Name: post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation
Uploaded: 2019-08-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation at JoVE.com

Эта работа является составной частью Национальной кооперативной перепрограммированной группы по исследованию ячеек (NCRCRG) для изучения психических заболеваний и была поддержана грантом NIH U19MH1 2015-0644. Первоначальная работа также была поддержана грантом NIH NS070297. Мы благодарим доктора Кэрол Маркетто и Фред Гейдж, Институт Салка, за предоставление линии WT 126 нейронных клеток-прародителей, и доктора Евгений Ео и Лоуренс Гольдштейн, Калифорнийский университет в Сан-Диего за предоставление CVB WT24 линии нейронных клеток-прародителей. Мы благодарим Дебора Pre в лаборатории д-р Энн Банг, Сэнфорд Бернхэм Пребис медицинских открытий института, для полезных дискуссий.

1. Период дифференциации до переплатывания
<ol><li>Дифференцируйте нейроны на 10 см блюд, используя протокол выбора7,8, пока нейроны сформировали толстую сеть с их процессами и выразить не только ранние нейронные маркеры, такие как MAP2 или TuJ1, но и поздние марк?...

<ol>
	<li>Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+pitfalls+of+stem+cell+differentiation:+a+guide+to+improving+protocols+for+neurodegenerative+disease+models+and+research.">Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).</li><li>Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD.">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).</li><li>Amin, N. D., Pa&#351;ca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+Models+of+Brain+Disorders+with+Three-Dimensional+Organoids.">Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids.</a> Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).</li><li>Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Passaging+Cells.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cancer Cell Culture. , (2010).</li><li>Picot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. 107, (2005).</li><li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+neuronal+cell+culture.">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).</li><li>Calabrese, B., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+the+PKC+target+MARCKS+in+maintaining+dendritic+spine+morphology.">Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology.</a> Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).</li><li>Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuN,+a+neuronal+specific+nuclear+protein+in+vertebrates.">NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates.</a> Development. 116 (1), 201-211 (1992).</li><li>Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+shrinkage+and+growth+involve+downregulation+of+cofilin+via+distinct+mechanisms.">Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms.</a> PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+Dorsal+Spinal+Sensory+Interneurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).</li><li>Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+induction+of+dorsal,+intermediate+and+ventral+spinal+cord+tissues+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Playne, R., Jones, K., Connor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dopamine+neuronal-like+cells+from+induced+neural+precursors+derived+from+adult+human+cells+by+non-viral+expression+of+lineage+factors.">Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors.</a> Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).</li><li>Rao, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustrating+the+potency+of+current+Good+Manufacturing+Practice-compliant+induced+pluripotent+stem+cell+lines+as+a+source+of+multiple+cell+lineages+using+standardized+protocols.">Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols.</a> Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).</li><li>Suga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+hypothalamic+and+pituitary+cells.">Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells.</a> Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).</li><li>Endaya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+dividing+neural+and+brain+tumour+cells+for+gene+expression+profiling.">Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).</li><li>Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+activated+cell+sorting+(FACS):+a+rapid+and+reliable+method+to+estimate+the+number+of+neurons+in+a+mixed+population.">Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population.</a> Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).</li><li>Frega, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Neuronal+Differentiation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Measuring+Network+Activity+on+Micro-electrode+Arrays.">Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).</li><li>Grainger, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+for+Seizure-Liability+Testing+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).</li><li>Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+of+primary+neurons:+ready+for+prime+time.">High-content screening of primary neurons: ready for prime time.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).</li></ol>

Мы продемонстрировали прямолинейную процедуру повторного и повторного обновления нейронных культур человека, которая оптимизирует жизнеспособность, успех дифференциации и субклеточную визуализацию таким образом, что она совместима с платформами скрининга с высоким содержанием, и ?...

