através do final de uma pipeta sorológica de cinco mililitros. Finalmente, inverta o tubo duas a três vezes.Use um hemótmetro e azul tripano para contar as células viáveis. E então DMEM para a concentração desejada. Adicione suplementos apropriados ao tubo, dependendo dos requisitos da linha celular específica e misture suavemente as células inclinando o tubo cônico duas a três vezes.Aspirar revestimento de laminina a partir de uma placa de 24 poços e enxágüe-o uma vez com PBS. Aspire a PBS. E aplique solução celular a cada poço em um movimento de figura oito para evitar a aglomeração.Quando terminar de emplacar as células, devolva a placa à incubadora fixada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Brevemente vórtice a solução de estoque do repórter de morte celular precoce e adicioná-lo aos poços de acordo com as instruções do manuscrito. Espere 20 minutos.E então imagem as células vivas e mortas em vários poços de fundo de vidro. Prolongar a incubação protease permite o afrouxamento da rede neuronal dentro da folha levantada das células. Isso resulta em redução da morte celular no momento da dissociação, bem como resulta em uma recuperação mais eficiente nos dias seguintes.Usando o procedimento de incubação de enzimas estendida, as culturas exibem uma duplicação aproximada da viabilidade celular durante os dias após a replação e uma menor densidade de células mortas ou moribundas. A fase de transição da diferenciação neuronal ocorre ao longo de vários dias, durante a qual as células gradualmente expressam marcadores neuronais em estágio final. Esses marcadores são imediatamente detectados em culturas que foram repartidas após quatro semanas de pré-diferenciação.O protocolo de protease estendido também melhora moderadamente o crescimento do neuride. Tanto o comprimento total do neuride quanto o crescimento do dendrite são melhorados. Replaing também é útil para estudar sinapses.Apenas uma semana após a replação, foram observados marcadores para proteínas pré e pós-sináptica. Além disso, a atividade elétrica a partir da despolarização espontânea e correntes sináticas é detectável usando imagens de cálcio ou matrizes multieletrínos. Este procedimento de replação pode ser adaptado a muitos tipos de aplicações.Além da triagem de alto conteúdo para identificar potenciais compostos terapêuticos, ele poderia ser usado para cones de crescimento de imagens ou gravações de matriz multieletrística. A dissociação mecânica de neurônios que já formaram processos longos é estressante. A incubação enzimática alongada e a titulação suave das células são passos essenciais para o sucesso deste procedimento.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Neurociência

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

A especificação de telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células-tronco pluripotentes humanas

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelagem de infecção de vírus Zika do desenvolvimento cérebro humano In Vitro usando células-tronco derivadas de Organoids Cerebral

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Desenvolvimento de ensaio para quantificação de conteúdo elevado de Sod1 proteína mutante formação agregada em células vivas

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Método para alta velocidade lesão de estiramento de humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de neurônios em um formato de 96 poços

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Compartimentalização de neurônios derivados de células-tronco humanas dentro de chips de plástico Microfluídico pré-montados

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversão de pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) em neurônios de motor espinal e craniano funcionais usando vetores de PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migração, Quimio-Atração e Ensaios de Cocultura para Células Endoteliais derivadas de células-tronco humanas e neurônios gabaergicos

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analisando o Transporte Mitocondrial e a Morfologia em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em Paraplegia Espástica Hereditária

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Geração de neurônios humanos e oligodendrócitos a partir de células-tronco pluripotentes para modelagem de interações neurônio-oligodendrócitos

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...