Нейроны, полученные из стволовых клеток человека (hiPSC), становятся все более актуальными в области фундаментальных исследований, разработки лекарственных средств и регенеративной медицины. Рабочие процессы и процедуры для оптимизации их культуры и обслуживания, а также повышения эффективности дифференциации в конкретные нейрональные подтипы, быстро развиваются1,2. Для повышения полезности и рентабельности нейронов, полученных из стволовых клеток человека, в качестве модельных систем, поддающихся анализу высокого содержания при обнаружении лекарственных средств и проверке целей, полезно уменьшить время культивирования, необходимое для создания зрелых, функциональных нейронов, сохраняя при этом максимальную прочность, воспроизводимость и релевантность фенотипа. Хотя трехмерные органоидные культуры являются движущей прорывв в исследовании нейроразвития3, 2-мерные монослойные культуры особенно совместимы с автоматизированными приложениями на основе изображений из-за их минимальной толщины тканей.
Однако адаптация методов скрининга на основе изображений к моделям неврологических и нейроразвития человека сталкивается с серьезной проблемой. Затяжные временные рамки, в течение которых нервная система человека созревает in vivo, требуют длительного времени в культуре для размещения естественных программ экспрессии генов и достижения нейронального созревания.
Одним из практических последствий длительной программы дифференциации нейронов является то, что поддержание hiPSC полученных монослойных культур должны быть устойчивыми в течение многих недель для достижения адекватной зрелости синапса. В течение этого времени, нейронные прародители, которые остаются недифференцированными продолжают делиться. Они могут быстро перерасти культуры и узурпировать содержание питательных веществ, необходимых для поддержания жизнеспособных постмитотических нейронов. Активно едить нервные клетки-прародители (NPC) также могут конкурировать с нейронами для роста субстрата. Это может сделать такие культуры подвержены проблемам плохой адгезии, состояние, неподходящее для анализов на основе изображений. Кроме того, многие исследователи считают, что чем меньше объем культуры, тем больше трудностей в поддержании здоровой популяции дифференцированных нейронов достаточно долго, чтобы наблюдать поздние стадии дифференциации нейронов. Другими словами, анализы созревания синапса с использованием подходов скрининга высокого содержания (HCS) могут быть очень сложными для нейронов, полученных человеком.
Чтобы обойти некоторые из этих проблем, была использована процедура повторного приостановки и повторного использования ранее дифференцированных нейронов, полученных от hiPSC. Во-первых, это позволяет изучать невритный рост (или, точнее, регенерацию неврита) в популяции полностью приверженных нейронов. Во-вторых, повторное переделывание ранее дифференцированных нейронов из большого формата громкости (например, 10 см пластин или больше), вплоть до небольших форматов громкости (например, HCS-совместимых 96- или 384-пузырчатого микротитерных пластин) позволяет значительно сократить общее время культивирования в небольшое состояние объема. Это облегчает изучение синапса сборки и созревания в течение последующих недель в пробирке.
Тем не менее, повторное переплетение зрелых нейронов, которые уже создали длинные невриты и сложную сеть подключения представляет собой несколько проблем, одна из которых иногда высокая и переменная скорость клеточной смерти. Здесь мы описываем процедуру повторного отреплирования, которая приводит к отличной выживаемости клеток и воспроизводимости. Как правило, нейроны подвергаются воздействию протеолитических ферментов в течение коротких инкубационных периодов (обычно 3-10 мин) для того, чтобы отделить клетки от субстрата до тритурации. Это краткое время протеолиза обычно используется для повторного приостановки и прохождения многих типов деления клеток, в том числе ненейрональных клеток и недифференцированных прародителей4,5,6. Однако для дифференцированных нейронов, несущих длинные, взаимосвязанные невриты, важно не только отделить клетки от субстрата, но и нарушить дендритную и аксональную сеть, чтобы изолировать отдельные клетки при минимизации повреждений. Действительно, толстая сетка нейронов обычно имеет тенденцию отделяться от субстрата как единый лист, а не как отдельные клетки. Если не принимать меры по ослаблению толстой сети нейритов, нейроны не только становятся необратимо поврежденными во время тритурации, но многие из них не проходят через фильтр, используемый для удаления комков, что приводит к плохой урожайности клеток. Ниже мы описываем простую модификацию широко используемой процедуры инкубации протеазы для борьбы с этими трудностями.
В описанном ниже протоколе нейроны инкубируются в течение 40-45 мин с легкой протеазой, например, протеолитическим ферментом (например, Accutase). В течение первых 5-10 минут после добавления фермента, нейронная сеть взлетает из субстрата в виде листа. Инкубация с протеаза продолжается еще 30-40 минут, прежде чем приступить к мягкой трикуляции и фильтрации. Это дополнительное время инкубации помогает гарантировать, что переваривание материала расслабляет межклеточной сети, тем самым гарантируя, что последующее тритурирование производит приостановление отдельных клеток. Эта процедура максимизирует единообразие распределения клеток при повторном окупаемости при минимизации клеточной смерти. Мы успешно применили этот метод повторного отправления к hiPSC полученных нейронных культур, порожденных различными протоколами дифференциации7,8 и из различных линий hiPSCs. Процедура номинально подходит для использования с большинством или всеми линиями стволовых клеток, полученных нейронов. Мы заметили, что продолжительное время инкубации протеазы не является абсолютно необходимым для перекалибровки культур из плит малого формата (например, диаметр 35 мм); однако, как мы показываем здесь, оно обеспечивает значительно преимущество от replating от плит большого диаметра (например, диаметр 10 сантиметров или большле), вероятно потому что neurites в таких плитах могут удлинить очень длинние процессы и сформировать плотно взаимосвязанный блок.
Здесь мы демонстрируем этот метод и кратко иллюстрируем его применение в анализах для раннего неуритогенеза и для созревания синапсов, который включает в себя кластеризацию до- и постсинаптических белков вдоль дендритов и аксонов, а затем их более поздние колокализация на синаптических сайтах. Примеры подчеркивают преимущества, которые дает этот протокол в сохранении жизнеспособности и воспроизводимости клеток. Во-первых, это позволяет следователям изучить ранние шаги в неуритогенез человека. Экспериментальная обстановка похожа на широко используемые первичные культуры корковых или гиппокампальных нейронов, где клетки извлекаются из позднего плода или раннего послеродового мозга, разобщены тритурой после мягкого лечения протеазы, и разрешено инициировать невриты или регенерировать невриты, которые были разорваны в процедуре9,10. Подобно таким первичным нейронам грызунов, нейроны, полученные из hiPSC, начинают формировать или регенерировать свои невриты в течение нескольких часов после повторного тестирования, что позволяет создавать конусы роста и морфологию нейритов в среде, оптимальной для высокой пространствентемпоральной визуализации с меньшим количеством окружающих недифференцированных клеток. Мы заметили, что неврит ный рост более синхронизирован по сравнению с переменной задержки и различные темпы роста видели, когда нейроны впервые начинают дифференцировать сяочку от популяции прародителей. Кроме того, переплатывание позволяет анализы нейронов, выражающих нейронные маркеры подтипа, которые обычно появляются позже в нервном развитии, такие как корковый слой 5/6 транскрипционный фактор CTIP2 (Куриный овальбумин вверх по течению промотор транскрипции взаимодействующий с фактором белок 2), или паннейрональный маркер NeuN11. Особенно полезной особенностью подхода replating является то, что синаптогенез протекает в сроки, совместимые с HCS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1076px;" width="1076">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Post Replating Media</td>
			<td style="width:276px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:377px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dibutyryl-cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>Add 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human BDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">450-02</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td>Add 20 ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DMEM/F12 with Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>31331093</td>
			<td>Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human GDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 100 &#181;l to 50 mL N2B27</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11140035</td>
			<td>Add 5ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">N2 (100X) Supplement</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Add 5ml to 500mL media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal A Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>for WT126 cells; neural basal media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SM1 Supplement</td>
			<td style="width:276px;">StemCell Technologies</td>
			<td>5711</td>
			<td>Add 1:50 to media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>25080-094</td>
			<td>Add 10ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Plate Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10cm Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08772-E</td>
			<td>Plastic TC-treated dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">6-well Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Thomas Scientific</td>
			<td>1194Y80</td>
			<td>NEST plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Add 1:400 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-Ornithine</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 1:1000 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td>To dilute Poly-L-Ornithine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Replating Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">100mM Cell Strainer</td>
			<td style="width:276px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431752</td>
			<td>Sterile, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">384-well plate, uncoated</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6007550</td>
			<td>Coat with PLO and Laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DPBS</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190144</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6057500</td>
			<td>Rinse before coating with laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fixation Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F79-1</td>
			<td>Dissolved in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sucrose</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S5-12</td>
			<td>0.8 g per 10 ml of fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Immunostaining Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11041</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21449</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 561 Goat anti-rat</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11077</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DAPI</td>
			<td style="width:276px;">Biotium</td>
			<td>40043</td>
			<td>visualizes DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1)</td>
			<td style="width:276px;">Neuromics</td>
			<td>MO15013</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rat antibody against CTIP2</td>
			<td style="width:276px;">Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>layer 5/6 cortical neurons</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">LifeSpan Biosciences</td>
			<td>LS-B290</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against NeuN</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>ABN91</td>
			<td>late stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">Shelley Halpain</td>
			<td>N/A</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against PSD-95</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P-246</td>
			<td>post-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against Synapsin 1</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>AB1543</td>
			<td>pre-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:276px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30574.02</td>
			<td>10% in PBS for blocking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Titon X-100</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9002931</td>
			<td>Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Viability Markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Vivafix 649/660</td>
			<td style="width:276px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">135-1118</td>
			<td>cell death marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Calcium Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:276px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE</td>
			<td>THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>calcium reporter in a viral delivery system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">hiPSC-derived NPCs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">WT 126 (Y2610)</td>
			<td style="width:276px;">Gage lab</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Marchetto et al., 2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">CVB WT24</td>
			<td style="width:276px;">Yeo and Goldstein labs</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>unpublished</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation

Нейроны, отличаемые в двухмерной культуре от человеческих плюрипотентных стволовых клеток, полученных нейронными клетками-прародителями (NPC), представляют собой мощную модельную систему для изучения механизмов заболевания и проведения скрининга высокого содержания (HCS) для допроса соединения библиотек или определить фенотипы генных мутаций. Однако, с человеческими клетками переход от NPC к функциональному, возмужалым нейрону требует нескольких неделей. Синапсы обычно начинают формироваться после 3 недель дифференциации в монослойной культуре, и несколько нейронных белков, например, более поздний экспресс-нейрональный маркер NeuN, или слой 5/6 церереального коркового нейронного маркера CTIP2, начинают выражать около 4-5 недель после дифференциации. Это длительное время дифференциации может быть несовместимо с оптимальными условиями культуры, используемыми для небольших, многофункциональных платформ HCS. К числу многих проблем относятся потребность в хорошо совмещенной, равномерно распределенной ячейке с минимальной кластеризацией клеток и культурных процедурах, способствующих долгосрочной жизнеспособности и функциональному созреванию синапсов. Один из подходов заключается в дифференцировании нейронов в формате большого объема, а затем перенабчить их на более позднем этапе в HCS-совместимых мультискважин. Некоторые основные проблемы при использовании этого реплатингового подхода касаются воспроизводимости и жизнеспособности клеток из-за стрессовых нарушений дендритной и аксональной сети. Здесь мы демонстрируем детальную и надежную процедуру ферментативной перезагрузки антропогенных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) полученных нейронов после их дифференциации в течение 4-8 недель в крупнообъемном формате, передавая их 384-колодствующим микротитеру пластины, и культивирование их в течение еще 1-3 недель с отличным выживанием клеток. Это replating человеческих нейронов не только позволяет изучение синапса сборки и созревания в течение двух недель с момента повторного, но и позволяет исследования регенерации нейрита и роста конуса характеристики. Мы приведомляем примеры масштабируемых анализов на неуритогенез и синаптогенез с помощью платформы 384 колодца.

Replating hiPSCs-производных нейронов, которые были дифференцированы в течение нескольких недель предлагает несколько преимуществ. Однако, отсоединение и повторное дифференцированное нейроны, которые имеют длинные, взаимосвязанные дендриты и аксоны(Рисунок 1А) може...

Watch this Scientific Journal Video about Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation at JoVE.com

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Этот протокол описывает детальную процедуру для resuspending и culturing людские нейроны stem клетки выведенные которые ранее были продифференцированы от нервных прародителей in vitro на множественные недели. Процедура облегчает анализы нейритов, синапсов и поздневых нейронных маркеров на основе изображений в формате, совместимом со световой микроскопией и скринингом с высоким содержанием.

Постдифференцирование Replating человека Плюрипотентные стволовые клетки полученных нейронов для высокого содержания скрининга неуритогенеза и синапсового созревания

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Этот протокол облегчает использование человека плюрипотентных стволовых клеток, полученных нейронов для применения скрининга высокого содержания. Он особенно хорошо подходит для анализа синапсов, которые в нейронах человека требуют длительных периодов культуры. Мы демонстрируем перебрасывания нейронов из большого формата блюд в HCS-совместимых нескольких скважин таким образом, чтобы сохранить их жизнеспособность.Контринтуитивно, мы показываем, что расширение инкубации протеазы до повторного перерасхода и replating дает улучшение выживания нейронов. Нейроны, полученные из стволовых клеток человека, становятся все более актуальными в области фундаментальных исследований, разработки лекарственных средств и дегенеративной медицины. Этот метод мягкого титроваения может быть использован для повторного использования любого большого монослоя клеток, имеющих толстую сеть процессов.В дополнение к человеческим iPSCs, он может быть использован для повторения культуры первичных нейронов или повторного использования их для сортировки фактов или секвенирования одной клетки. Важно внимательно следить за шагами протоколов и часто следить за протеазой опосредованного отслоения нейронов от пластины. Оптимальное время инкубации может варьироваться в зависимости от культуры.Визуальная демонстрация позволяет даже неопытным следователям воспроизвести эту процедуру. Начните с мягко полоскания пластины дифференцированных нейронов с PBS. Разогнать PBS вниз по стене пластины, а не непосредственно на клетки, чтобы избежать их нарушения.Аспирировать PBS от края блюда, опрокидывая его, заботясь, чтобы не коснуться клеток. Нанесите по крайней мере один миллилитр протеолитического фермента на 10-сантиметровую пластину. И вернуть клетки в инкубатор на 40-45 минут.Во время инкубации проверьте нейроны на фазовом контрастном микроскопе и продолжайте лечение протеазой до тех пор, пока нейронная сеть полностью не отсоединится от пластины и не начнет распадаться. Когда нейроны отсоединились, остановить пищеварение, добавив пять миллилитров свежих DEMEM средств массовой информации на каждый миллилитр протеазы. Используйте серологический пипетки, чтобы аккуратно титровать клетки против пластины пять-восемь раз, убедившись, что не применять слишком много давления.Процедить клетки через 100 микрометровую сетку в 50 миллилитров конической трубки, капля за каплей. И промыть ситечко с дополнительными пятью миллилитров свежих СРЕДСТВ массовой информации DMEM. Используйте центрифугу на скамейке, чтобы вращать клетки вниз на 1000 раз G в течение пяти минут.После центрифугации, вернуть коническую трубку в шкаф биобезопасности и аспирировать большинство средств массовой информации, в результате чего 250 микролитров держать клетки влажными. Аккуратно перерасходовать клетки в двух миллилитров свежих СРЕДСТВ массовой информации DMEM затем передать их через конец пяти миллилитров серологического пипетки. Наконец, инвертировать трубку два-три раза.Используйте гемоцитометр и трипан синий, чтобы подсчитать жизнеспособные клетки. А потом DMEM до нужной концентрации. Добавьте соответствующие добавки в трубку, в зависимости от требований конкретной клеточной линии и аккуратно смешайте клетки, наклонив коническую трубку два-три раза.Аспират ламинина покрытие из 24-хорошо пластины и промыть его один раз с PBS. Аспирировать PBS. И применить клеточное решение к каждой хорошо в рисунке восемь движения, чтобы избежать слипания.Когда закончите покрытие клеток, вернуть пластину в инкубатор установлен на 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. Кратко вихрь фондового решения ранней клеточной смерти репортера и добавить его в скважины в соответствии с рукописными направлениями. Подождите 20 минут.А затем изображение живых и мертвых клеток на стеклянном дне нескольких колодцев. Продление инкубации протеазы позволяет ослабить нейронную сеть в пределах поднятого листа клеток. Это приводит к снижению смертности клеток во время диссоциации, а также приводит к более эффективному восстановлению в течение следующих дней.Используя расширенную процедуру инкубации ферментов, культуры демонстрируют приблизительное удвоение жизнеспособности клеток в течение нескольких дней после повторного покрытия и более низкую плотность мертвых или умирающих клеток. Переходная фаза нейрональной дифференциации происходит в течение нескольких дней, в течение которых клетки постепенно выражают поздние нейронные маркеры. Эти маркеры сразу же обнаруживаются в культурах, которые были replated после четырех недель предварительной дифференциации.Расширенный протокол протеазы также умеренно повышает рост нейрида. Улучшается как общая длина нейрида, так и рост дендрита. Replating также полезен для изучения синапсов.Всего через неделю после повторного покрытия наблюдались маркеры до- и пост-синаптических белков. Кроме того, электрическая активность от спонтанной деполяризации и синаптически управляемых тока обнаруживается с помощью кальциевых изображений или многоэлектродных массивов. Эта процедура повторного покрытия может быть адаптирована к многим типам приложений.В дополнение к высокому содержанию скрининга для выявления потенциальных терапевтических соединений, он может быть использован для изображений конусов роста или многоэлектронные записи массива. Механическая диссоциация нейронов, которые уже сформировали длительные процессы, является стрессом. Удлиненная энзиматическая инкубация и нежное титрование клеток являются важными шагами для успеха этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Эффективное Вывод прав нейронов и нейронов прародителей из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Спецификация конечного мозга глутаматергической нейронов из стволовых клеток человека плюрипотентных

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Моделирования Зика вирус развивающегося мозга человека в пробирке с помощью стволовых клеток получены мозгового Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Развитие анализа высокое содержание количественной оценки совокупных формирования Sod1 Мутантный белок в живых клетках

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Метод для высокой скорости стретч травмы человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток нейронов в формате 96-луночных

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Сравнение стволовых клеток человека, полученных нейронов в предварительно собранных пластиковых микрофлюидных чипов

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Преобразование индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) в функциональные спинномозговых и черепных двигательных нейронов с помощью переносчиков

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Миграция, химиотерапия, и совместно-культурные анализы для стволовых клеток человека, полученных эндотелиальных клеток и ГАМК нейронов

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Анализ митохондриального транспорта и морфологии в антропогенных плюрипотентных стволовых клеток, полученных нейронов в наследственной спастической параплегии

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Генерация нейронов человека и олигодендроцитов из плюрипотентных стволовых клеток для моделирования нейронно-олигодендроцитарных взаимодействий

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...